Name: covalent binding of bmp-2 on surfaces using a self-assembled monolayer approach
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00
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Agradecemos ao Prof JP Spatz (Departamento de Química Biofísica, da Universidade de Heidelberg e do Departamento de Novos Materiais e Biosystems, do Instituto Max Planck para Sistemas Inteligentes, Stuttgart) por seu apoio gentil. O apoio financeiro do Max-Planck-Gesellschaft ea Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 a EAC-A.) São também reconheceu muito.

1. Síntese de 11-Mercaptoundecanoyl-N-hidroxissuccinimida (NHS-MU) <ol><li> Adicionar gota a gota uma solução de 500 mg de N-hidroxissuccinimida e 30 mg de 4 - (dimetilamino) piridina em 10 ml de acetona (aa) a 1 g de ácido 11-mercaptoundecanóico em 40 ml de diclorometano (aa), à temperatura ambiente (RT). </li><li> Arrefecer a reacção até 0 ° C e adicionar gota a gota 1,1 g de N, N &#39;-diciclohexilcarbodiimida em 10 ml de diclorometano (sob atmosfera de azoto). Manter a reacçã...

<ol>
	<li>Helm, G., Andersson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+statement:+Bone+morphogenetic+proteins:+Basic+science.">Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science.</a> Spine. 27 (16S), S9 (2002).</li><li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development.">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).</li><li>Reddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs:+from+bone+morphogenetic+proteins+to+body+morphogenetic+proteins.">BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).</li><li>Rengachary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+basic+concepts.">Bone morphogenetic proteins: basic concepts.</a> Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).</li><li>Schlunegger, M., Gru&#776;tter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+feature+revealed+by+the+crystal+structure+at+2.2+&#197;;+resolution+of+human+transforming+growth+factor-&#946;2.">An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 &#197;; resolution of human transforming growth factor-&#946;2.</a> Nature. 358, 430-434 (1992).</li><li>Scheufler, C., Sebald, W., Hu&#776;lsmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+bone+morphogenetic+protein-2+at+2.7+&#197;+resolution.">Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 &#197; resolution.</a> J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).</li><li>Nimni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polypeptide+growth+factors:+targeted+delivery+systems.">Polypeptide growth factors: targeted delivery systems.</a> Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).</li><li>Wozney, J., Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein+and+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+bone+formation+and+repair.">Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair.</a> Clin. Orthop. 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Biol. 11 (5), 481-488 (2004).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor+signaling:+transcriptional+targets,+regulation+of+signals,+and+signaling+cross-talk.">BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).</li><li>Nohe, A., Hassel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mode+of+bone+morphogenetic+protein+(BMP)+receptor+oligomerization+determines+different+BMP-2+signaling+pathways.">The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways.</a> J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery:+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned.">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li><li>Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+growth+factors+for+bone+repair.">Localized delivery of growth factors for bone repair.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).</li><li>Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+immobilization+of+epidermal+growth+factor+onto+culture+substrates+for+the+selective+expansion+of+neural+stem+cells.">Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells.</a> Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).</li><li>Gon&#231;alves, R., Martins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactivity+of+immobilized+EGF+on+self-assembled+monolayers:+Optimization+of+the+immobilization+process.">Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).</li><li>Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation.">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li><li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology.">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li><li>Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-2+converts+the+differentiation+pathway+of+C2C12+myoblasts+into+the+osteoblast+lineage.">Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage.</a> J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).</li><li>Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+release+from+tissue+engineering+scaffolds.">Growth factor release from tissue engineering scaffolds.</a> J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).</li><li>Uludag, H., D'Augusta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+proteins+with+biomaterial+carriers:+a+correlation+between+protein+pharmacokinetics+and+osteoinduction+in+the+rat+ectopic+model.">Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model.</a> J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).</li><li>Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+BMP-2+for+functionalization+of+titanium+surfaces.">Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces.</a> Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).</li><li>Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-2+decorated+silk+fibroin+films+induce+osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells.">Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).</li><li>Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+systems+for+bone+growth+factors+-+the+new+players+in+skeletal+regeneration.">Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration.</a> J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).</li><li>Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+growth+factor+immobilization+strategies+for+tissue+repair+and+regeneration.">Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration.</a> Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).</li><li>Crouzier, T., Fourel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presentation+of+BMP-2+from+a+soft+biopolymeric+film+unveils+its+activity+on+cell+adhesion+and+migration.">Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration.</a> Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).</li><li>Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+morphogenetic+protein+2+contains+a+heparin-binding+site+which+modifies+its+biological+activity.">Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity.</a> European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).</li><li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology.">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li><li>Kato, K., Sato, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+histidine-tagged+recombinant+proteins+onto+micropatterned+surfaces+for+cell-based+functional+assays.">Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays.</a> Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).</li><li>Martins, M., Curtin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecularly+designed+surfaces+for+blood+deheparinization+using+an+immobilized+heparin-binding+peptide.">Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide.</a> J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).</li><li>Limbut, W., Kanatharana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+capacitive+immunosensors+based+on+self-assembled+monolayers+formed+from+thiourea,+thioctic+acid,+and+3-+mercaptopropionic+acid.">A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).</li><li>Patel, N., Davies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+protein+molecules+onto+homogeneous+and+mixed+carboxylate-terminated+self-assembled+monolayers.">Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).</li><li>Hu, J., Duppatla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+PEGylation+of+bone+morphogenetic+protein-2+cysteine+analogues.">Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues.</a> Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).</li><li>Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD+modified+polymers:+biomaterials+for+stimulated+cell+adhesion+and+beyond.">RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond.</a> Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).</li><li>Cao, T., Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+spacer+length+effect+on+immobilized+Escherichia+coli+pili-antibody+molecular+recognition+by+AFM.">Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM.</a> Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).</li><li>Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+to+immobilize+bioactive+proteins,+including+bone+morphogenetic+protein-4+(BMP-4),+on+titanium+alloy.">A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy.</a> Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).</li></ol>

