Name: coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells
Uploaded: 2013-10-09T22:30:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells at JoVE.com

המחברים מודים Chalid Ghadban לסיועו הטכני המעולה, אנדראס Wodarz וסטפן Heermann לייעוץ הטכני שלהם לגבי confocal ומיקרוסקופיה הזמן לשגות. אין ניגוד עניינים לכל אחד מהכותבים. עבודה זו ממומנת על ידי מועצת המחקר הגרמנית (DFG) בפרויקט 2 של Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), על ידי Dres. באייר-Stiftung (אדן Württembergischer Krebspreis, גרמניה) ועל ידי תכנית המחקר של הפקולטה לרפואה, גיאורג אוגוסט-אוניברסיטת גטינגן שבגרמניה.

זה דגם חדש הוא עיבוד של גישת פרוסת המוח בהיפוקמפוס organotypic שפורסמה בעבר 9-12. שינויים ותוספות הוכנסו כדי לייעל את אינטראקציות רקמת סרטן תאי מוח ועל מנת להבטיח שחזור. המחקר נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית. טופלו בעלי חיים בזהירות על פי ההנחיות לטיפול בבעלי החיים בגטינגן לרפואה באוניברסיטה. Coculture פרוסת מוח organotypic אפשר לחלק לשני שלבים. שלב הראשון הוא ההכנה של פרוסת מוח organotypic. שלב שני כולל את הכנת תאים הסרטניים ותצהיר במודל coculture. 1. Organotypic מוח פרוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום לנתיחה בהיקף של מדיום המינימום ההכרחי (MEM), בתוספת 0.2 גלוטמין מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, ו4.5 מ&quot;ג / מיליליטר של גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העכברים מכל זן עכבר בין יום הלידהשישה ושמונה (P6-8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח במהירות מהגולגולת בתנאי aseptic ולהעביר אותו למדיום לנתיחה קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוט הקדמי ובמוח קטן מכל החלק במוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן ולייצב את המוח על במה עם דבק cryo וagarose 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את החלקים במוח בצורה אופקית בעובי 350 מיקרומטר באמצעות vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 5:56 פרוסות מוח כולו ממוח עכבר אחת, בהתאם למין וגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התרבות בינונית בהיקף של MEM 50%, פתרון 25% הנקס &#39;מאוזן מלח (HBSS), 25% בסרום סוס רגיל (NHS), 0.2 גלוטמין מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין (Sigma, מינכן, גרמניה), וגלוקוז 4.5 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את כל פרוסה מוח organotypic על הוספת קרום 0.4 מיקרומטר פוליקרבונט transwell בצלחת שש היטב עם 1 מיליליטר של מדיום גידול בנמוך יותר טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לילה פרוסות מוח organotypic התרבות בhumidifieאווירת ד עם 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. דגם Slice Coculture <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע 10 5 של גידול-transfected GFP או תאים אחרים (תאים למשל MCF-7-GFP) ב20 מטריצת ג&#39;ל μl, בהיקף של 15% מדיום RPMI ו85% ג&#39;ל ECM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תערובת מטריצת MCF-7-ג&#39;ל לspacer סטרילי המתכתי (קוטר 3.8 מ&quot;מ) ישירות בסמוך לאזור בקליפת המוח של פרוסת מוח organotypic ו דגירה במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את spacer ולאפשר אליפטית גידול 3D לcoculture עם פרוסת organotypic ל24-96 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את מדיום התרבות בכל יום אחר. </li></ol> 3. הכתמה Immunofluorescence של האסטרוציטים וmicroglial בOrganotypic המוח פרוס Coculture <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן coculture פרוסת מוח organotypic עם paraformaldehyde 4% במשך 8 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coculture פרוסה עם PBST (PBS עם 0.5% טריטון X-100) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את יםamples עם סרום נורמלי עז בPBST (1:20) בטמפרטורת חדר במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים את האסטרוציטים ידי דוגרים coculture פרוסת המוח עם נוגדן fibrillary נגד גליה חומצי חד שבטי חלבון (GFAP, 1:200 בPBST) ל36 שעות ב 4 ° C ואחרי עז אנטי עכבר TRITC (1:100 בPBST) מכתים במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הדגימות עם פעמים PBST שלוש למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם תאי microglial עם ILB 4-Alexa פלואוריד 647 (1:100 בPBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain coculture מוח פרוסה עם DAPI (1:1,000) במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההר וcoverslip coculture פרוסת המוח עם מדיום הרכבה ניאון DAKO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הכיתה של פלישת גידול המבוסס על שיטת הניקוד הבאה: 0 = אף אחד מהתאים; + &lt;1/3; + + = 1/3 - 2/3; + + + ≥ 2/3 מהתאים פלשו (ראשון למדוד את אורכו של קשר הקטע שבין התוספת הגידול ופרוס, ולאחר מכן למדוד את fraction מגע לזיהוי על ידי התאים הפולשים). </li></ol> 4. הדמיה חיה של האינטראקציה בין גליה ותאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הניסוי מתחת לייקה הפוך מיקרוסקופ DMI 6000B ב10X עדשת הגדלה ומצלמת CCD 350 FX היקה DFC. </li></ol>

