Name: coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells
Uploaded: 2013-10-09T22:30:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells at JoVE.com

De auteurs danken Chalid Ghadban voor zijn uitstekende technische bijstand, Andreas Wodarz en Stephan Heermann voor hun technisch advies over de confocale en time-lapse microscopie. Er is geen belangenconflict voor een van de auteurs. Dit werk wordt gefinancierd door de Duitse Raad voor Onderzoek (DFG) in Project 2 van Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), door de Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Duitsland) en door het Onderzoeksprogramma van de Faculteit der Geneeskunde, Georg-August-Universität Göttingen, Duitsland.

Dit nieuwe model is een aanpassing van een eerder gepubliceerde organotypic hippocampus hersenen slice aanpak 9-12. Wijzigingen en toevoegingen werden ingevoerd om de kankercel-hersenweefsel interacties optimaliseren en reproduceerbaarheid te garanderen. De studie werd beoordeeld en door de lokale ethische commissie goedgekeurd. Dieren werden zorgvuldig behandeld volgens de richtlijnen voor de verzorging van de dieren aan de Universiteit Geneeskunde Göttingen. De organotypische hersenen slice coculture kan worden onderverdeeld in twee stappen. Stap een is de bereiding van de organotypische slice hersenen. Stap twee bestaat uit de tumorcel voorbereiding en afzetting in de co-cultuur model. 1. Organotypische Brain Slice <ol><li> Bereid de dissectie medium bestaat uit minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld met 0,2 mM glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine en 4,5 mg / ml glucose. </li><li> Onthoofden de muizen uit elke muizenstam tussen postnatale dagzes en acht (P6-8). </li><li> Verwijder de hersenen snel van de schedel onder aseptische omstandigheden en overbrengen naar ijskoud dissectie medium. </li><li> Verwijder de frontale pool en de kleine hersenen van de hele sectie hersenen. </li><li> Bevestig en stabiliseren de hersenen op een podium met cryo lijm en 5% agarose. </li><li> Snijd de hersenen secties horizontaal naar een 350 micrometer dikte met behulp van een vibratome. </li><li> Verzamel 05:56 gehele hersenen segmenten van een muizenhersenen, afhankelijk van de soort en leeftijd. </li><li> Bereid het kweekmedium bestaande uit 50% MEM, 25% Hanks &#39;gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), 25% normaal paardenserum (NHS), 0,2 mM glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine (Sigma, München, Duitsland) en 4,5 mg / ml glucose. </li><li> Zet elke organotypische plakje hersenen op een 0,4 um polycarbonaat transwell membraan insert in een zes-well plaat met 1 ml kweekmedium in de onderste ook. </li><li> Cultuur organotypische hersenenplakken overnachting in een humidified atmosfeer met 5% CO2 bij 37 ° C incubator. </li></ol> 2. De Slice Coculture Model <ol><li> Embed 10 5 van GFP getransfecteerde tumorcellen of andere cellen (bijv. MCF-7-cellen GFP) in 20 pl gelmatrix, bestaande uit 15% RPMI-medium en 85% ECM gel. </li><li> Plaats de MCF-7-gelmatrix mengsel in een steriele metalen spacer (3,8 mm) direct naast het corticale gebied van de organotypische slice hersenen en incubeer gedurende 2 uur. </li><li> Verwijder de spacer en laat de 3D tumor sferoïde om Coculture de organotypische slice voor 24-96 uur. </li><li> Veranderen om de andere dag het kweekmedium. </li></ol> 3. Immunofluorescentiekleuring van Astrocytes en Microgliale in de Organotypische Brain Slice Coculture <ol><li> Bevestig de organotypische hersenen slice coculture met 4% paraformaldehyde gedurende 8 uur bij 4 ° C. </li><li> Was het segment co-cultuur met PBST (PBS met 0,5% Triton X-100) gedurende 5 minuten. </li><li> Blokkeer de samples normale geit serum in PBST (1:20) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Vlekken astrocytes door incuberen van de hersenen segment co-cultuur met anti-gliale fibrillaire zure proteïne monoklonaal antilichaam (GFAP, 1:200 in PBST) gedurende 36 uur bij 4 ° C gevolgd door geit anti-muis TRITC (1:100 in PBST) kleuring gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Was de monsters met PBST driemaal gedurende 5 minuten. </li><li> Vlekken de microgliale cellen met ILB 4-Alexa Fluor 647 (1:100 in PBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Tegenkleuring de hersenen segment co-cultuur met DAPI (1:1000) gedurende 3 min bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Mount en dekglaasje de hersenen slice coculture met DAKO fluorescerende montage medium. </li><li> Evalueer de graad van tumorinvasie basis van het volgende scoresysteem: 0 = geen van de cellen; + &lt;1/3; + + = 1/3 - 2/3, + + + ≥ 2/3 van de binnengedrongen cellen (eerste meet de lengte van de sectie contact tussen de tumor plug en slice, meet vervolgens de fracn contact detecteerbaar door de binnenvallende cellen). </li></ol> 4. Live-Imaging van de interactie tussen gliale cellen en tumorcellen <ol><li> Voer het experiment in het kader van een Leica omgekeerde DMI 6000B microscoop bij een vergroting van 10x lens en een Leica DFC 350 FX CCD-camera. </li></ol>

