Name: coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells
Uploaded: 2013-10-09T22:30:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells at JoVE.com

المؤلفين أشكر Chalid غضبان لمساعدته فنية ممتازة، أندرياس Wodarz وستيفان Heermann للحصول على المشورة التقنية بشأن متحد البؤر والوقت الفاصل بين المجهري. ليس هناك تضارب مصالح لأي من المؤلفين. ويتم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الألمانية (DFG) في المشروع 2 من Forschergruppe 942 (BI FOR942 703/3-1)، من فستان. باير شتيفتونغ (بادن Württembergischer Krebspreis، ألمانيا) وبرنامج البحوث التابع لكلية الطب، جورج أغسطس الجامعة غوتنغن، ألمانيا.

هذا النموذج الجديد هو التكيف نهج عضوي النمط شريحة الدماغ الحصين سبق نشرها 9-12. وأدخلت تعديلات وإضافات لتحسين سرطان خلايا الدماغ الأنسجة التفاعلات وضمان التكاثر. واستعرضت الدراسة والتي وافقت عليها لجنة الأخلاق المحلية. تم علاج الحيوانات بعناية وفقا لمبادئ توجيهية لرعاية الحيوان في غوتنغن الطب جامعة. ويمكن تقسيم عضوي النمط شريحة الدماغ coculture إلى خطوتين. خطوة واحدة هو إعداد عضوي النمط شريحة الدماغ. خطوتين تضم إعداد الخلايا السرطانية وترسب في نموذج coculture. 1. عضوي النمط شريحة الدماغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة تشريح تتألف من الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM)، على أن تستكمل مع 0.2 ملي الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، 100 ملغ / مل الستربتوميسين، و 4.5 ملغ / مل من الجلوكوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الفئران من سلالة الفأر بين أي يوم ما بعد الولادةستة وثمانية (P6-8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدماغ من الجمجمة بسرعة تحت ظروف معقمة ونقلها إلى الجليد الباردة المتوسطة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القطب الجبهي والمخيخ من قسم الدماغ كله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح وتحقيق الاستقرار في الدماغ على خشبة المسرح مع الغراء البرد و 5٪ الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة أقسام الدماغ أفقيا لسمك 350 ميكرون من قبل باستخدام vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 4-6 شرائح الدماغ كله من مخ الفأر واحد، تبعا للأنواع والعمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مستنبت تتألف من 50٪ MEM، 25٪ هانكس &quot;محلول ملحي متوازن (HBSS)، و 25٪ مصل الحصان العادي (NHS)، 0.2 ملي الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، 100 ملغ / مل الستربتوميسين (سيغما، ميونيخ، ألمانيا)، والجلوكوز 4.5 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل شريحة الدماغ عضوي النمط على 0.4 ميكرومتر البولي transwell إدراج الغشاء في لوحة ستة جيدا مع 1 مل من زراعة المتوسطة في أقل أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة عضوي النمط شرائح الدماغ بين عشية وضحاها في humidifieد الغلاف الجوي مع 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية الحاضنة. </li></ol> 2. نموذج شريحة Coculture <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين 10-5 من transfected GFP ورم أو خلايا أخرى (مثل خلايا MCF-7-GFP) في 20 ميكرولتر جل المصفوفة، التي تتألف من 15٪ RPMI المتوسطة و 85٪ هلام ECM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع المزيج مصفوفة MCF-7-جل في فاصل معدني معقم (3.8 مم) المتاخمة مباشرة إلى المنطقة القشرية من الدماغ شريحة عضوي النمط واحتضان لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الفاصل والسماح للورم كروي 3D لcoculture مع شريحة عضوي النمط ل24-96 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير ثقافة المتوسط ​​كل يوم. </li></ol> 3. المناعي تلطيخ الخلايا النجمية ودبقية في الدماغ شريحة عضوي النمط Coculture <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح عضوي النمط شريحة الدماغ coculture مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 8 ساعة عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coculture شريحة مع PBST (PBS مع 0.5٪ تريتون X-100) لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع قamples مع مصل الماعز العادية في PBST (1:20) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على الخلايا النجمية التي يحتضنها coculture شريحة الدماغ مع ييفي الدبقية الحمضية المضادة للبروتين وحيدة النسيلة الأجسام المضادة (GFAP، 1:200 في PBST) لمدة 36 ساعة في 4 درجات مئوية تليها الماعز المضادة للماوس TRITC (1:100 في PBST) تلطيخ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات مع PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على خلايا دبقية مع ILB 4 فلور اليكسا 647 (1:100 في PBST) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباين الدماغ شريحة coculture مع دابي (1:1،000) لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل وساترة الدماغ شريحة coculture مع DAKO الفلورسنت المتوسطة المتزايدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم درجة من غزو الورم على أساس نظام التهديف التالية: 0 = أي من الخلايا؛ + &lt;1/3؛ + + = 1/3 - 2/3؛ + + + ≥ 2/3 من الخلايا غزت (الأول قياس طول قسم الاتصال بين المكونات الورم وشريحة، ثم قياس fractioن الاتصال كشفها بواسطة الخلايا الغازية). </li></ol> 4. التصوير الحية من التفاعل بين الخلايا الدبقية وورم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء التجربة تحت المجهر لايكا مقلوب DMI 6000B 10X عدسة التكبير في وايكا DFC 350 FX كاميرا CCD. </li></ol>