Neste protocolo, descrevem a preparação de superfícies funcionalizadas com bioactivo rhBMP-2. Esta abordagem compreende dois passos: 1) a formação inicial de uma monocamada auto-montagem (SAM) de um ligante bifuncional sobre a superfície de ouro, 2) de imobilização covalente da proteína de rhBMP-2. Em trabalhos anteriores, que validou a ligação efectiva do ligante bifuncional e o factor de crescimento, e demonstraram que a superfície imobilizada-rhBMP-2 mantém a sua actividade biológica 19. A bi...

A proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2) é um membro do factor de crescimento transformante (TGF-β) familiar e actua como indutor da formação de novo osso, bem como regulador de vários tecidos durante o desenvolvimento embrionário e adulto homeostase 1-3. Cada monómero do biologicamente activo homodimérica proteína BMP-2 contém um motivo &quot;nó de cisteína&quot;, que é altamente conservada em todos os quatro BMPs. Seis dos sete resíduos de cisteína que formam ligações dissulfureto intramoleculares que estabilizam cada monómero, enquanto a sétima cisteína está envolvido na dimerização, formando uma ligação intramolecular entre os dois monómeros de 5,6. Este nó de cisteína altamente conservado define a estrutura tridimensional da proteína BMP-2 e determina as suas propriedades únicas, tais como a resistência ao calor, desnaturantes e ácida de pH 7-9. BMP-2 liga-se a serina / treonina-quinase de receptores transmembranares, induzindo deste modo a transdução de sinal <sup&gt; 10-12. Dependendo do modo de oligomerização do receptor, diferentes vias de sinalização são activados: uma cascata de sinalização Smad-independente leva a indução de fosfatase alcalina através de sinalização de p38, enquanto que uma via dependente de Smad activado pelos resultados da fosforilação do receptor no complexo de Smad translocação nuclear e activação da transcrição de genes-alvo específicos, tais como o inibidor da diferenciação (Id), 12-14. No osso, a BMP-2 induz a diferenciação de células estaminais mesenquimais em osteoblastos, estimulando, assim, a cicatrização e formação de novo de osso. Actualmente, expressa de forma recombinante BMP-2 é aplicada clinicamente para melhorar a cicatrização de sítios fracturados. Uma estratégia comum na engenharia de tecido ósseo é a utilização de factores de crescimento injectáveis, que é menos invasiva em relação aos sistemas de distribuição local. No entanto, estudos in vivo e aplicações clínicas têm demonstrado que a sua meia-vida biológica curta, loc inespecíficazação e rápida de domiciliação de BMP-2 pode levar a vários problemas locais, ectópica e sistêmicas 15. Assim, para obter uma apresentação eficaz, o aprisionamento ou imobilização de BMP-2 no interior de ou sobre materiais é necessário para o seu local de entrega e mantida no local alvo. Entrega sustentada pode ser conseguida com métodos de retenção não covalentes, tais como a retenção física, adsorção ou complexação de iões 16. No entanto, sabe-se que a adsorção não específica de proteínas para as superfícies podem resulta em desnaturação das moléculas de 17. Para a ligação de fatores de crescimento covalente, diferentes tipos de suportes foram desenvolvidos ao longo da última década. A utilização de moléculas de ligação bifuncionais, que se destinam a grupos amino ou carboxilo da proteína, por exemplo, é um tipo de abordagem que não requer, necessariamente, a modificação de proteínas para alcançar a sua imobilização. De facto, enquanto que a modificação de proteínas oferece a vantagem de controlar a orientação da proteína,a introdução dos domínios artificiais, as etiquetas e cadeias peptídicas específicas do local pode alterar a actividade biológica dos factores de crescimento 17. Assim, para contornar a desnaturação devido à interacção com o material de apoio, as superfícies podem ser previamente funcionalizados, por exemplo, com uma monocamada auto-montada (SAM) de uma molécula de ligação, seguido de acoplamento do fator desejado 18. Usámos uma abordagem baseada no SAM para imobilizar covalentemente BMP-2 para uma superfície de direccionamento dos seus resíduos de amina livre e têm mostrado que a proteína imobilizada retém a sua actividade biológica tanto a curto e longo prazo 19. Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente para entregar BMP-2 em células para estudos in vitro sobre os mecanismos que ocorrem na membrana celular e regulam a sinalização intracelular responsável pela sinalização osteogênica.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(dimethylamino)pyridin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>522805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11-mercaptoundecanoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>674427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlormethane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-dicyclohexylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D80002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum benzene</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>M 875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylacetate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhBMP-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>355-BM</td>
			<td>Carrier-free; expressed in E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethyl siloxane) (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhBMP-2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampliflu Red assay</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Sterile filtered, cell culture tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (0.1 M)</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 (1%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Lysis buffer (ALP assay)19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HNO3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate (pNPP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0942</td>
			<td>Phosphatase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mysin heavy chain (MHC)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td>
			<td>MF20</td>
			<td>Monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED 020 Sputtercoating system</td>
			<td>BAL-TEC AG</td>
			<td></td>
			<td>Coating conditions 
			Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec 
			Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M200 Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent binding of bmp-2 on surfaces using a self-assembled monolayer approach

A proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2) é um factor de crescimento incorporados na matriz extracelular do tecido ósseo. BMP-2 atua como gatilho da diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos, estimulando, assim, a cura e formação de osso novo. O uso clínico de humano recombinante BMP-2 (rhBMP-2) em conjunto com andaimes suscitou controvérsias recentes, com base no modo de apresentação e a quantidade a ser entregue. O protocolo aqui apresentado fornece um meio simples e eficaz para entregar a BMP-2 para os estudos in vitro em células. Descrevemos como para formar uma monocamada auto-montada que consiste num ligante heterobifuncional, e mostram o passo de ligação posterior para obter a imobilização covalente de rhBMP-2. Com esta abordagem, é possível conseguir uma apresentação sustentada de BMP-2, enquanto que a manutenção da actividade biológica da proteína. Na verdade, a superfície de imobilização de BMP-2 permite investigações orientadas, impedindo anúncios inespecíficasorption, enquanto reduz a quantidade de factor de crescimento e, mais notavelmente, dificultando a libertação não controlada da superfície. Ambos os eventos de sinalização de curto e longo prazo são desencadeadas por BMP-2 está a ter lugar quando as células são expostas a superfícies que apresentam covalentemente imobilizada a rhBMP-2, tornando esta abordagem adequada para estudos in vitro sobre as respostas celulares a BMP-2 de estimulação.

Em nossa configuração, o ouro foi escolhido como excipiente, uma vez que fornece um sistema biologicamente inespecífica, mas quimicamente ajustável. Além disso, a aplicação de camadas auto-montagem implica muitas vantagens: SAM adsorver espontaneamente através dos seus grupos &quot;cabeça-&quot; sobre metais e monocamadas de formulário com poucos defeitos, enquanto os grupos terminais funcionais pode ser modificado. Assim, eles proporcionam uma plataforma para adaptar as propriedades da interface de um modo ai...

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Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Descreve-se um método para realizar a imobilização eficiente de BMP-2 em superfícies. A nossa abordagem é baseada na formação de uma monocamada auto-montada para alcançar a ligação da BMP-2 por meio dos seus resíduos de amina livres covalente. Este método é uma ferramenta útil para o estudo de sinalização na membrana celular.

A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

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Dependence of Laser-induced Breakdown Spectroscopy Results on Pulse Energies and Timing Parameters Using Soil Simulants

Dependência da induzida por laser Resultados Breakdown Spectroscopy sobre Energias de pulso e parâmetros de tempo utilizando simuladores de solo

The  dependence of some LIBS detection capabilities on lower pulse energies (&lt;100  mJ) and timing parameters were examined using synthetic silicate ...

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Estabilização hepatocelular Fenótipo Usando superfícies sintéticas otimizados

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Altamente estável, funcional Hairy Nanopartículas e Biopolímeros de fibras de madeira: Rumo a nanotecnologia Sustentável

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Síntese com base em microfluídicas de estruturas orgânicas covalentes (COFs): uma ferramenta para produção contínua de fibras COF e impressão direta em uma superfície

Covalent Organic Frameworks (COFs) are a class of porous covalent materials which are frequently synthesized as unprocessable crystalline powders. The ...

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Síntese de Peptoides portadores de informações e sua Auto-montagem Dinâmica Covalent e dirigida por sequência

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