Name: using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions
Uploaded: 2013-10-31T19:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions at JoVE.com

Forfatteren tak Roberto Kolter (Harvard Medical School) for hans uvurderlige råd og bistand under udviklingen af ​​denne cokultur skærm. Hun takker også Matthew Powers til at læse manuskriptet til klarhed og Chia-yi Cheng for hjælp til at fremskaffe Figur 6.

1.. Vælg et reportergen og konstruere et fluorescerende Transkriptionel Reporter For B. subtilis: <ol><li> Se JOVE artiklen i henvisning 19 for en protokol, der beskriver opbygningen af fluorescerende transkriptionale journalister i Bacillus subtilis. </li></ol> For andre bakteriearter: <ol><li> Identificere et gen, som opreguleres under den fysiologiske reaktion af interesse. Dette kan være baseret på eksisterende litter...

<ol>
	<li>Berdy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+microbial+metabolites.">Bioactive microbial metabolites.</a> J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multiple+cell+types+in+Bacillus+subtilis.">Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li><li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li><li>Shank, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+interactions+that+result+in+Bacillus+subtilis+forming+biofilms+are+mediated+mainly+by+members+of+its+own+genus.">Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).</li><li>Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fluorescent Proteins. , (2013).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Nicolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condition-dependent+transcriptome+reveals+high-level+regulatory+architecture+in+Bacillus+subtilis.">Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis.</a> Science. 335, 1103-1106 (2012).</li><li>Middleton, R., Hofmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+shuttle+vectors+for+ectopic+insertion+of+genes+into+Bacillus+subtilis.">New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis.</a> Plasmid. 51, 238-245 (2004).</li><li>Shimotsu, H., Henner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+single-copy+integration+vector+and+its+use+in+analysis+of+regulation+of+the+trp+operon+of+Bacillus+subtilis.">Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis.</a> Gene. 43, 85-94 (1986).</li><li>Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+for+ectopic+integration+in+Bacillus+subtilis.">Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis.</a> Gene. 180, 57-61 (1996).</li><li>Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrative+elements+of+rhizobiophage+16-3+can+integrate+into+proline+tRNA+(CGG)+genes+in+different+bacterial+genera.">Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera.</a> J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).</li><li>Charpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cassette-based+shuttle+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).</li><li>Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+an+integration-proficient+vector+based+on+the+site-specific+recombination+mechanism+of+enterococcal+temperate+phage+phiFC1.">Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1.</a> J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (60), e3796 (2012).</li><li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis.">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li><li>Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+culture+of+'unculturable'+bacteria.">Strategies for culture of 'unculturable' bacteria.</a> FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).</li><li>Romano, J. D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas-Saccharomyces+interactions:+influence+of+fungal+metabolism+on+bacterial+physiology+and+survival.">Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival.</a> J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).</li><li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix.">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).</li></ol>

En af de iboende begrænsninger i denne protokol er, at det beror på den cultivability af mikrobielle organismer. Som det er veldokumenteret 24 mest mikrobielt liv på planeten, kan ikke (endnu) ikke dyrkes under dyrkningsbetingelser udforsket til dato. Således vil et stort antal interaktioner mellem mikrobielle arter, der forekommer i naturlige omgivelser gå upåagtet at bruge denne fremgangsmåde. , Da vores ønske er at ikke kun identificere eksistensen af ​​sådanne interaktioner, men så også stu...