<ol>
	<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seed+and+soil+hypothesis+revisited--the+role+of+tumor-stroma+interactions+in+metastasis+to+different+organs.">The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs.</a> Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).</li><li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+metastasis.">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-related+inflammation.">Cancer-related inflammation.</a> Nature. 454, 436-444 (2008).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+organ+microenvironment+in+brain+metastasis.">The role of the organ microenvironment in brain metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).</li><li>Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+enhance+the+invasion+potential+of+glioblastoma+stem-like+cells.">Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells.</a> PloS one. 8, e54752 (2013).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12, 895-904 (2006).</li><li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies.">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).</li><li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis.">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+and+neuronal+damage:+differential+effects+of+THC,+AEA+and+2-AG+on+activated+microglial+cells+and+degenerating+neurons+in+excitotoxically+lesioned+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).</li><li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures:+interface+method.">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li><li>Fuller, L., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rodent+hippocampal+slice+cultures.">Preparation of rodent hippocampal slice cultures.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4848 (2007).</li><li>Lorger, M., Felding-Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+changes+in+the+brain+microenvironment+during+initial+steps+of+breast+cancer+brain+metastasis.">Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis.</a> Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).</li><li>Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system:+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage.">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li><li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices.">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li><li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model.">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. , (2011).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J. Immunol. 188, 29-36 (2012).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).</li><li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2.">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li><li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases.">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li><li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+metastasis+to+a+sanctuary+site.">The biology of metastasis to a sanctuary site.</a> Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way.">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58, 1477-1489 (2010).</li><li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459, 1005-1009 (2009).</li></ol>

We hebben niets te onthullen.