<ol>
	<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seed+and+soil+hypothesis+revisited--the+role+of+tumor-stroma+interactions+in+metastasis+to+different+organs.">The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs.</a> Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).</li><li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+metastasis.">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-related+inflammation.">Cancer-related inflammation.</a> Nature. 454, 436-444 (2008).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+organ+microenvironment+in+brain+metastasis.">The role of the organ microenvironment in brain metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).</li><li>Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+enhance+the+invasion+potential+of+glioblastoma+stem-like+cells.">Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells.</a> PloS one. 8, e54752 (2013).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12, 895-904 (2006).</li><li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies.">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).</li><li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis.">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+and+neuronal+damage:+differential+effects+of+THC,+AEA+and+2-AG+on+activated+microglial+cells+and+degenerating+neurons+in+excitotoxically+lesioned+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).</li><li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures:+interface+method.">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li><li>Fuller, L., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rodent+hippocampal+slice+cultures.">Preparation of rodent hippocampal slice cultures.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4848 (2007).</li><li>Lorger, M., Felding-Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+changes+in+the+brain+microenvironment+during+initial+steps+of+breast+cancer+brain+metastasis.">Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis.</a> Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).</li><li>Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system:+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage.">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li><li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices.">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li><li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model.">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. , (2011).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J. Immunol. 188, 29-36 (2012).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).</li><li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2.">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li><li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases.">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li><li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+metastasis+to+a+sanctuary+site.">The biology of metastasis to a sanctuary site.</a> Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way.">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58, 1477-1489 (2010).</li><li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459, 1005-1009 (2009).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