Vi er interesseret i at forstå, hvordan de metabolitter, som bakterierne udskiller påvirker fysiologi og udvikling af de omkringliggende mikrober. Mange metabolitter er blevet karakteriseret for deres bioaktive virkninger på andre mikrober. To velbeskrevne eksempler indbefatter antibiotika, som inhiberer væksten af ​​andre mikroorganismer, og quorum sensing molekyler, som ændrer den globale genekspression af andre mikrober. Men bakterier producerer mange andre små molekyler naturlige produkter, der har ingen kendte bioaktiviteter 1. Vi hypotesen, at bakterier har udviklet og bevaret evnen til at producere nogle af disse metabolitter, fordi de giver dem mulighed for at modulere cellulære fysiologi af deres mikrobielle naboer i de komplekse mikrobielle samfund inden der findes de fleste bakterier. Bacillus subtilis celletyper Vi har fokuseret vores studier på kemisk medierede mikrobielle interaktioner, der involverer Bacillus subtilis. Det er ikke kun på grund af sin status som Gram-positive model bakterien og de resulterende genetiske værktøjer til rådighed for sin manipulation, men også på grund af dens evne til at differentiere til karakteriseret celletyper. Eksempler omfatter celler, der er: svømning, producerer den ekstracellulære matrix, der er nødvendig for robust biofilm dannelse, er kompetente til at tage op DNA fra miljøet, og sporedannende, bl.a. 2. Hver af disse celletyper udtrykker en karakteristisk transkriptionel regulon, der gør dem fysiologisk og / eller fysisk adskilt fra deres genetisk identiske søskende. Under mange vækstbetingelser, flere celletyper sameksistere så forskellige delpopulationer inden for en enkelt koloni af B. subtilis-celler 3.. Selv om mange arter af bakterier kan udvise analog celletype heterogenitet, dette fænomen er blevet særlig godt undersøgt i B. subtilis. Især gener, der er UPRegulated inden for hvert af disse specifikke B. subtilis celletyper er blevet identificeret. Er afgørende for det arbejde, der beskrives her identificere sådanne opreguleres gener fordi mange af disse mikrobielle fænotyper af interesse er svært eller umuligt at observere direkte. For eksempel kan vi ikke visuelt registrerer et træk såsom svømning på solide (1,5%) agarplader, selvom en delpopulation af B. subtilis-celler producerer flageller under disse vilkår 3. Et andet eksempel er biofilm matrix-produktion. Matrix produktion kan visualiseres ved koloni morfologi (da det resulterer i makroskopisk rynket kolonier), men kun på visse vækstmedium, og først efter flere dages vækst 4.. Men ved at vide, hvilke gener opreguleres under differentiering, kan vi konstruere transkriptionelle reportere, der fungerer som markører for cellulær differentiering i disse celletyper. Reporterkonstruktioner Disse fluorescerende transcriptional reportere består af promotorerne for celletype-specifikke gener driver produktionen af ​​et reporter-gen, for eksempel et fluorescerende protein. Som eksempler kan nævnes P hag-YFP (til svømning celler), P Tapa-YFP (for biofilm matrix-producerende celler), og P sspB-YFP (til sporedannende celler), hvor P x angiver promotor region for gen x. Disse reporter-konstruktioner er integreret i en neutral locus på kromosomet (fig. 1 og se nedenfor), således at det native regulering af fænotypen efterlades intakt. Men nu, når en celle udtrykker denne fænotype, udtrykker også et fluorescerende protein. Dette giver en let visualiseres udlæsning af aktiveringen af ​​særlig fænotypisk adfærd, hvilket giver os mulighed for at screene for mikrober, der aktiverer denne fysiologisk reaktion. Selv om sådanne journalister er almindeligt anvendt i mikrobiologi, er de ikke blevet bredt anvendt i skærme til identify metaboliske interaktioner mellem mikrober, før denne metode blev beskrevet 5. Der er en række vigtige overvejelser i design og konstruktion af celle-typespecifikke reporter stammer. Vi har udnyttet udelukkende transkriptionelle fluorescerende reportere, selv om andre typer af konstruktioner er bestemt muligt. Vi fraråder brug af translationsfusioner som markører for celletype differentiering i vores skærm, men for to grunde: 1) ønsket om at forlade native celletype-specifikt protein uanfægtet, og 2) anerkendelse af, at en diffus, celle- bred fluorescens vil være lettere at opdage end lokaliseret puncta i cellerne (fælles med translationsfusioner). Reportergen udvælgelse Efter at have besluttet at bruge transskription som en udlæsning, skal reportergenet vælges (f.eks LacZ, fluorescens eller luciferase). LacZ har den fordel, at behøve mindst særligeliseret til at detektere, men der er en meget højere sandsynlighed for falske positiver blandt miljømæssige mikrober. I vores hænder, baggrundsniveauet for Lac + organismer blandt jordens mikroorganismer var uoverkommeligt høj (&gt;&gt; 10% af jordens mikroorganismer var blå (Lac +) på X-gal plader, data ikke vist). Det er muligt, ved at titrere koncentrationen af ​​X-gal i mediet, kan det være optimeret til at tillade anvendelse af en X-gal-reporter, selv om vi ikke forsøge dette. Luciferase giver høj følsomhed påvisning og er den mest retvinklede reporter: Der er næsten ingen chance for miljømæssige mikrober er i sagens natur selvlysende. Vi fandt imidlertid det vanskeligt at identificere instrumentering på vores institution, der tillod luminescens opdagelse på tværs af hele Petri plader, da de fleste var designet til at scanne kun lokaliserede områder i multi-brønds plader. Der kan også være komplikationer i visualisere selvlysende kolonier på en måde, der også tillod samtidig fysisk erolation af inducerende organismer. Mens du bruger tilsynsførende kan have gjort dette muligt, vi i stedet valgt at bruge fluorescerende transkriptionale journalister, som blev vist sig at fungere i B. subtilis, forudsat tilstrækkelig påvisningsfølsomhed og lave falske positive blandt jordorganismer og lov til at bruge af let tilgængelige instrumenter til både visualisering og isolation procedurer. Fluorophor udvælgelse Den specifikke Fluoroforen valgt vil afhænge af dine bakteriearter, agar vækstmedium, du bruger, og den særlige fluorescens filter indstiller du har til rådighed. Med vores instrumentering, fandt vi at både B. subtilis kolonier selv og agar, de blev dyrket på udstillet mindre baggrundsfluorescens når YFP (gult fluorescerende protein) filtre blev anvendt, hvilket gør, at reporter overlegen GFP (grønt fluorescerende protein) i vores hænder. Kodonanvendelsen af ​​fluorescerende proteiner erofte optimeret til eukaryoter, hvilket gør det vigtigt at vælge en fluorofor enten kendte fra litteraturen til at arbejde