Name: coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells
Uploaded: 2013-10-09T22:30:00
Duration: 7 min 48 s
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Les auteurs remercient Chalid Ghadban pour son excellente assistance technique, Andreas Wodarz et Stephan Heermann pour leurs conseils techniques concernant la microscopie confocale et time-lapse. Il n&#39;y a pas de conflit d&#39;intérêts pour l&#39;un des auteurs. Ce travail est financé par le Conseil de recherches en allemand (DFG) dans le projet 2 de Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), par les Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Allemagne) et par le Programme de recherche de la Faculté de médecine, Georg-Août-Université de Göttingen, en Allemagne.

Ce nouveau modèle est une adaptation d&#39;une approche organotypique hippocampe de tranches de cerveau déjà publié 9-12. Modifications et ajouts ont été introduites pour optimiser les interactions du tissu des cellules cancéreuses du cerveau et à garantir la reproductibilité. L&#39;étude a été examiné et approuvé par le comité d&#39;éthique local. Les animaux ont été traités avec soin selon les lignes directrices pour les soins des animaux à la médecine de l&#39;Université de Göttingen. La tranche de cerveau organotypique co-culture peut être subdivisé en deux étapes. La première étape est la préparation du cerveau organotypique. La deuxième étape comprend la préparation de cellules tumorales et de dépôt dans le modèle de co-culture. Une. Organotypique tranche de cerveau <ol><li> Préparer le milieu de dissection constitué par un milieu essentiel minimum (MEM) additionné de glutamine de 0,2 mM, 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine et 4,5 mg / ml de glucose. </li><li> Décapiter la souris de toute souche de souris entre le jour postnatalsix et huit (P6-8). </li><li> Retirer le cerveau du crâne rapidement dans des conditions aseptiques et le transférer à un milieu de dissection glacée. </li><li> Retirer le pôle frontal et le cervelet à partir de la section de cerveau entier. </li><li> Fixer et stabiliser le cerveau sur une scène avec de la colle cryo et 5% d&#39;agarose. </li><li> Couper les coupes de cerveau horizontalement à une épaisseur de 350 um en utilisant un vibratome. </li><li> Recueillir quatre à six tranches de cerveau entier à partir d&#39;un cerveau de souris unique, selon l&#39;espèce et l&#39;âge. </li><li> Préparer le milieu de culture constitué de 50% MEM, une solution saline équilibrée de 25% de Hanks (HBSS), 25% de sérum de cheval normal (NHS), mM de glutamine 0,2, 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine (Sigma, Munich, Allemagne), et 4,5 mg / ml de glucose. </li><li> Mettre chaque tranche de cerveau organotypique um sur un polycarbonate Transwell insert de membrane de 0,4 dans une plaque à six puits avec 1 ml de milieu de culture dans le puits inférieur. </li><li> Culture organotypique tranches de cerveau pendant la nuit dans un humidified atmosphère à 5% de CO2 à 37 ° C incubateur. </li></ol> 2. Le modèle Slice Coculture <ol><li> Incorporer 10 de 5 tumeur de la GFP-transfecté ou d&#39;autres cellules (par exemple cellules MCF-7-GFP) dans 20 ul de matrice de gel, consistant en 15% de milieu RPMI et ECM gel de 85%. </li><li> Placer le mélange matrice MCF-7-gel dans une entretoise métallique stérile (diamètre 3,8 mm) directement adjacente à la région corticale du cerveau organotypique et incuber pendant 2 heures. </li><li> Retirer l&#39;entretoise et laissez le sphéroïde tumeur 3D à co-culture avec la tranche organotypique de 24-96 heures. </li><li> Changer le milieu de culture tous les jours. </li></ol> 3. Immunofluorescence des astrocytes et la microglie dans le cerveau organotypique de tranche Coculture <ol><li> Fixer la tranche de cerveau organotypique co-culture avec du paraformaldéhyde 4% pendant 8 heures à 4 ° C. </li><li> Laver la co-culture de la tranche avec du PBST (PBS avec 0,5% de Triton X-100) pendant 5 min. </li><li> Bloquer les sexemples avec du sérum de chèvre normal dans du PBST (01:20) à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Colorer les astrocytes en incubant la co-culture de section de cerveau avec fibrillaire gliale anti-acide d&#39;anticorps monoclonal de protéine (GFAP, 1:200 dans PBST) pendant 36 heures à 4 ° C suivi d&#39;anticorps de chèvre anti-souris-TRITC (1:100 dans PBST) coloration pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver avec du PBST les échantillons à trois reprises pendant 5 min. </li><li> Colorer les cellules microgliales avec ILB 4 Alexa Fluor 647 (1:100 en PBS) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Contre-colorer la tranche de cerveau coculture avec du DAPI (1:1000) pendant 3 min à température ambiante. </li><li> Mont et lamelle la tranche de cerveau co-culture avec DAKO fluorescent milieu de montage. </li><li> Évaluer la qualité de l&#39;invasion de la tumeur sur la base du système de notation suivant: 0 = aucune des cellules; + &lt;1/3; + + = 1/3-2/3; + + + ≥ 2/3 des cellules envahies (première mesurer la longueur de la section de contact entre la prise de la tumeur et la tranche, puis mesurer le fractionnementn contact détectable par les cellules envahissantes). </li></ol> 4. Imagerie en direct de l&#39;interaction entre les cellules gliales et cellules tumorales <ol><li> Effectuer l&#39;expérience dans un Leica inversé DMI 6000B microscope à 10X lentille de grossissement et un Leica DFC 350 FX caméra CCD. </li></ol>