أظهرت التحقيقات النسيجية السابقة من ورم خبيث في الدماغ تغيرات سريعة وجذرية من الخلايا الدبقية المقيمين، خاصة من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة 13. لدراسة هذه التغيرات والتفاعلات مع خلايا سرطان، وهذا النظام coculture الرواية هي مناسبة تماما. المجالات البحثية الأخرى لديها بالفعل خبرة طويلة مع عضوي النمط شرائح الدماغ الحصين. ميزة واحدة هي أن عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين الدماغ قابلة للبقاء والحفاظ على نحو فعال لعدة أيام إلى أسابيع، مما يجعلها مناسبة للتجارب طويلة الأجل. منذ بدء العمل ستوبيني للنظام عضوي النمط شريحة الحصين في عام 1991، وقد تم استخدامه على نطاق واسع، على سبيل المثال في مجال البحوث من الأمراض التنكسية. وبالتالي، فإن هذا النظام coculture الابتكار يمثل تعديل نهج راسخة مع مجموعة من التطبيقات في 9،11 البيولوجيا الورم. التعديل قدم لنا نموذجا استنساخه لتقييم درجة من غزو الورم بالعربيةهي مناسبة terwards والثقافات التي يزرعها أسلوب واجهة مثالي للتجارب التي تتطلب بنية ثلاثية الأبعاد. وقد استخدمت العديد من التقنيات لcoculture شرائح الحصين عضوي النمط مع الخلايا الأخرى. وتشمل هذه نظام غير المباشرة بين خلايا البلاعم وعضوي النمط شريحة الدماغ 14، وcoculture مباشرة من شريحتين مختلفة من منطقة الحصين 15. كما تم cocultured المجاميع دبقي مع شرائح الدماغ 16. هذه النماذج يمكن استخدامها لتحليل الأحداث الخلوية والجزيئية في شرائح الدماغ ولكن لا تسمح، الاتصال الفسيولوجية المباشرة بين الخلايا السرطانية، والخلايا الدبقية الصغيرة لحمة الدماغ. وعلاوة على ذلك، وهذا الأسلوب يسمح للمراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة دون التسبب في تلوث العظام المستمدة من نخاع المحيطية وحيدات / الضامة. استخدام CCR2 وCX3CR1 نموذج الفأر وراثيا هو تحسين الحرجة يرجع ذلك إلى حقيقة أنه من الصعب التمييز بين الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمين من غزو حيداتاستنادا إلى خصائصها مماثلة 17،18،19. على الرغم من حقن داخل المخ من خلايا سرطان يسمح بالتحقيق تطور الورم، فإنه لا يمكن أن أقول الكثير حول ما إذا كانت الخلايا الشبيهة بلعم تحيط تنشأ من السكان المقيمين الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ أو من العظام المستمدة من نخاع المحيطية وحيدات / الضامة 17. قدم فريق من Kettenmann على عضوي النمط شريحة الدماغ نموذج التي تشارك بتلقيح الخلايا دبقي إلى شرائح الدماغ مع مياداة مجهرية 20. ومع ذلك، الاورام الدبقية الخبيثة الأولية تختلف في نواح كثيرة من سرطان النقيلي. الأولى، الاورام الدبقية الخبيثة هي من أصل الوسيطة، لا تنتشر خارج الجهاز العصبي، وتهاجر / غزو الخلايا واحد كما هو الحال مع أي الحدود بين الورم وأنسجة المخ. على النقيض من ذلك، فإن النمو الارتشاحي هو سمة مرضية نموذجية، ومثل هذه السرطانات عادة ما تهاجر / غزو كما الأفواج. الثاني، سرطان في كثير من الأحيان في محاولة لإعادة بناء هياكل الظهارية في الدماغ، في حين أن الخلايا الدبقيةمحاولة لفصل الورم من أنسجة المخ من قبل (الزائفة) كبسولة. النظر في السمات البيولوجية والمورفولوجية، دبقي الخبيثة وورم خبيث من سرطان لا يمكن مقارنتها حقا. لهذه الأسباب، فإننا تعديل وتطوير نظام coculture حيث أننا لا حقن ولكن coculture المكونات خلية سرطان المتاخمة للشريحة الدماغ. وعلاوة على ذلك، لاحظنا دبقية وتراكم نجمي على الحدود بين المكونات الورم، وهذا يعني أن الخلايا الدبقية الصغيرة إدخال القابس الورم ويمكن اكتشافها بسهولة بواسطة المجهر مشرق الميدان وأكد بعد ذلك بواسطة المجهر متحد البؤر. غزو ​​الخلايا السرطانية في شريحة الدماغ، وهو مشابه إلى الوضع الحقيقي في الجسم الحي وإلى الملاحظة التي أبداها Baumert والزملاء، الذين وجدوا منطقة التسلل في 63٪ من الحالات تشريح الدماغ مع الانبثاث 21. بسبب التروية الدموية في عداد المفقودين، لا يوجد سوى الضامة المقيم / الخلايا الدبقية الصغيرة في هذه الثقافة. علاوة على ذلك، بسبب مخلايا T آيسنج، وبالتالي تغيب ألو-تفاعل، يمكن أن تستخدم خلايا سرطان الإنسان لcoculture حتى مع شرائح الدماغ من الفئران او الجرذان مناعيا (NMRI، B6، أو ويستار). هذه يمكن أن تكون بمثابة بديل للنموذج الفأر عارية. منذ 4-5 شرائح يمكن الحصول عليها من كل فأر، يطلب من انخفاض كبير أعداد الحيوانات، بالمقارنة مع النماذج حقن القائمة. بالإضافة إلى ذلك، الحيوانات لا تعاني لفترة طويلة من المرض المنتشر، وأنها لا تخضع للإجراءات المنطوق متكررة 22. مع هذا النظام coculture، لقد أثبتنا تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة من قبل الخلايا السرطانية وتعزيز قدرة غزو الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك، هذه هي المرة الأولى، على حد علمنا، تم العثور على الخلايا الدبقية الصغيرة لنقل بنشاط خلايا سرطان 23. على الرغم من كل هذه المزايا، نظام coculture، في الواقع، وأيضا القيود. فإنه لا يزال في المختبرنموذج المفقودين الخطوات من ورم خبيث قبل الاستعمار. بسبب عدم وجود التروية، فإنه ليس من الممكن لدراسة التسرب. وبالتالي، فإن طريقة بديلة لدراسة التسرب هو استخدام إما في الجسم الحي نموذج الحقن أو نظام غرفة بويدن تعديل مع المصفوفة خارج الخلية، وHUVEC الخلايا النجمية لتقليد حاجز الدم في الدماغ 22،24. طريقة coculture شريحة الدماغ لا يزال نموذجا موثوق بها وقابلة للتكرار مع العديد من المزايا والمحتملة لمجموعة واسعة من التطبيقات، مثل تحليل الاستعمار، ولا سيما مع التركيز على دور الخلايا المقيمين. الجمع مع التقنيات الأخرى المنشأة (مثل المناعية، متحد البؤر المجهري والوقت الفاصل بين المجهري) يدعم التحقيق في الخلية مباشرة الى خلية التفاعلات. وهو بديل سهل وتكامل التقنيات الأخرى ويتيح الوصول إلى التحقيق في العظة والآثار، التي تفرضها المكروية النقيلي.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt,Germany</td>
			<td>24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt , Germany</td>
			<td>32360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>PAA Laboratories Inc., C&#246;lbe, Germany</td>
			<td>E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Pan Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum (NHS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>10091148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>B. Braum, Melsungen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica SM 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>BD Falcon, Heidelberg,Germany</td>
			<td>353090</td>
			<td>transwell membrane insert (0.4 &#956;m pore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM gel</td>
			<td>Trevigen, R&#38;D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany</td>
			<td>3432-005-01</td>
			<td>Basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic spacer</td>
			<td>Kig GmbG, Kirkel, Germany</td>
			<td>DIN 433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-lapse microscope and camera</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomy microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>Stemi SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, F(ab&#39;)2- TRITC</td>
			<td>Santa Cruz, Heidelberg, Germany</td>
			<td>SC3796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>132450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride)</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent mounting medium</td>
			<td>DAKO, Glostrup, Denmark</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells

المرضى الذين يعانون من ورم خبيث من سرطان المخ ان يكون الفقراء التشخيص. ومع ذلك، فقد تم التحقيق بالكاد عملية في موقع المنتشر، ولا سيما دور المقيمين (اللحمية) الخلايا. تثبت الدراسات الأولية في سرطان تأثير المكروية على ورم خبيث، وحتى على التكهن 1،2. خصوصا الورم المرتبطة الضامة (TAM) الهجرة الدعم، والغزو وانتشار 3. ومن المثير للاهتمام، والمواقع المستهدفة الرئيسية من ورم خبيث تمتلك الضامة الأنسجة محددة، مثل خلايا كوبفر في الكبد أو الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي. وعلاوة على ذلك، فإن مواقع النقيلي تمتلك أيضا خلايا الأنسجة محددة أخرى، مثل الخلايا النجمية. مؤخرا، تم أثبتت الخلايا النجمية لتعزيز انتشار واستمرار الخلايا السرطانية 4،5. وبالتالي، وظائف من أنواع الخلايا الأنسجة محددة ويبدو أن هذه مهمة جدا في عملية الانبثاث الدماغ 6،7. على الرغم من هذه الملاحظات،ومع ذلك، وحتى الآن ليس هناك مناسبة في الجسم الحي / في المختبر نموذج المتاحة لتصور ردود الفعل مباشرة الدبقية خلال تشكيل ورم خبيث في الدماغ، ولا سيما عن طريق المجهر مشرق الميدان. مؤخرا في الجسم الحي التصوير حية من خلايا سرطان أظهرت سلوكهم الاستعمار الدماغي 8. ومع ذلك، وهذه الطريقة شاقة جدا ومكلفة ومعقدة تقنيا. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقييد هذه الأنواع من التجارب على الحيوانات لسلسلة صغيرة، وتأتي مع الإجهاد الكبير للحيوانات (عن طريق غرس لوحة الزجاج، وحقن من الخلايا السرطانية، والتخدير المتكررة والتثبيت على المدى الطويل). علاوة على ذلك، في الجسم الحي التصوير يقتصر حتى الآن على تصور من خلايا سرطان، في حين أن التفاعل مع الخلايا المقيمين لم يتم توضيح. أخيرا، والتحقيقات من خلايا سرطان الإنسان داخل الحيوانات مناعيا من المستحيل 8. لهذه الأسباب، أنشأنا consi نظام cocultureاللدغة من شريحة عضوي النمط مخ الفأر والخلايا الظهارية جزءا لا يتجزأ من matrigel (3D خلية المجال). تم وضع خلية سرطان المجالات 3D مباشرة بجوار حافة شريحة الدماغ من أجل التحقيق في غزو أنسجة المخ المجاورة. وهذا يتيح لنا أن تصور التغيرات المورفولوجية والتفاعلات بين الخلايا الدبقية وسرطان الخلايا بواسطة مضان وحتى من قبل مشرق المجهري الميدان. بعد التجربة coculture، وأنسجة المخ أو الخلايا الكروية 3D يمكن جمعها واستخدامها لمزيد من التحليلات الجزيئية (مثل QRT-PCR، IHC، أو طخة مناعية) فضلا عن التحقيقات التي المجهري متحد البؤر. هذه الطريقة يمكن تطبيقها على رصد الأحداث داخل أنسجة المخ تعيش لأيام دون الآثار الضارة للشرائح الدماغ. نموذج يسمح أيضا قمع انتقائية واستبدال خلايا المقيمين من قبل الخلايا من الأنسجة المانحة لتحديد أثر متميزة من راثى معين. أخيرا، فإن النموذج coculture هو بديل عمليالفي الجسم الحي النهج عند اختبار المعالجات الدوائية المستهدفة.