i dine bakteriearter, eller at teste det eksplicit ved hjælp af en konstitutiv promotor. Et stort antal af stadigt udviklende fluorescerende protein varianter findes i øjeblikket 6, som er blevet revideret i en række kilder 7,8, hvoraf nogle eksplicit vejlede om at vælge en passende fluorescerende protein til dit eksperiment 9. Promotor udvælgelse Udvælgelsen af ​​en promotor vil i høj grad afhænge af din celletype eller fænotype af interesse. For organismer såsom B. subtilis, har nogle celle-typespecifikke reportergener er etableret i litteraturen. For andre bakteriestammer vil undersøge microarray eller transskriptionelle data være nødvendigt at give oplysninger om, hvilke gener er stærkt opreguleres under de betingelser, hvor din celletype af interesse is manifesteret. En nylig undersøgelse katalogiseret transkription af B. subtilis under 104 forskellige vækstbetingelser hjælp flisebelægning microarrays 10. Dette dokument indeholder omfattende information om, hvilke gener er stærkt opreguleres under forskellige forhold, hvilket er uvurderligt for mindre velkarakteriserede fænotyper. Snarere end at kortlægge præcise promotorregioner for hvert gen af ​​interesse, vi typisk blot bruge sekvensen 200-500 bp opstrøms for genet som promotoren. Den nøjagtige sekvens længde afhænger af den genomiske sammenhæng: kortere regioner anvendes når det er nødvendigt at undgå at medtage opstrøms kodende regioner fra tilgrænsende åbne læserammer. Neutral loci og integration Hvordan at opretholde reporter konstruktionen i din bakteriestamme bliver det sidste spørgsmål i at designe en fluorescerende transkriptionel reporter stamme. I bakterier er gener af interesse ofte vedligeholdespå plasmider ved hjælp af antibiotisk selektion. Imidlertid kan det ikke være muligt at anvende antibiotika i cokultur uden at dræbe de miljømæssige mikrober. Hvis plasmider stabilt fastholdes i dine bakteriearter, kan det være muligt dyrke din bakterier, der indeholder et plasmid-bårne reporter i tilstedeværelse af antibiotika til at forberede din reporter til screening, og derefter fjerne antibiotika under cokultur selv i håb om, at plasmidet vil være tilstrækkeligt at gøre det muligt for fluorescens. Men hvis plasmider nemt går tabt i din bakterie, eller går tabt under stress betingelser, vil dette ikke være en farbar vej. I mange tilfælde vil den bedste løsning være at integrere reporter konstrukt på det bakterielle kromosom, som tillader stabil opretholdelse af reporter, selv i fravær af selektionstryk. For at integration ikke forstyrre den normale udtryk eller regulering af din gen af ​​interesse, anbefaler vi integrerer en ektopisk sted på kromosomet at CAn fungere som en &quot;neutral locus.&quot; I B. subtilis disse integrationsprocesser sites er gener, der - når muteret - overbringe en fænotype i visse minimal medier (tillader integranter kan identificeres uden antibiotisk udvælgelse), endnu ikke ændrer vækst eller sporulation satser i rich media, og omfatter sådanne gener som amyE, Laca, thrC, pyrD, gltA og SACA (fremføring af evnen til at udnytte stivelse, β-galactosider, threonin, uracil, glutamat og saccharose, henholdsvis) 11-13. Integrationen i disse gener er blevet anvendt pålideligt i mange år i B. subtilis (specielt ved amyE og Laca) kan tilsvarende viden ikke tilgængelig for gener i mange andre bakteriearter. Brugen af fag-bindingssteder er gode alternativer til neutrale kromosomale integration sites: mange artsspecifikke 14-16, samt almindelige integrationsindsats steder såsom Tn7 vedhæftede stedet (ATT Tn7) harblevet identificeret og anvendt til genindsætninger i mange bakteriearter 17,18. Miljømæssige mikrober Vi bruger jord som en direkte kilde til miljø mikrober til vores cokultur skærm. Jordbunden indeholder en høj diversitet af mikrober, og mange af disse organismer er rig kilde til naturlige produkter. Ved anvendelse af flydende suspensioner af jord placeret direkte på plader med vores fluorescerende transkriptionel reporter stamme (uden forudgående isolation af bakterier fra jorden), vi i høj grad forenkle eksperimenterende tilgang. Jorden kan enten bruges straks efter høst, eller nedfryses ved -80 ° C til senere brug. Øjeblikkelig brug har den fordel, at en større mangfoldighed af mikrober potentielt kan dyrkes, herunder dem, der ikke vil overleve frysning godt. Det har den ulempe, at koncentrationen af ​​dyrkbare organismer i jorden fra disse prøver er ukendt, øge antallet af skærmplader, der skal anvendes. DelAyed brug har den fordel, at de cfu / ml for hver jord kilde kan bestemmes på forhånd, så en optimeret antallet af kolonier, der skal dyrkes på hver skærm plade. Men det kræver, at de jordorganismer være i stand til at overleve frysning. Bemærk at diversificere inducer pulje blive undersøgt (dvs. jord kilder), synes at være mere effektive til at identificere nye interspecies interaktioner end dybdegående screening på samme jord: større fylogenetisk diversitet blev observeret i hits identificeret i vores matrix-induktion skærmen som yderligere jord kilder blev undersøgt snarere end screening af de samme jord kilder mere grundigt (EA Shank og R. Kolter, Harvard Medical School, upublicerede resultater). Oversigt Den tilgang, vi beskriver her er ligetil i form af de tekniske krav. Det indebærer: 1) at konstruere en fluorescerende transkriptionel reporter i B. subtilis eller enandre bakteriearter af interesse, 2) identifikation af forhold, hvorunder denne reporter ikke er aktiveret, 3) udarbejdelse af portioner af denne reporter stamme og organismer, der skal screenes (i vores tilfælde jord, men andre kilder kunne udnyttes i stedet), 4) at blande disse to sæt af mikrober på faste medier, 5) identificere og isolere formodede inducerende organismer, og 6), hvilket bekræfter, at disse organismer faktisk aktiverer denne fænotype i en sekundær screening. Når identificeret, disse organismer og deres metabolitter give os kemiske redskaber til at modulere bakteriel adfærd, for at studere bakteriel fysiologi og mikrobielle interaktioner, og eventuelt fungere som nye stilladser til fremtidige terapeutiske forbindelser.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth, Lennox</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80017-484</td>
			<td>Alternative media sources may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 3 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26396-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading tips, round</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59060-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions

I naturen, sjældent findes bakterier i isolation, de er i stedet omgivet af en bred vifte af andre mikroorganismer, der ændrer det lokale miljø ved at udskille metabolitter. Disse metabolitter har potentiale til at modulere fysiologi og differentiering af deres mikrobielle naboer, og er sandsynligvis vigtige faktorer i etablering og vedligeholdelse af komplekse mikrobielle samfund. Vi har udviklet en fluorescens-baserede cokultur skærmen for at identificere sådanne kemisk medierede mikrobielle interaktioner. Skærmen indebærer at kombinere en fluorescerende transkriptionel reporter stamme med miljømæssige mikrober på faste medier og lade kolonierne til at vokse i cokultur. Den fluorescerende transkriptionelle reporter er udformet således, at den valgte bakteriestamme fluorescerer, når det udtrykker en særlig fænotype af interesse (dvs. biofilmdannelse, sporulation virulensfaktor produktion osv.) Screening udføres under vækstbetingelser where denne fænotype ikke udtrykkes (og derfor reporter stammen er typisk ikke-fluorescerende). Når en miljømæssig mikrobe udskiller en metabolit, der aktiverer denne fænotype, diffunderer gennem agar og aktiverer fluorescerende reporter konstrukt. Dette gør det muligt at inducere-metabolit-producerende mikroorganisme, der skal detekteres: de er ikke-fluorescerende kolonier mest proksimale til de fluorescerende kolonier. Således er denne skærm gør det muligt at identificere miljømæssige mikrober, der producerer diffusible metabolitter, der aktiverer en bestemt fysiologisk reaktion på en reporter stamme. Denne publikation beskrives, hvordan du: a) udvælge passende cokultur screening betingelser, b) udarbejde journalisten og miljømæssige mikrober til screening, c) udføre cokultur skærmen, d) isolere formodede overtalelse organismer, og e) bekræfte deres aktivitet i en sekundær skærm. Vi har udviklet denne metode til at screene for jordlevende organismer, der aktiverer biofilm matrix-produktion i Bacillus subtilis </em&gt;, men vi også diskutere overvejelser for at anvende denne tilgang til andre genetisk medgørlige bakterier.