<ol>
	<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seed+and+soil+hypothesis+revisited--the+role+of+tumor-stroma+interactions+in+metastasis+to+different+organs.">The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs.</a> Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).</li><li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+metastasis.">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-related+inflammation.">Cancer-related inflammation.</a> Nature. 454, 436-444 (2008).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+organ+microenvironment+in+brain+metastasis.">The role of the organ microenvironment in brain metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).</li><li>Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+enhance+the+invasion+potential+of+glioblastoma+stem-like+cells.">Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells.</a> PloS one. 8, e54752 (2013).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12, 895-904 (2006).</li><li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies.">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).</li><li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis.">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+and+neuronal+damage:+differential+effects+of+THC,+AEA+and+2-AG+on+activated+microglial+cells+and+degenerating+neurons+in+excitotoxically+lesioned+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).</li><li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures:+interface+method.">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li><li>Fuller, L., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rodent+hippocampal+slice+cultures.">Preparation of rodent hippocampal slice cultures.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4848 (2007).</li><li>Lorger, M., Felding-Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+changes+in+the+brain+microenvironment+during+initial+steps+of+breast+cancer+brain+metastasis.">Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis.</a> Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).</li><li>Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system:+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage.">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li><li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices.">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li><li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model.">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. , (2011).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J. Immunol. 188, 29-36 (2012).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).</li><li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2.">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li><li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases.">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li><li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+metastasis+to+a+sanctuary+site.">The biology of metastasis to a sanctuary site.</a> Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way.">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58, 1477-1489 (2010).</li><li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459, 1005-1009 (2009).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