الأولى، وجميع خلايا سرطان المستخدمة (الإنسان: MCF-7 والفئران: 410.4) غزت عضوي النمط شريحة الدماغ الماوس. لذا كان غزو الأنواع المستقلة (الشكل 1A)، والذي يشير إلى وجود مجموعة واسعة من التطبيقات بطريقة مستقلة الأنواع. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا الدبقية الصغيرة وكذلك الخلايا النجمية التي تراكمت في واجهة كما هو موضح سابقا في الجسم الحي وعينات المرضى 13. الوقت الفاصل بين التصوير على مدى فترة طويلة من الزمن كشفت ليس فقط صلاحية شريحة ولكن أيضا قدمت منصة جيدة لمراقبة التفاعلات الخلوية. من خلال التجارب مرور الزمن، وسجلت خلايا دبقية لدخول مجال الخليوي أثناء 3D، بدوره، كما غزت الخلايا السرطانية شريحة الدماغ (أرقام 1B1-B2). وعلاوة على ذلك، لقد أظهرنا سابقا قدرة الخلايا الدبقية الصغيرة لنقل خلايا سرطان من خلال آلية تزال غامضة لمساعدة بذلك في غزو سرطان. باستخدام تقنيات وضع العلامات المناعي، ونحنووصف التعاون تعريب من الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية (مثل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية)، وكلاهما في أنسجة المخ والمكونات في الخلية السرطانية (أرقام 1C-D)، مما يشير إلى التفاعل الوثيق بين هذه الخلايا أثناء عملية الغزو. وقد تم الحصول على نتائج مماثلة عندما تم cocultured شرائح مخ الفأر إما مع (أرقام 1D1-D3) خلايا سرطان الإنسان (أرقام 1C1-C3) أو الفئران - تظهر مجموعة واسعة من التطبيقات لدراسة الخلايا من مختلف الأنواع والأنماط الجينية والسلالات. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> الشكل 1. الدماغ شريحة نموذج coculture مع كروي 3D من الماوس وخلايا سرطان الإنسان. A) الكمي لغزو الخلايا السرطانية في عضوي النمط كله cocultures شريحة الدماغ مع سرطان الثدي الماوسخط الخلية 410.4 أو خط خلايا سرطان الثدي البشرية MCF-7. تمثل البيانات النسبة المئوية للدرجة غزو الخلايا في الدماغ شريحة في كل مجموعة مع n ≥ 38. لم يكن هناك فرق كبير بين هاتين المجموعتين (كروسكال واليس اختبار). B) وصور في الوقت الفاصل بين عضوي النمط كله cocultures شريحة الدماغ مع خلايا MCF-7-GFP والصور ممثل من day2 (B1) ويوم 5 (B2) و أظهرت وأظهرت الصور المجهري CD) متحد البؤر الأفواج من السرطانات، النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة. تلطيخ ضعف الخلايا النجمية (مكافحة GFAP-TRITC والأحمر) والخلايا الدبقية الصغيرة (ILB4-اليكسا فلور 647، البنفسجي) من coculture كامل مع سميكة شريحة الدماغ عضوي النمط 350 ميكرون والورم المكونات الخلية transfected GFP (الخضراء): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) و 3D-410.4-GFP (D1-D3). أظهرت شرطات الأبيض حافة شريحة الدماغ والجبهة غزو الورم. تمثل القضبان نطاق 50 ميكرون. الخلايا الدبقية الصغيرة، النجمية والثانية الأورام colocalizations (C1 و D1)، النجمية أورام colocalizations (C2 و D2) والخلايا الدبقية الصغيرة colocalizations للورم (C3 و D3) في coculture شريحة. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a>

