Name: methods for studying the mechanisms of action of antipsychotic drugs in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2014-02-04T14:00:00
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Le travail a été soutenu par une NIH prix scientifique de développement clinique K08NS002083, une subvention de l&#39;Institut de recherche Shervert Frazier, et le Prix du jeune chercheur NARSAD à Edgar A. Buttner.

Une. Retard de développement / test de létalité: Le type sauvage (N2) et deux souches mutantes (MUT1 et Mut2) sont testés dans trois concentrations de clozapine dans une plaque de 12 puits <ol><li> Au jour 1, verser 2 ml NGM support 10 dans chaque puits d&#39;une plaque de 12 puits (chaque puits d&#39;un diamètre de 2 cm) et laisser durcir sur le banc à la température ambiante (RT) pendant la nuit. Le même jour, choisir une colonie de bactéries Escherichia coli OP50, infe...

<ol>
	<li>Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+adaptation+in+C.+elegans+produced+by+antipsychotic+drugs+requires+serotonin+and+is+associated+with+calcium+signaling+and+calcineurin+inhibition.">Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition.</a> Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).</li><li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clozapine+interaction+with+phosphatidyl+inositol+3-kinase+(PI3K)/insulin-signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).</li><li>Rand, J. B., Johnson, C. D., Estein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 187-204 (1995).</li><li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li><li>Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+Caenorhabditis+elegans+genetics+for+understanding+human+psychiatric+disease.">The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease.</a> Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).</li><li>Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antipsychotic+drugs+disrupt+normal+development+in+Caenorhabditis+elegans+via+additional+mechanisms+besides+dopamine+and+serotonin+receptors.">Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors.</a> Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).</li><li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+effects+of+clozapine:+involvement+of+trace+amine+pathways+in+C.+elegans+and+M.+musculus.">Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus.</a> Brain Res. 1393, 91-99 (2011).</li><li>Saur, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans+Identifies+the+Nicotinic+Acetylcholine+Receptor+Subunit+ACR-7+as+an+Antipsychotic+Drug+Target.">A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target.</a> PLoS Genet. 9, (2013).</li><li>Avery, L., You, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , (2012).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. 47, (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Estein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 3-29 (1995).</li><li>Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+developmental+exposure+to+ethanol+on+Caenorhabditis+elegans.">Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).</li><li>Kage-Nakadai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+very+long+chain+fatty+acid+acyl-CoA+synthetase+genes,+acs-20+and+acs-22,+have+roles+in+the+cuticle+surface+barrier+in+Caenorhabditis+elegans.">Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li></ol>

Ici, nous décrivons les méthodes pour tester les effets des APD sur le développement et le comportement de C. elegans. DMSO ou de l&#39;éthanol est utilisé pour dissoudre la clozapine, étant donné que le médicament est relativement insoluble dans l&#39;eau. Parce que les solvants ont été signalés à affecter C. elegans biologie 12, le DMSO seul ou groupes de contrôle éthanol seul sont essentiels. La plus forte concentration de DMSO utilisés dans nos essais est jusqu&#39;à 3%, ...