<ol>
	<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seed+and+soil+hypothesis+revisited--the+role+of+tumor-stroma+interactions+in+metastasis+to+different+organs.">The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs.</a> Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).</li><li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+metastasis.">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-related+inflammation.">Cancer-related inflammation.</a> Nature. 454, 436-444 (2008).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+organ+microenvironment+in+brain+metastasis.">The role of the organ microenvironment in brain metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).</li><li>Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+enhance+the+invasion+potential+of+glioblastoma+stem-like+cells.">Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells.</a> PloS one. 8, e54752 (2013).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12, 895-904 (2006).</li><li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies.">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).</li><li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis.">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rodent+hippocampal+slice+cultures.">Preparation of rodent hippocampal slice cultures.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4848 (2007).</li><li>Lorger, M., Felding-Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+changes+in+the+brain+microenvironment+during+initial+steps+of+breast+cancer+brain+metastasis.">Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis.</a> Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).</li><li>Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system:+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage.">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li><li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices.">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li><li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model.">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. , (2011).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J. Immunol. 188, 29-36 (2012).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).</li><li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2.">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li><li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases.">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li><li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+metastasis+to+a+sanctuary+site.">The biology of metastasis to a sanctuary site.</a> Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way.">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58, 1477-1489 (2010).</li><li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459, 1005-1009 (2009).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Histologiques précédentes de métastases cérébrales ont montré des changements rapides et drastiques des cellules gliales résidentes, en particulier des astrocytes et la microglie 13. Pour étudier ces changements et les interactions avec les cellules de carcinome, ce nouveau système de co-culture est bien adapté. D&#39;autres domaines de recherche ont déjà une expérience de longue date avec des tranches de cerveau organotypiques d&#39;hippocampe. Un avantage est que les cultures d&#39;hippocampe de tranches de cerveau organotypiques sont viables et efficacement conservée pendant plusieurs jours à plusieurs semaines, ce qui convient pour des expériences à long terme. Depuis l&#39;introduction de Stoppini du système de coupe d&#39;hippocampe organotypique en 1991, il a été largement utilisé, par exemple dans la recherche des maladies dégénératives. Ainsi, ce système de co-culture de innover représente une modification d&#39;une approche bien établie avec une gamme d&#39;applications de la biologie de la tumeur 9,11. La modification nous a offert un modèle reproductible pour évaluer la qualité de l&#39;invasion tumorale afet ensuite précieusement cultures cultivées par le procédé d&#39;interface sont parfaitement adaptées pour des expériences qui nécessitent une structure tridimensionnelle. Plusieurs techniques ont été utilisées pour co-cultiver des tranches hippocampiques organotypiques avec d&#39;autres cellules. Ceux-ci comprennent un système indirect entre les cellules macrophages et le cerveau organotypique 14, et une co-culture directe des deux tranches différentes de la région hippocampique 15. agrégats de gliome ont aussi été co-cultivées avec des tranches de cerveau 16. Ces modèles peuvent être utilisés pour analyser les événements cellulaires et moléculaires dans les tranches de cerveau, mais ne permettent pas, contactez