Vorige histologische onderzoeken van cerebrale metastase aangetoond snelle en drastische veranderingen van de bewoner gliacellen, vooral van astrocyten en microglia 13. Om deze veranderingen en interacties met het carcinoom cellen te bestuderen, deze roman coculture systeem is zeer geschikt. Andere onderzoeksgebieden hebben al jarenlange ervaring met organotypische hippocampus hersenen plakjes. Een voordeel is dat de organotypische hippocampus hersenen slice culturen zijn levensvatbaar en effectief bewaard voor dagen tot weken, waardoor het geschikt is voor de lange termijn experimenten. Sinds Stoppini introductie van de organotypische hippocampus slice systeem 1991, is het op grote schaal gebruikt, bijvoorbeeld bij onderzoek degeneratieve ziekten. Zo, dit innoveren coculture systeem vertegenwoordigt een wijziging van een gevestigde aanpak met een scala aan toepassingen in de tumor biologie 9,11. De modificatie bood ons een reproduceerbaar model om de graad van de tumor invasie af te evaluerenterwards en culturen gekweekt door interfacemethode zijn uitermate geschikt voor experimenten die een driedimensionale structuur vereisen. Verschillende technieken zijn gebruikt om organotypische hippocampale plakken Coculture met andere cellen. Deze omvatten een indirect systeem van macrofaag-cellen en de organotypische hersenen slice 14 en een directe co-kweek van twee verschillende segmenten van de hippocampus gebied 15. Glioom aggregaten zijn ook gekweekt samen met hersencoupes 16. Deze modellen kunnen worden gebruikt voor het analyseren cellulaire en moleculaire gebeurtenissen in de hersenen plakjes maar direct, fysiologische contact tussen tumorcellen, microglia en het hersenparenchym niet mogelijk. Bovendien laat deze methode de observatie van microglia zonder verontreiniging van beenmerg afgeleide perifere monocyten / macrofagen. Het gebruik van CCR2 en CX3CR1 transgene muismodel kritisch verbetering vanwege het feit dat het moeilijk is om de resident microglia onderscheiden van invallende monocytenop basis van hun vergelijkbare woningen 17,18,19. Hoewel intracerebrale injectie van carcinoom cellen te onderzoeken van progressie van de tumor, het kan niet veel zeggen over de vraag of het omgeven macrofaag-achtige cellen afkomstig van de hersenen-resident microglia bevolking of van beenmerg afgeleide perifere monocyten / macrofagen 17. Het team van Kettenmann introduceerde een organotypische hersenen slice model dat betrokken inoculating glioma cellen in de hersenen plakjes met een micromanipulator 20. Echter, de primaire maligne gliomen verschillen in veel opzichten van metastatische carcinomen. Eerst maligne gliomen zijn van mesenchymale oorsprong, niet metastaseren buiten het zenuwstelsel en migreren / binnendringen als afzonderlijke cellen zonder grens tussen tumor en hersenweefsel. Daarentegen infiltratieve groei een typische pathologische kenmerk en dergelijke carcinomen meestal migreren / binnendringen als cohorten. Ten tweede, carcinomen vaak proberen epitheliale structuren bouwen in de hersenen, terwijl gliacellenproberen om de tumor te scheiden van het hersenweefsel door een (pseudo) capsule. Rekening houdend met biologische en morfologische kenmerken, maligne glioom en metastase van carcinomen zijn niet echt vergelijkbaar. Daarom hebben we gemodificeerd en ontwikkelde een gemengde cultuursysteem waar we niet injecteren maar coculture een carcinoom cel plug naast de hersenen slice. Verder zagen we microglia en astrocytaire accumulatie aan de rand van de tumor stekker, wat betekent dat microglia voer de tumor plug en kan gemakkelijk worden gedetecteerd door helder veld microscopie en later bevestigd door de confocale microscopie. De kankercellen binnen te dringen in de hersenen snede, vergelijkbaar met de werkelijke in vivo situatie en een opmerking van Baumert en collega&#39;s, die een infiltratiezone gevonden in 63% van de autopsie gevallen hersenmetastasen 21. Door de ontbrekende bloedperfusie, er slechts inwoner macrofagen / microglia in deze cultuur. Bovendien, vanwege de mIssing T-cellen en derhalve afwezig allo-reactiviteit, humane carcinoomcellen kunnen worden gebruikt voor co-cultuur zelfs hersenenplakken van immuuncompetente muizen of ratten (NMRI, B6 of Wistar). Dit zou kunnen dienen als alternatief voor de naakt muismodel. Aangezien 04:56 segmenten kunnen worden verkregen bij elke muis, aanzienlijk verminderd aantal benodigde dieren, in vergelijking met de bestaande modellen injectie. Daarnaast hebben de dieren niet lijden voor een lange periode van gemetastaseerde ziekte en ze niet operatieve procedures herhaaldelijk 22 ondergaan. Met deze gemengde cultuursysteem, hebben we de activering van microglia door kankercellen en bevorderen het vermogen van de kankercel invasie aangetoond. Bovendien is dit de eerste keer, voorzover ons bekend, microglia werden gevonden actief transport carcinoomcellen 23. Ondanks al deze voordelen, het gemengde cultuursysteem is inderdaad ook beperkingen. Het is nog een in vitromodelleren missen van de stappen van metastasering voorafgaand aan kolonisatie. Vanwege het gebrek aan perfusie, is het niet mogelijk om de extravasatie bestuderen. Dus een alternatieve manier om de extravasatie studie is om ofwel de in vivo injectie model of de gemodificeerde Boyden kamer systeem met extracellulaire matrix, HUVEC en astrocyten om de bloed-hersenbarrière 22,24 bootsen. De hersenen slice coculture werkwijze nog een betrouwbaar en reproduceerbaar model met vele voordelen en het potentieel voor een groot aantal toepassingen, zoals analyse van kolonisatie, met name met nadruk op de rol van de bewoner cellen. De combinatie met andere gevestigde technieken (zoals immunohistochemie, confocale microscopie en time-lapse microscopie) achter het onderzoek van directe cel-cel interacties. Het is een eenvoudig alternatief en aanvulling van andere technieken en biedt toegang tot het onderzoeksdossier van de signalen en effecten zoals opgelegd door de metastatische micromilieu.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt,Germany</td>
			<td>24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt , Germany</td>
			<td>32360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>PAA Laboratories Inc., C&#246;lbe, Germany</td>
			<td>E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Pan Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum (NHS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>10091148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>B. Braum, Melsungen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica SM 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>BD Falcon, Heidelberg,Germany</td>
			<td>353090</td>
			<td>transwell membrane insert (0.4 &#956;m pore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM gel</td>
			<td>Trevigen, R&#38;D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany</td>
			<td>3432-005-01</td>
			<td>Basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic spacer</td>
			<td>Kig GmbG, Kirkel, Germany</td>
			<td>DIN 433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-lapse microscope and camera</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomy microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>Stemi SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, F(ab&#39;)2- TRITC</td>
			<td>Santa Cruz, Heidelberg, Germany</td>
			<td>SC3796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>132450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride)</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent mounting medium</td>
			<td>DAKO, Glostrup, Denmark</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells

Patiënten met cerebrale metastasen van carcinomen hebben een slechte prognose. Echter, het proces van de metastatische site is nauwelijks onderzocht, met name de rol van de bewoner (stromale cellen). Studies primaire carcinomen tonen de invloed van het micromilieu op metastase, zelfs prognose 1,2. Vooral de tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) ondersteuning migratie, invasie en proliferatie 3. Interessant is dat de belangrijkste doelplaatsen van metastase bezitten weefselspecifieke macrofagen, zoals Kupffer-cellen in de lever of microglia in het CZS. Bovendien is de metastasen bezitten ook andere weefsel-specifieke cellen, zoals astrocyten. Recentelijk werd aangetoond dat astrocyten proliferatie en persistentie van kankercellen 4,5 bevorderen. Daarom functies van deze weefselspecifieke celtypes lijken erg belangrijk in het proces van hersenmetastasen 6,7. Ondanks deze opmerkingen,Echter, tot nu toe is er geen geschikte in vivo / in vitro model beschikbaar voor gliale reacties direct te visualiseren tijdens cerebrale metastase vorming, in het bijzonder door helder veld microscopie. Recente in vivo live-beeldvorming van carcinoom cellen toonden hun cerebrale kolonisatie gedrag 8. Deze werkwijze is zeer arbeidsintensief, kostbaar en technisch ingewikkeld. Bovendien zijn dit soort dierproeven beperkt tot kleine series en hebben een aanzienlijke stress bij de dieren (door implantatie van de glasplaat, injectie van tumorcellen, herhaalde anesthesie en langdurige fixatie). Verder wordt in vivo tot nu toe beperkt tot visualisatie van de carcinoomcellen, terwijl interacties met interne cellen nog niet zijn weergegeven. Tenslotte onderzoeken van menselijke carcinoom cellen in immunocompetente dieren zijn onmogelijk 8. Om deze redenen hebben we een gemengde cultuursysteem consisteek van een organotypische muizenhersenen slice en epitheliale cellen ingebed in matrigel (3D cel bol). De 3D carcinoomcellijn bolletjes werden direct naast de hersenen slice rand geplaatst om de invasie van de aangrenzende hersenweefsel te onderzoeken. Dit stelt ons in staat om morfologische veranderingen en interacties tussen de gliacellen en carcinoom cellen met behulp van fluorescentie en zelfs door helder veld microscopie visualiseren. Na de co-cultuur experiment, kan het hersenweefsel of 3D cel sferoïden worden verzameld en voor verdere moleculaire analyses (bijv. qRT-PCR, IHC of immunoblot) en voor onderzoek door confocale microscopie. Deze methode kan worden toegepast op de gebeurtenissen in een levend hersenweefsel dagen volgen zonder schadelijke effecten op de hersenen plakjes. Het model maakt het ook mogelijk de selectieve onderdrukking en vervanging van de ingezeten cellen door cellen van een donor weefsel aan de duidelijke invloed van een bepaald genotype te bepalen. Tenslotte, de co-cultuur model een bruikbaar alternatiefDe in vivo benaderingen bij het ​​testen gerichte farmacologische manipulaties.

