Name: methods for studying the mechanisms of action of antipsychotic drugs in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2014-02-04T14:00:00
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Il lavoro è stato supportato da un NIH premio Sviluppo Scienziato Clinico K08NS002083, un Shervert Frazier Research Institute Grant, e un NARSAD Young Investigator Award di Edgar A. Buttner.

1. Developmental Delay / letalità saggio: The Wild-Type (N2) e due Mutant (Mut1 e Mut2) ceppi sono stati testati in tre Clozapina concentrazioni in un 12-pozzetti <ol><li> Il giorno 1, versare 2 ml NGM medio 10 in ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti (ogni pozzetto con un diametro di 2 cm) e lasciare indurire sul banco a temperatura ambiente (RT) per una notte. Lo stesso giorno, scegliere una colonia di batteri Escherichia coli OP50, infettare un flacone di 50 ml di soluzi...

<ol>
	<li>Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+adaptation+in+C.+elegans+produced+by+antipsychotic+drugs+requires+serotonin+and+is+associated+with+calcium+signaling+and+calcineurin+inhibition.">Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition.</a> Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).</li><li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clozapine+interaction+with+phosphatidyl+inositol+3-kinase+(PI3K)/insulin-signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).</li><li>Rand, J. B., Johnson, C. D., Estein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 187-204 (1995).</li><li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li><li>Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+Caenorhabditis+elegans+genetics+for+understanding+human+psychiatric+disease.">The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease.</a> Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).</li><li>Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antipsychotic+drugs+disrupt+normal+development+in+Caenorhabditis+elegans+via+additional+mechanisms+besides+dopamine+and+serotonin+receptors.">Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors.</a> Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).</li><li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+effects+of+clozapine:+involvement+of+trace+amine+pathways+in+C.+elegans+and+M.+musculus.">Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus.</a> Brain Res. 1393, 91-99 (2011).</li><li>Saur, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans+Identifies+the+Nicotinic+Acetylcholine+Receptor+Subunit+ACR-7+as+an+Antipsychotic+Drug+Target.">A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target.</a> PLoS Genet. 9, (2013).</li><li>Avery, L., You, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , (2012).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. 47, (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Estein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 3-29 (1995).</li><li>Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+developmental+exposure+to+ethanol+on+Caenorhabditis+elegans.">Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).</li><li>Kage-Nakadai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+very+long+chain+fatty+acid+acyl-CoA+synthetase+genes,+acs-20+and+acs-22,+have+roles+in+the+cuticle+surface+barrier+in+Caenorhabditis+elegans.">Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li></ol>

Qui, descriviamo metodi per testare gli effetti della APD sullo sviluppo e comportamento di C. elegans. DMSO o etanolo è usato per sciogliere clozapina, in quanto il farmaco è relativamente insolubile in acqua. Dato che i solventi sono stati segnalati per influenzare C. elegans biologia 12, DMSO-alone o gruppi di controllo etanolo-alone sono essenziali. La massima concentrazione di DMSO utilizzata nei nostri test è fino al 3%, che non ha un effetto evidente sul C. elegans svilupp...