physiologique directe entre les cellules tumorales, la microglie et le parenchyme cérébral. En outre, ce procédé permet l&#39;observation de la microglie, sans contamination de la moelle osseuse dérivées des monocytes / macrophages périphériques. L&#39;utilisation du modèle de souris transgénique CCR2 et CX3CR1 constitue une amélioration essentielle en raison du fait qu&#39;il est difficile de distinguer la microglie résidente d&#39;envahir les monocytesen fonction de leurs propriétés similaires 17,18,19. Bien que l&#39;injection intracérébrale de cellules de carcinome permet d&#39;instruction progression de la tumeur, il ne peut pas dire autant que de savoir si les cellules de type macrophage entouré proviennent de la population de la microglie du cerveau-résident ou de dérivées de moelle osseuse périphériques monocytes / macrophages 17. L&#39;équipe de Kettenmann introduit un modèle de tranche de cerveau organotypique qui a impliqué l&#39;inoculation des cellules de gliome dans des tranches de cerveau avec un micromanipulateur 20. Toutefois, les gliomes malins primaires diffèrent à bien des égards de carcinomes métastatiques. Tout d&#39;abord, les gliomes malins sont d&#39;origine mésenchymateuse, ne métastasent pas en dehors du système nerveux, et migrent / envahir les cellules comme simples sans frontière entre la tumeur et le tissu cérébral. En revanche, la croissance d&#39;infiltration est une caractéristique pathologique typique, et les carcinomes généralement migrer / envahir que les cohortes. Deuxièmement, les carcinomes essaient souvent de reconstruire les structures épithéliales dans le cerveau, tandis que les cellules glialesessayer de séparer la tumeur à partir du tissu cérébral par une (pseudo) capsule. Considérant les caractéristiques biologiques et morphologiques, gliome malin et les métastases des cancers ne sont pas vraiment comparables. Pour ces raisons, nous avons modifié et développé un système de co-culture où nous n&#39;avons pas coculture injectons mais un bouchon de cellules de carcinome à côté de la tranche de cerveau. En outre, nous avons observé microgliale et astrocytaire accumulation à la frontière de la fiche de la tumeur, ce qui signifie que les microglies pénètrent dans le bouchon de la tumeur et peuvent être facilement détectés par microscopie sur fond clair et par la suite ont confirmé par microscopie confocale. Les cellules cancéreuses envahissent dans la tranche de cerveau, ce qui est comparable au réel de la situation in vivo et à une observation faite par Baumert et ses collègues, qui ont trouvé une zone d&#39;infiltration dans 63% des cas d&#39;autopsie avec métastases cérébrales 21. En raison de la perfusion sanguine manquant, il n&#39;y a que résident macrophages / microglie dans cette culture. En outre, en raison de la mcellules T Issing et, par conséquent, en l&#39;absence allo-réactivité, les cellules de carcinome humain pourraient être utilisés pour co-culture, même avec des tranches de cerveau de souris ou de rats immunocompétents (IRM, B6, ou Wistar). Cela pourrait servir d&#39;alternative au modèle de souris nude. Etant donné que quatre à cinq tranches peuvent être obtenus à partir de chaque souris, un nombre significativement réduit d&#39;animaux sont tenus, en comparaison avec les modèles existants d&#39;injection. De plus, les animaux ne souffrent pas pendant une longue période de la maladie métastatique et qu&#39;ils ne subissent pas d&#39;interventions chirurgicales à répétition 22. Avec ce système de co-culture, nous avons démontré l&#39;activation de la microglie par les cellules cancéreuses et la capacité de promouvoir l&#39;invasion des cellules cancéreuses. En outre, c&#39;est la première fois, à notre connaissance, la microglie ont été trouvés pour transporter activement des cellules de carcinome 23. Malgré tous ces avantages, le système de co-culture a, en effet, aussi les limites. Il est encore in vitromodéliser les étapes manquantes de métastases avant la colonisation. En raison de l&#39;absence de perfusion, il n&#39;est pas possible d&#39;étudier l&#39;extravasation. Ainsi, la voie alternative pour étudier l&#39;extravasation est d&#39;utiliser soit le modèle in vivo par injection ou le système de chambre de Boyden modifiée avec la matrice extracellulaire, des astrocytes et des cellules HUVEC pour imiter la barrière hémato-encéphalique 22,24. La méthode de co-culture de section de cerveau est encore un modèle fiable et reproductible avec de nombreux avantages et un potentiel pour une grande variété d&#39;applications, telles que l&#39;analyse de la colonisation, en particulier en mettant l&#39;accent sur le rôle des cellules résidentes. La combinaison avec d&#39;autres techniques établies (comme l&#39;immunohistochimie, microscopie confocale et la microscopie time-lapse) prend en charge l&#39;étude des interactions directes de cellule à cellule. C&#39;est une alternative et la complémentation des autres techniques facile et offre un accès à l&#39;enquête sur les indices et les effets comme imposées par le microenvironnement métastatique.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt,Germany</td>