Watch this Scientific Journal Video about Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells at JoVE.com

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

وcoculture عضوي النمط شريحة الدماغ مع خلايا سرطان تمكن تصور التغيرات المورفولوجية التي كتبها مضان وكذلك حقل مشرق (فيديو) المجهري خلال عملية غزو الخلايا السرطانية للأنسجة المخ. هذا النظام يسمح أيضا نموذج لنهج الصرف الخلايا وتجديد، ويقدم مجموعة واسعة من التلاعب والتحليلات.

نظام Coculture مع عضوي النمط شريحة الدماغ و 3D كروي من خلايا سرطان

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

الثدي زرع الخلايا اللحمية وسرطان الخلايا في الفئران C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Intraoperative Detection of Subtle Endometriosis: A Novel Paradigm for Detection and Treatment of Pelvic Pain Associated with the Loss of Peritoneal Integrity

جراحة داخلية الكشف عن بطانة الرحم خفية: نموذج رواية لاكتشاف وعلاج آلام الحوض المصاحبة لفقدان النزاهة البريتوني

Endometriosis is a  common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic  pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

ماوس نموذج مثلي من سرطان الغدة الدرقية كشمي

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

تقييم سرطان المبيض كروي مرفق وغزو الخلايا الظهارية في الوقت الحقيقي

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

نظام عضوي إنتاجية عالية لتوصيف الدواء حساسية خلايا المايلوما المتعددة الابتدائية

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

ورم في المخ / شريحة عضوي النمط المشارك ثقافة النظام لدراسة ورم المكروية والمستهدفة المخدرات العلاجات

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

خلية السرطان كروي الفحص لتقييم الغزو في إعداد 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

A غليوبلاستوما الإنسان أورغانوتيبيك نموذج شريحة شريحة لدراسة هجرة الخلايا السرطانية والآثار الخاصة بالمريض من الأدوية المضادة للغزو

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

متماثل Bihemispheric تشريح الدماغ قطع لدراسة الصحية والمرضية شروط الدماغ في البشر

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...