חקירות היסטולוגית קודמות של גרורות במוח הראו שינויים מהירים ודרסטי של תאי גליה תושב, במיוחד של האסטרוציטים ומיקרוגליה 13. ללמוד את השינויים האלה ואת אינטראקציות עם קרצינומה של התאים, מערכת coculture רומן הזה היא גם מתאימה. כבר יש לי תחומי מחקר אחרים ניסיון ארוך שנים עם פרוסות מוח בהיפוקמפוס organotypic. אחד יתרונות הוא שהתרבויות הפרוסה המוח בהיפוקמפוס organotypic הן קיימא והיעילות השתמרה במשך ימים עד שבועות, מה שהופך אותו מתאים לניסויים לטווח ארוך. מאז ההשקה של Stoppini של המערכת הפרוסה בהיפוקמפוס organotypic ב1991, זה היה בשימוש נרחב, למשל במחקר של מחלות ניווניות. לפיכך, מערכת coculture לחדש זה מייצגת שינוי של גישה מבוססת היטב עם מגוון רחב של יישומים ב9,11 ביולוגיה גידול. השינוי הציע לנו מודל לשחזור כדי להעריך את הציון של af פלישת גידולterwards ותרבויות גדלו בשיטת הממשק מתאימות בצורה אידיאלית לניסויים הדורשים מבנה תלת ממדים. כמה טכניקות שנוצלו כדי coculture פרוסות בהיפוקמפוס organotypic עם תאים אחרים. אלה כוללים מערכת עקיפה בין תאי מקרופאג ופרוסת מוח organotypic 14, וcoculture ישיר של שתי פרוסות שונות מהאזור בהיפוקמפוס 15. אגרגטים גליומה יש גם cocultured עם פרוסות מוח 16. מודלים אלה יכולים לשמש כדי לנתח את האירועים תאיים ומולקולריים בפרוסות המוח, אבל לא מאפשרים מגע ישיר, פיסיולוגי בין תאים סרטניים, מיקרוגליה וparenchyma המוח. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת התצפית של מיקרוגליה ללא זיהום של מונוציטים / מקרופאגים היקפיים המופק ממוח עצם. השימוש במודל עכבר מהונדס CCR2 וCX3CR1 הוא שיפור קריטי בשל העובדה שקשה להבחין מיקרוגליה תושב מפולשים מונוציטיםהמבוסס על המאפיינים דומים שלהם 17,18,19. למרות הזרקה תוך מוחית של קרצינומה של תאים מאפשרת חוקרת התקדמות גידול, שהוא לא יכול להגיד הרבה, האם התאים כמו מקרופאג-המוקף מקורן אוכלוסיית מיקרוגליה מוח תושב או ממונוציטים / מקרופאגים שמקורם במח עצם היקפיים 17. צוות של Kettenmann הציג מודל פרוסת מוח organotypic כי המעורבים ייחסו תאי גליומה לפרוסות מוח עם micromanipulator 20. עם זאת, גליומות הממארת הראשונית שונה בהרבה דרישת שלום מקרצינומות גרורתי. ראשית, גליומות הממארת הן ממוצא mesenchymal, לא לשלוח גרורות מחוץ למערכת העצבים, ולהעביר / לפלוש לתאים בודדים כללא גבול בין גידול ורקמת המוח. לעומת זאת, צמיחת infiltrative היא מאפיין פתולוגי טיפוסי, וקרצינומות כזו בדרך כלל להעביר / לפלוש כקבוצות. שנית, קרצינומות לעתים קרובות מנסות לבנות מחדש את מבני אפיתל במוח, ואילו תאי גלייהמנסה להפריד את הגידול מרקמת המוח על ידי כמוסה (פסאודו). בהתחשב בתכונות ביולוגיות ומורפולוגיים, גליומה וגרורות של קרצינומות הממאירות הן לא ממש דומות. מסיבות אלה, אנו שונה ופיתחו מערכת coculture בו אנחנו לא coculture להזריק אבל התוספת תא קרצינומה סמוכה לפרוסת המוח. יתר על כן, צפינו microglial וצבירת astrocytic בגבול של התוספת הגידול, כלומר, מיקרוגליה להיכנס לתוספת הגידול וניתן היה לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר ואישרו לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה confocal. התאים הסרטניים לפלוש לתוך פרוסת המוח, שהוא דומה לאמיתי במצב vivo ולתצפית שנעשתה על ידי Baumert ועמיתיו, שמצאו את אזור חדירה ב63% מהמקרים ניתוח שלאחר המוות במוחה גרורות 21. בגלל טפטוף הדם החסר, יש רק מקרופאגים / מיקרוגליה תושב בתרבות זו. יתר על כן, בגלל מ &#39;תאי issing T, ולכן נעדרו allo-תגובתיות, קרצינומה של תאים אנושיים יוכל לשמש עבור coculture אפילו עם פרוסות מוח של עכברים עם מערכת חיסון או חולדות (NMRI, B6, או Wistar). זה יכול לשמש כתחליף לעכבר מודל העירום. מאז ניתן להשיג 4:56 פרוסות מכל עכבר, מספרים מופחתים באופן משמעותי של בעלי חיים נדרשים, בהשוואה לדגמי הזרקה הקיימת. בנוסף, בעלי החיים לא סובלים לתקופה של מחלה גרורתית ארוכה והם לא עוברים תהליכים אופרטיביים שוב ושוב 22. עם מערכת coculture זה, יש לנו הפגין ההפעלה של מיקרוגליה על ידי תאים סרטניים ואת היכולת של קידום פלישת תאי הסרטן. בנוסף, זו הפעם הראשונה, למיטב ידיעתנו, מיקרוגליה נמצאו להובלה באופן פעיל בתאי קרצינומה 23. למרות כל היתרונות הללו, מערכת coculture יש, אכן, גם מגבלות. זה עדיין במבחנהמודל חסר השלבים של גרורות לפני קולוניזציה. בגלל חוסר זלוף, לא ניתן ללמוד את extravasation. לפיכך, הדרך החלופית ללמוד extravasation היא להשתמש גם in vivo המערכת הקאמרית בוידן הותאם מודל הזרקה או עם מטריצה ​​תאית, HUVEC והאסטרוציטים לחקות את מחסום דם מוח 22,24. שיטת coculture פרוסת המוח היא עדיין מודל אמין לשחזור עם יתרונות רבים ופוטנציאל למגוון רחב של יישומים, כגון ניתוח של התישבות, בפרט עם דגש על תפקידם של תאי תושב. שילוב עם טכניקות אחרות שהוקמו (כגון אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופיה confocal ומיקרוסקופיה הזמן לשגות) תומך בחקירה של אינטראקציות תא אל התא ישירים. זוהי חלופה קלה ושלמה של טכניקות אחרות, ומציעה גישה לחקירה של הרמזים ואפקטים כמו שהוטלו על ידי microenvironment גרורתי.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt,Germany</td>
			<td>24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt , Germany</td>
			<td>32360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>PAA Laboratories Inc., C&#246;lbe, Germany</td>
			<td>E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Pan Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum (NHS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>10091148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>B. Braum, Melsungen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica SM 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>BD Falcon, Heidelberg,Germany</td>
			<td>353090</td>
			<td>transwell membrane insert (0.4 &#956;m pore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM gel</td>
			<td>Trevigen, R&#38;D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany</td>
			<td>3432-005-01</td>
			<td>Basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic spacer</td>
			<td>Kig GmbG, Kirkel, Germany</td>
			<td>DIN 433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-lapse microscope and camera</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomy microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>Stemi SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, F(ab&#39;)2- TRITC</td>
			<td>Santa Cruz, Heidelberg, Germany</td>
			<td>SC3796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>132450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride)</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent mounting medium</td>
			<td>DAKO, Glostrup, Denmark</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells

יש חולים עם גרורות במוח של קרצינומות פרוגנוזה גרועה. עם זאת, התהליך באתר גרורתי בקושי נחקר, במיוחד את תפקידו של תושב תאים (סטרומה). מחקרים בקרצינומות העיקרית להדגים את ההשפעה של microenvironment על ​​גרורות, אפילו על 1,2 הפרוגנוזה. במיוחד מקרופאגים הגידול משויכים (TAM) הגירת תמיכה, פלישה והתפשטות 3. מעניין לציין, כי אתרי המטרה העיקריים של גרורות ברשות מקרופאגים רקמות ספציפיות, כגון תאי Kupffer בכבד או מיקרוגליה במערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, האתרים גרורתי גם להחזיק תאי רקמה ספציפית אחרים, כמו האסטרוציטים. לאחרונה, האסטרוציטים הודגמו לטפח התפשטות והתמדה של תאים סרטניים 4,5. לכן, נראה שפונקציות של סוגי תאי רקמות ספציפיות אלה כדי להיות חשובים מאוד בתהליך של 6,7 גרורות במוח. למרות תצפיות אלה,עם זאת, עד עכשיו אין מתאים in vivo / במבחנה מודל זמין ישירות לדמיין תגובות גליה במהלך היווצרות גרורה במוח, בפרט על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר. אחרונים בתחום ההדמיה לחיות vivo של תאי קרצינומה הפגין קולוניזציה ההתנהגות המוחית שלהם 8. עם זאת, שיטה זו היא מאוד מייגע, יקרה ומורכבת מבחינה טכנית. בנוסף, סוגים של ניסויים בבעלי חיים אלה מוגבלים לסדרות קטנות ומגיעים עם לחץ משמעותי עבור בעלי החיים (על ידי השתלה של צלחת הזכוכית, הזרקה של תאים סרטניים, הרדמה חוזרת וקיבוע לטווח ארוך). יתר על כן, in vivo הדמיה מוגבלת עד כה להדמיה של תאי הסרטן, ואילו אינטראקציות עם תאי תושב טרם מאוירות. לבסוף, חקירות של קרצינומה של תאים אנושיים בבעלי חיים עם מערכת חיסון הן בלתי אפשריים 8. מסיבות אלה, הקמנו consi מערכת cocultureעוקץ של פרוסה organotypic עכבר מוח ותאי האפיתל המוטבע בmatrigel (מרחב תא 3D). תחומי תא קרצינומה 3D הונחו ישירות ליד קצה פרוסת המוח כדי לחקור את הפלישה של רקמת המוח הסמוכה. זה מאפשר לנו לחזות שינויים מורפולוגיים ויחסי גומלין בין תאי גליה וקרצינומה של התאים על ידי הקרינה ואפילו על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר. לאחר ניסוי coculture, רקמת המוח או הספרואידים תא 3D יכולה להיות שנאספו ומשמשת לניתוחים נוספים מולקולריים (למשל qRT-PCR, IHC, או immunoblot), כמו גם לחקירות על ידי מיקרוסקופיה confocal. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי לפקח על האירועים בתוך רקמת מוח חי במשך ימים בלי השפעות מזיקות לפרוסות המוח. המודל גם מאפשר דיכוי והחלפה של תאי תושב על ידי תאים מרקמות תורמות כדי לקבוע את ההשפעה מובהקת של גנוטיפ נתון סלקטיבית. לבסוף, מודל coculture הוא אלטרנטיבה מעשיתלin vivo גישות כאשר בודקים מניפולציות תרופתי ממוקדות.