Denne skærm blev anvendt til at identificere jordorganismerne secernerende stoffer som ændrer fysiologi B. subtilis. De her beskrevne resultater fokusere på matrix-producerende celle type B. subtilis, der producerer proteinet og exopolysaccharid, der kræves for robust biofilmdannelse i denne bakterie. Vi valgte promotor af tapa-sipW-Tasa operon for vores fluorescerende reporter konstruktion (P tapa-YFP). Denne operon koder for proteinet strukturelle komponent i matrixen...

Watch this Scientific Journal Video about Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions at JoVE.com

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Brug cokultur Detect Kemisk medierede interspecies Interaktioner

Bakterier producerer udskilte forbindelser, der har potentiale til at påvirke fysiologi deres mikrobielle naboer. Her beskriver vi en cokultur skærm, der tillader detektering af sådanne kemisk medierede interspecies interaktioner ved at blande jordens mikroorganismer med fluorescerende transskriptions reporter stammer af Bacillus subtilis på faste medier.

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Hurtig Syntese og Screening af kemisk aktiveret transkriptionsfaktorer med GFP-baserede Journalister

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Opdage protein interaktioner og karakterisere Protein Funktion Brug HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Bestemmelse af protein-ligand interaktioner Brug Differential Scanning fluorimetri

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondering High-density funktionelt protein Microarrays at Detect protein-protein interaktioner

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Brug caenorhabditis elegans til skærmen for vævsspecifikke chaperone interaktioner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

Kultur metoder til at studere apikale-specifikke interaktioner ved hjælp af tarmorganoid modeller

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Bioinformatics Resources for the Study of Glycan-Mediated Protein Interactions

Bioinformatikressourcer til undersøgelse af glykanmedierede proteininteraktioner

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In ...