Caenorhabditis elegans è un organismo semplice genetica suscettibili di grandi schermi genetiche in avanti e all&#39;indietro e schermi genetici chimici. C. elegans è sensibile ad un ampio spettro di composti bioattivi e pertanto è stato usato con successo per definire i meccanismi di azione di una varietà di tali composti. Ad esempio, i composti bioattivi studiate usando farmacogenetica vermi sono agonisti del recettore dell&#39;acetilcolina (ad esempio Levamisolo, nicotina, morantel, e Pyrantel), anestetici (es. alotano), la caffeina, gli inibitori della colinesterasi (ad esempio aldicarb, Lannate, e triclorfon), fluoruro, GABA-correlate composti (ad esempio GABA e muscimolo), ivermectina, paraquat, esteri del forbolo, e farmaci serotonina legati (es. serotonina e imiprimine) 3. Inoltre, C. elegans è stato usato per grandi schermi piccole molecole, permettendo scoperta di nuovi composti bioattivis e identificazione di nuovi bersagli genetici 4. La C. elegans genoma include potenziale farmaco antipsicotico (APD) obiettivi conservati negli esseri umani, compresi i geni che codificano le proteine ​​necessarie per la sintesi dei neurotrasmettitori e per la struttura e la funzione sinaptica 5. Così, C. elegans neurogenetica e offrono neurobiologia metodi per la scoperta di nuovi meccanismi molecolari d&#39;azione di APD. In nematodi, l&#39;esposizione APD precoce dello sviluppo produce ritardo dello sviluppo, e a concentrazioni più elevate, letalità 2,6. L&#39;esposizione APD durante l&#39;età adulta produce fenotipi comportamentali. Ad esempio, l&#39;esposizione clozapina inibisce la locomozione e faringea pompaggio e migliora la deposizione delle uova 1,2,7. APD-indotta ritardo e letalità dello sviluppo sono fenotipi potenti per grandi schermi genetici chimici. Questi fenotipi sono complesse nella misura in cui probabilmente hanno più di un BASI cellulari e geneticis. Pertanto, tali schermi genetici dovrebbero produrre una varietà di bersagli indiretti droga. Tuttavia, il nostro laboratorio ha condotto candidati schermi di geni e uno schermo RNAi genome-wide per soppressori di APD indotta ritardi e letalità dello sviluppo e ha recuperato con successo geni che codificano probabili bersagli diretti, tra cui la dopamina, l&#39;insulina, e recettori nicotinici 2,8. Schermi genetici basati sui comportamenti APD-indotte nel adulti hanno portato anche all&#39;identificazione di nuovi bersagli APD, e ora stiamo convalida bersagli dagli schermi sia sviluppo e comportamentali nei mammiferi 7. Così, un approccio invertebrato chimica genetica per scoprire i meccanismi molecolari d&#39;azione delle APD sembra essere fattibile 5,8. La C. elegans faringe è un organo che include 20 neuroni, cellule muscolari, 20 e 20 cellule accessorie, avvolto da una membrana basale. Simile al cuore dei mammiferi, la faringe è un autonomond pompe costantemente cibo dall&#39;ambiente esterno 9. L&#39;inibizione del tasso di pompaggio faringeo compromette l&#39;assorbimento di cibo, e quindi le mutazioni o farmaci che inibiscono faringeo pompaggio causa ritardo nello sviluppo o arresto 9. APD inibiscono il tasso faringeo di pompaggio, che rappresentano in parte per i loro effetti sullo sviluppo e la redditività 1,2. Qui, usiamo il atipico APD clozapina come esempio per dimostrare saggi di droga per lo sviluppo nematode e della faringe pompaggio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>Clozapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6305</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetic acid (HAC)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2401</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium hydroxide(NaOH)</td>
			<td style="width:71px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0590-13</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">425044</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:236px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:188px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:200px;">5810 000.017</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:236px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:188px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:200px;">M1246-0006</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:236px;">Low temperature incubator 815</td>
			<td style="width:188px;">Precision Scientific</td>
			<td style="width:200px;">J1790-1B</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:236px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:188px;">Olympus</td>
			<td style="width:200px;">SZX12</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:236px;">Petri dish 35 x 10 mm</td>
			<td style="width:188px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:200px;">NC9434271</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:236px;">12-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:188px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:200px;">REF 353043</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for studying the mechanisms of action of antipsychotic drugs in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans è un organismo semplice genetica suscettibili di larga scala in avanti e retromarcia schermi genetici e schermi genetici chimici. La C. elegans genoma include potenziale farmaco antipsicotico (APD) obiettivi conservati negli esseri umani, compresi i geni che codificano le proteine ​​necessarie per la sintesi dei neurotrasmettitori e per la struttura e la funzione sinaptica. L&#39;esposizione APD produce ritardo di sviluppo e / o letalità in nematodi in modo concentrazione-dipendente. Questi fenotipi sono causati, in parte, mediante inibizione APD-indotta faringeo pompaggio 1,2. Così, il fenotipo di sviluppo ha una base neuromuscolare, rendendolo utile per studi di farmacogenetica dei neurolettici. Qui mostriamo le procedure dettagliate per testare gli effetti APD sullo sviluppo nematode e della faringe pompaggio. Per il saggio di sviluppo, gli embrioni sincronizzati sono immessi sul (NGM) piastre contenenti APD nematode mezzo di crescita, e le fasi di sviluppo di animali vengono quindi segnati giornalmente. Per il saggio faringeo tasso di pompaggio, in scena giovani animali adulti sono testati su piastre NGM contenenti APD. Il numero di pompe faringei per unità di tempo viene registrato, e la velocità di pompaggio è calcolato. Questi saggi possono essere utilizzati per studiare molti altri tipi di piccole molecole o anche grandi molecole.

1. Il ritardo dello sviluppo / letalità risultato del test Un risultato tipico per il dosaggio ritardo dello sviluppo / letalità è dimostrato nelle figure 1a e 1b. Quando wild-type animali del gruppo di controllo sono cresciuti allo stadio adulto gravida (Figura 1a), wild-type animali esposti a clozapina sono ancora nelle giovani stadi larvali o sono morti (Figura 1b). Figura 1c mostra un risultato rappresentativo confronto ...

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Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approcci per testare gli effetti dei farmaci antipsicotici (APD) in Caenorhabditis elegans sono dimostrati. I dosaggi sono descritti per testare gli effetti della droga sullo sviluppo e la redditività e sulla faringe velocità di pompaggio. Questi metodi sono applicabili per esperimenti di farmacogenetica con classi di farmaci diversi da APD anche.

Metodi per studiare i meccanismi d&#39;azione di farmaci antipsicotici in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

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