ראשית, כל התאים המשמשים קרצינומה (אנושי: MCF-7 והעכבריים: 410.4) פלשו פרוסת מוח עכבר organotypic. הפלישה הייתה אפוא מינים עצמאיים (איור 1 א), אשר מצביעה על מגוון רחב של יישומים באופן מינים עצמאיים. בנוסף, מיקרוגליה, כמו גם האסטרוציטים שנצברו בממשק כפי שתואר לעיל in vivo ו בדגימות מטופל 13. זמן לשגות הדמיה על פני תקופה ממושכת של זמן חשפה לא רק את הכדאיות של הפרוסה, אלא גם הציעה פלטפורמה טובה כדי לבחון את האינטראקציות הסלולר. על ידי ניסויי זמן לשגות, תאי microglial נרשמו להיכנס תוך מרחב תא 3D, בתורו, תאי הסרטן פלשו גם פרוסת המוח (איורים 1B1-B2). יתר על כן, יש לנו הראינו בעבר את היכולת של מיקרוגליה להובלת קרצינומה של תאים על ידי מנגנון עדיין חידתי כדי לסייע בכך בפלישת קרצינומה. באמצעות שימוש בטכניקות תיוג immunofluorescence, אנחנותאר שיתוף מגויר של תאים סרטניים ותאי סטרומה (למשל מיקרוגליה ואסטרוציטים), שניהם ברקמת המוח ובתוספת של תאי גידול (איורים 1C-D), המצביעים על יחסי גומלין הדוקים בין תאים אלה במהלך תהליך הפלישה. תוצאות דומות התקבלו כאשר פרוסות מוח העכבר היו cocultured או עם אדם (איורים 1C1-C3) או עכברי קרצינומה של תאים (איורים 1D1-D3) - מראה את מגוון הרחב של יישומים לחקר תאים ממינים שונים, גנוטיפים וזנים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> איור 1. מודל מוח פרוס coculture עם אליפטית 3D של עכבר וקרצינומה של תאים אנושיים. א) כימות של פלישת תאים סרטנית בcocultures פרוסת המוח כל organotypic עם סרטן שד בעכברשורת תאים 410.4 או שורת תאי סרטן שד אנושית MCF-7. הנתונים מייצגים את אחוז את מידת פלישת תא למוח פרוס בכל קבוצה עם ≥ n 38. לא היה הבדל משמעותי בין שתי קבוצות אלה (מבחן קרוסקל-ארהב). ב &#39;) זמן לשגות תמונות של cocultures פרוסת המוח כל organotypic עם תאי MCF-7-GFP ותמונות מייצגות מday2 (B1) ויום 5 (B2) היו מוצג. תמונות מיקרוסקופיה CD) Confocal הראו קבוצות של קרצינומות, האסטרוציטים ומיקרוגליה. צביעה כפולה של האסטרוציטים (אנטי GFAP-TRITC, אדום) ומיקרוגליה (ILB4-Alexa פלואוריד 647, סגול) של כל coculture עם 350 מיקרומטר פרוסה עבה organotypic המוח ותוספת transfected GFP גידול התאים (הירוקה): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) ו3D-410.4-GFP (D1-D3). מקפים לבנים הראו הקצה של פרוסת המוח ומול פלישת גידול. ברים סולם מייצגים 50 מיקרומטר. מיקרוגליה, האסטרוציטיםnd colocalizations גידולים (C1 ו-D1), colocalizations האסטרוציטים-גידולים (C2 ו-D2) וcolocalizations מיקרוגליה גידול (C3 ו-D3) בcoculture פרוסה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר</a>