			<td>24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt , Germany</td>
			<td>32360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>PAA Laboratories Inc., C&#246;lbe, Germany</td>
			<td>E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Pan Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum (NHS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>10091148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>B. Braum, Melsungen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica SM 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>BD Falcon, Heidelberg,Germany</td>
			<td>353090</td>
			<td>transwell membrane insert (0.4 &#956;m pore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM gel</td>
			<td>Trevigen, R&#38;D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany</td>
			<td>3432-005-01</td>
			<td>Basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic spacer</td>
			<td>Kig GmbG, Kirkel, Germany</td>
			<td>DIN 433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-lapse microscope and camera</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomy microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>Stemi SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, F(ab&#39;)2- TRITC</td>
			<td>Santa Cruz, Heidelberg, Germany</td>
			<td>SC3796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>132450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride)</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent mounting medium</td>
			<td>DAKO, Glostrup, Denmark</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells

Les patients atteints de métastases cérébrales de carcinomes ont un mauvais pronostic. Cependant, le processus sur le site métastatique a été à peine étudié, en particulier le rôle du résident (stromales) cellules. Des études chez des carcinomes primaires démontrent l&#39;influence du microenvironnement sur ​​les métastases, même sur le pronostic 1,2. En particulier les macrophages associés aux tumeurs (TAM) migration de soutien, l&#39;invasion et la prolifération 3. Fait intéressant, les principaux sites cibles de la métastase possèdent des macrophages spécifiques d&#39;un tissu, telles que les cellules de Kupffer dans le foie ou la microglie dans le SNC. En outre, les sites métastatiques possèdent également d&#39;autres cellules spécifiques d&#39;un tissu, comme les astrocytes. Récemment, les astrocytes ont été démontrées pour favoriser la prolifération et la persistance des cellules cancéreuses 4,5. Par conséquent, les fonctions de ces types de cellules spécifiques d&#39;un tissu semblent être très important dans le processus de métastase cérébrale 6,7. En dépit de ces observations,Toutefois, jusqu&#39;à présent, il n&#39;y a pas convenable modèle in vivo / in vitro à la disposition de visualiser directement les réactions gliales lors de la formation de métastases cérébrales, en particulier par microscopie en champ clair. Récente imagerie in vivo en direct de cellules de carcinome démontré leur comportement de colonisation cérébrale 8. Cependant, cette méthode est très laborieux, coûteux et techniquement complexe. En outre, ces sortes d&#39;expériences sur des animaux sont limitées à de petites séries et sont livrés avec une contrainte importante pour les animaux (par l&#39;implantation de la plaque de verre, l&#39;injection de cellules tumorales, l&#39;anesthésie répétitif et la fixation à long terme). Par ailleurs, l&#39;imagerie in vivo est limitée à ce jour à la visualisation des cellules de carcinome, alors que des interactions avec des cellules résidentes n&#39;ont pas encore été illustrée. Enfin, les enquêtes sur les cellules de carcinome humain dans les animaux immunocompétents sont impossibles 8. Pour ces raisons, nous avons établi un système de consi coculturepiqûre d&#39;une tranche de cerveau de souris et des cellules épithéliales organotypique intégré dans matrigel (sphère de cellules 3D). Les sphères carcinome de cellules 3D ont été placées directement à côté du bord de section de cerveau afin d&#39;étudier l&#39;invasion du tissu cérébral voisin. Cela nous permet de visualiser les changements morphologiques et les interactions entre les cellules gliales et les cellules de carcinome par fluorescence et même par microscopie en champ clair. Après l&#39;expérience de co-culture, les tissus cérébraux ou les sphéroïdes de cellules 3D peuvent être collectées et utilisées pour d&#39;autres analyses moléculaires (par exemple qRT-PCR, IHC, ou immunoblot) ainsi que pour les enquêtes par microscopie confocale. Cette méthode peut être appliquée pour surveiller les événements dans un tissu cérébral vivant pour les jours sans effets préjudiciables sur les tranches de cerveau. Le modèle permet également la suppression sélective et le remplacement des cellules résidentes par les cellules d&#39;un tissu du donneur afin de déterminer l&#39;impact distinct d&#39;un génotype donné. Enfin, le modèle de co-culture est une alternative possible,pour les approches in vivo lors de l&#39;essai manipulations pharmacologiques ciblées.