Eerst worden alle gebruikte carcinoom cellen (humaan: MCF-7 en muizen: 410,4) vielen de organotypische muis hersenen slice. De invasie werd derhalve species-onafhankelijke (figuur 1A), die een breed scala van toepassingen in een soort-onafhankelijke wijze aangeeft. Bovendien, microglia en astrocyten gecumuleerde interface eerder beschreven in vivo en in patiëntenmonsters 13. Time-lapse imaging over een langere periode niet alleen bleek de levensvatbaarheid van de snede, maar bood ook een goed platform om de cellulaire interacties te observeren. Door tijdsverloop experimenten werden microgliacellen opgenomen 3D cel bol tijdens invoeren beurt kankercellen vielen ook de hersenen slice (Figuren 1B1-B2). Bovendien hebben we eerder aangetoond dat het vermogen van microglia aan carcinoomcellen vervoer door een nog raadselachtige mechanisme zo helpen bij het carcinoom invasie. Met immunofluorescentie labeling technieken, webeschreven co-lokalisatie van tumorcellen en stromale cellen (bijvoorbeeld microglia en astrocyten), zowel in het hersenweefsel en de tumorcel stekker (figuren 1C-D), suggereert een nauwe interactie tussen deze cellen tijdens de invasie proces. Vergelijkbare resultaten werden verkregen wanneer de muis hersenen plakjes werden gekweekt samen ofwel met menselijke (figuren 1C1-C3) of muizen (figuren 1D1-D3) carcinoom cellen - met de brede waaier van toepassingen voor het bestuderen van cellen van verschillende soorten, genotypes en stammen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Hersenen slice coculture model met een 3D spheroïde van muis en mens carcinoom cellen. A) Kwantificering van kankercel invasie in organotypische hele hersenen slice cocultures met een muis borstkankercellijn 410,4 of een menselijke borstkanker cellijn MCF-7. De gegevens geven het percentage van de mate van invasie in de hersenen segment in elke groep n ≥ 38. Er was geen significant verschil tussen deze twee groepen (Kruskal-Wallis test). B) Time-lapse beelden van organotypische hele brein slice cocultures met MCF-7-cellen GFP en representatieve beelden van day2 (B1) en dag 5 (B2) waren weergegeven. CD) Confocale microscopie toonde beelden cohorten van carcinomen, astrocyten en microglia. Dubbele kleuring van astrocyten (anti-GFAP-TRITC, rood) en microglia (ILB4-Alexa Fluor 647, violet) van het gehele co-cultuur met de 350 micrometer dikke organotypic hersenen slice en het GFP-getransfecteerde tumorcel stekker (groen): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) en 3D-410.4-GFP (D1-D3). Witte streepjes toonde de rand van de hersenen slice en de tumor invasie front. Schaalbalken vertegenwoordigen 50 micrometer. Microglia, astrocyten eennd tumoren colocalizations (C1 en D1), astrocyten-tumoren colocalizations (C2 en D2) en microglia-tumor colocalizations (C3 en D3) in het segment coculture. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a>

Watch this Scientific Journal Video about Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells at JoVE.com

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Het organotypische co-kweek met hersenplakjes carcinoomcellen kunnen visualiseren morfologische veranderingen van fluorescentie en helderveld (video) microscopie gedurende het proces van cel carcinoom invasie van hersenweefsel. Dit model systeem maakt het ook mogelijk voor mobiele uitwisseling en replenishment benaderingen en biedt een breed scala van manipulaties en analyses.

Coculture systeem met een Organotypische Brain Slice en 3D Sferoïde van carcinomacellen

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

Borstklieren transplantatie van stromale cellen en carcinoom cellen in C57BL/6J Muizen

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Intraoperative Detection of Subtle Endometriosis: A Novel Paradigm for Detection and Treatment of Pelvic Pain Associated with the Loss of Peritoneal Integrity

Intraoperatieve Detectie van Subtle endometriose: A Novel Paradigma voor opsporing en behandeling van bekkenpijn geassocieerd met het verlies van peritoneale Integriteit

Endometriosis is a  common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic  pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Een orthotope Muis Model van Anaplastisch Schildklier Carcinoom

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Evaluatie van eierstokkanker Sferoïde Hechting en Invasie van mesotheelcellen in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Een Organotypische High Throughput systeem voor de karakterisering van de Drug gevoeligheid van Primary Multiple Myeloma cellen

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Een hersentumor / organotypische Slice Co-cultuur voor het bestuderen tumor micro en Gerichte Drug therapieën

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Een humane glioblastoom organotypische snijcultuurmodel voor de studie van tumorcellenmigratie en patiëntspecifieke effecten van anti-invasieve medicijnen

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Symmetrische Bihemispheric postmortaal Brain snijden om gezond en pathologisch Brain Voorwaarden-studie bij mensen

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...