Caenorhabditis elegans est un organisme génétique simple prêtent à grande échelle écrans génétiques avant et arrière et des écrans génétiques chimiques. C. elegans est sensible à un large spectre de composés bioactifs et a donc été utilisée avec succès pour déterminer les mécanismes d&#39;action de ces divers composés. Par exemple, les composés bioactifs étudiés en utilisant la pharmacogénétique à vis sans fin comprennent des agonistes des récepteurs de l&#39;acétylcholine (par exemple, lévamisole, la nicotine, morantel, et pyrantel), anesthésiques (par exemple, l&#39;halothane), la caféine, les inhibiteurs de cholinestérase (par exemple, l&#39;aldicarbe, Lannate, et trichlorfon), le fluorure, le GABA-connexes composés (par exemple GABA et muscimol), l&#39;ivermectine, le paraquat, les esters de phorbol et les médicaments liés à la sérotonine (par exemple, la sérotonine et imiprimine) 3. Par ailleurs, C. elegans a été utilisé pour les écrans de petites molécules à grande échelle, permettant la découverte d&#39;un nouveau composé bioactifs et l&#39;identification de cibles génétiques nouveaux 4. Le C. génome elegans comprend médicament antipsychotique potentiel (APD) des cibles conservées chez l&#39;homme, y compris les gènes codant pour des protéines nécessaires à la synthèse des neurotransmetteurs et pour la structure et la fonction synaptique 5. Ainsi, C. elegans neurogénétique et offre de neurobiologie méthodes pour découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires d&#39;action des APD. Dans les nématodes, exposition APD tôt dans le développement produit un retard de développement, et à des concentrations plus élevées, la létalité 2,6. Exposition APD à l&#39;âge adulte produit phénotypes comportementaux. Par exemple, l&#39;exposition clozapine inhibe la locomotion et du pharynx pompage et améliore la ponte 1,2,7. Retard de développement APD-induite et la létalité sont des phénotypes puissants pour grands écrans génétiques chimiques. Ces phénotypes sont complexes dans la mesure où ils ont probablement plus d&#39;un basi cellulaires et génétiquess. Par conséquent, ces écrans génétiques devraient donner une variété de cibles indirectes de drogue. Cependant, notre laboratoire a effectué des écrans de gènes candidats et un écran ARNi à grande échelle pour des suppresseurs de retard de développement APD-induite et de la létalité et les gènes qui codent probablement des cibles directes, y compris la dopamine, l&#39;insuline et les récepteurs nicotiniques de l&#39;acétylcholine 2,8 a réussi à récupérer. Cribles génétiques basés sur les comportements APD-induits chez l&#39;adulte ont également conduit à l&#39;identification de nouvelles cibles APD, et nous sommes maintenant la validation de cibles à partir des écrans à la fois développement et de comportement chez les mammifères 7. Ainsi, une approche génétique chimique invertébrés de découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires d&#39;action des APD semble réalisable 5,8. Le C. elegans pharynx est un organe qui comprend 20 neurones, 20 des cellules musculaires, et les 20 cellules accessoires, enveloppés par une membrane basale. Semblable à cœur de mammifère, le pharynx est un autonomend pompes constamment aliment depuis l&#39;environnement externe 9. Inhibition de la vitesse de pompage du pharynx compromet l&#39;absorption de nourriture, et donc des mutations ou des médicaments qui inhibent pharyngée pompage cause de retard de développement ou arrêter 9. APD inhibent le taux de pompage du pharynx, soit dans le cadre de leurs effets sur le développement et la viabilité 1,2. Ici, nous utilisons la clozapine APD atypique comme un exemple pour démontrer dosages de médicaments pour le développement des nématodes et du pharynx pompage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>Clozapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6305</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetic acid (HAC)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2401</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium hydroxide(NaOH)</td>
			<td style="width:71px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0590-13</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">425044</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:236px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:188px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:200px;">5810 000.017</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:236px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:188px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:200px;">M1246-0006</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:236px;">Low temperature incubator 815</td>
			<td style="width:188px;">Precision Scientific</td>
			<td style="width:200px;">J1790-1B</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:236px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:188px;">Olympus</td>
			<td style="width:200px;">SZX12</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:236px;">Petri dish 35 x 10 mm</td>
			<td style="width:188px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:200px;">NC9434271</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:236px;">12-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:188px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:200px;">REF 353043</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for studying the mechanisms of action of antipsychotic drugs in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans est un organisme génétique simple prêtent à grande échelle avant et arrière écrans génétiques et les écrans génétiques chimiques. Le C. génome elegans comprend médicament antipsychotique potentiel (APD) des cibles conservées chez l&#39;homme, y compris les gènes codant pour des protéines nécessaires à la synthèse des neurotransmetteurs et pour la structure et la fonction synaptique. Exposition APD produit retard et / ou la létalité chez les nématodes de développement d&#39;une manière dépendante de la concentration. Ces phénotypes sont dus, en partie, par l&#39;inhibition induite APD de 1,2 pharyngée pompage. Ainsi, le phénotype de développement a une base neuromusculaire, ce qui est utile pour des études pharmacogénétiques des neuroleptiques. Ici, nous démontrons des procédures détaillées pour tester les effets APD sur le développement des nématodes et du pharynx pompage. Pour le dosage du développement, les embryons sont placés synchronisés sur un milieu de croissance de nématodes (NGM) des plaques contenant APDs, et les stades de développement de l&#39;anusmaux sont ensuite marqués quotidien. Pour le test de débit de pompage du pharynx, mis en scène de jeunes animaux adultes sont testés sur des plaques NGM contenant APD. Le nombre de pompes du pharynx par unité de temps est enregistré, et le débit de pompage est calculé. Ces dosages peuvent être utilisés pour l&#39;étude de nombreux autres types de petites molécules ou même de grandes molécules.

Une. Le retard de développement / résultat du test de létalité Un résultat typique pour le dosage de retard / de létalité de développement est mise en évidence sur les figures 1a et 1b. Lorsque les animaux sauvages dans le groupe de contrôle ont grandi à l&#39;âge adulte gravide (figure 1a), les animaux de type sauvage exposées à la clozapine sont encore dans les jeunes stades larvaires ou sont morts (figure 1b). Figure 1c...

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Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approches pour tester les effets des médicaments antipsychotiques (APDS) dans Caenorhabditis elegans sont démontrés. Les dosages sont décrits pour tester les effets des médicaments sur le développement et sur la viabilité et le taux de pompage du pharynx. Ces méthodes sont également applicables pour les expériences pharmacogénétiques avec d&#39;autres classes de médicaments que les PDA.

Méthodes pour étudier les mécanismes d&#39;action des antipsychotiques dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

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