Watch this Scientific Journal Video about Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells at JoVE.com

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Coculture פרוסת מוח organotypic עם קרצינומה של תאים מאפשר לדמיין שינויים מורפולוגיים על ידי הקרינה וכן בתחום בהיר מיקרוסקופיה (וידאו) במהלך התהליך של פלישת תא קרצינומה של רקמת המוח. מערכת מודל זה מאפשרת גם להחלפת תאים וחידוש גישות ומציעה מגוון רחב של מניפולציות וניתוחים.

מערכת Coculture עם מוח פרוס Organotypic ו3D אליפטית של קרצינומה של תאים

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

השתלה של תאים סטרומה החלב ותאי קרצינומה של עכברים C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Intraoperative Detection of Subtle Endometriosis: A Novel Paradigm for Detection and Treatment of Pelvic Pain Associated with the Loss of Peritoneal Integrity

איתור intraoperative של אנדומטריוזיס העדין: פרדיגמה חדשה לאיתור וטיפול בכאב באגן הקשורים לפגיעה בשלמות פריטונאלית

Endometriosis is a  common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic  pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

מודל עכבר orthotopic של קרצינומה של בלוטת התריס אנפלסטית

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

גידול במוח / Organotypic Slice משותף תרבות מערכת לימוד microenvironment גידול וממוקד תרופות טיפולים

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

A Glioblastoma האדם דגם תרבות פרוסה Organotypic לחקר גידול תאים סרטניים ואפקטים ספציפיים לחולה של תרופות אנטי פולשניות

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

סימטרי Bihemispheric לאחר מות מוח חיתוך לחקר בריא והגבלות מוח פתולוגיים בבני אדם

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...