Tout d&#39;abord, toutes les cellules de carcinome utilisées (humaines: MCF-7 et murins: 410,4) ont envahi le cerveau organotypique de la souris. L&#39;invasion était donc espèces indépendants (figure 1A), ce qui indique un large éventail d&#39;applications de manière indépendante de l&#39;espèce. En outre, la microglie ainsi que les astrocytes accumulées à l&#39;interface, comme décrit précédemment in vivo et dans des échantillons de patients 13. Imagerie time-lapse sur une longue période de temps, non seulement révélé la viabilité de la tranche, mais a également offert une bonne plate-forme pour observer les interactions cellulaires. Par des expériences time-lapse, les cellules microgliales ont été enregistrés à entrer dans la sphère 3D de la cellule tandis que, à son tour, les cellules cancéreuses ont également envahi la tranche de cerveau (figures 1B1-B2). De plus, nous avons précédemment montré la capacité de la microglie pour transporter des cellules de carcinome par un mécanisme encore énigmatique pour aider de ce fait dans l&#39;invasion de carcinome. En utilisant des techniques de marquage par immunofluorescence, nousdécrit des co-localisations de cellules tumorales et des cellules stromales (par exemple, la microglie et les astrocytes), à la fois dans les tissus du cerveau et dans le bouchon de la cellule tumorale (Figures 1C-D), ce qui suggère une interaction étroite entre ces cellules au cours du processus d&#39;invasion. Des résultats comparables ont été obtenus lorsque des tranches de cerveau de souris ont été co-cultivées soit avec (figures 1D1-D3) des cellules de carcinome humain (figures 1C1-C3) ou murine - montrant la large gamme d&#39;applications pour l&#39;étude des cellules de différentes espèces, génotypes et souches. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> Figure 1. Tranche de cerveau modèle de co-culture avec un sphéroïde 3D ​​de souris et des cellules de carcinome humain. A) La quantification de l&#39;invasion de cellules cancéreuses dans des co-cultures organotypiques ensemble de tranches de cerveau avec un cancer du sein de la sourisLignée cellulaire 410.4 ou d&#39;une lignée cellulaire de cancer du sein humain MCF-7. Les données représentent le pourcentage de la mesure de l&#39;invasion de cellules dans le cerveau tranche dans chaque groupe avec n ≥ 38. Il n&#39;y avait pas de différence significative entre ces deux groupes (test de Kruskal-Wallis). B) images de time-lapse de organotypiques entiers co-cultures de tranches de cerveau avec des cellules MCF-7-GFP et des images représentatives de day2 (B1) et le jour 5 (B2) ont été montré. CD) confocale images de microscopie ont montré cohortes de carcinomes, les astrocytes et la microglie. Double coloration des astrocytes (anti-GFAP-TRITC, rouge) et la microglie (ILB4-Alexa Fluor 647, violet) de l&#39;ensemble de co-culture avec le 350 um d&#39;épaisseur tranche de cerveau organotypique et le bouchon de la cellule tumorale GFP transfectées (vert): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) et 3D-410.4-GFP (D1-D3). Des traits blancs ont montré le bord de la tranche de cerveau et le front de l&#39;invasion tumorale. Barres d&#39;échelle représentent 50 um. Microglies, des astrocytes unee tumeurs colocalisations (C1 et D1), les astrocytes-tumeurs colocalisations (C2 et D2) et colocalisations microglie-tumorales (C3 et D3) dans la co-culture de la tranche. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a>

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Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

La co-culture organotypique de tranche de cerveau avec des cellules de carcinome permet la visualisation des changements morphologiques par fluorescence, ainsi que champ lumineux (vidéo) microscopie pendant le processus d&#39;invasion cellulaire de carcinome du tissu cérébral. Ce système permet également de modèle pour change de cellule et de réapprovisionnement des approches et offre une grande variété de manipulations et analyses.

Système de co-culture avec un cerveau organotypique et 3D sphéroïde de cellules de carcinome

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