Name: use of phluorin to assess the dynamics of axon guidance receptors in cell culture and in the chick embryo
Uploaded: 2014-01-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo at JoVE.com

אנו מודים להומאירה נוואבי, פרדריק מורט ואיזבל סניאס על עזרתם. עבודה זו נתמכת על ידי CNRS, האגודה פרנסיס contre les מיופתיות (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA כדי V.C.; C.D-B ו- A.J נתמכים על ידי מלגות לה ליגה קונטרה לה סרטן Labex DevWeCan, בהתאמה.

1. אסטרטגיית שיבוט לתיוג קולטן PlexinA1 עם pHluorin
<ol><li>בחר וקטור ביטוי מתאים כעמוד שדרה(למשל, קולטן העכבר plexinA1 מבטא וקטור, מתנה מעין של ד"ר אנדריאס פושל11). הערה: וקטור plexinA1 זה תוכנן כדי להשיג החדרת קולטן יעילה HA- או VSV מתויג בקרום הפלזמה.</li>
	<li>להגביר על ידי PCR את רצף קידוד pHluorin האקליפטי ב...

<ol>
	<li>Winckler, B., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+guidance+receptors.">Trafficking guidance receptors.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li><li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).</li><li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system:+how+to+cross+the+midline.">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li><li>Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comm+function+in+commissural+axon+guidance:+cell-autonomous+sorting+of+Robo+in+vivo.">Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).</li><li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates.">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapto-pHluorins:+genetically+encoded+reporters+of+synaptic+transmission.">Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).</li><li>Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+axonal+pathways+of+genetically+defined+groups+of+neurons+in+the+chick+neural+tube+utilizing+in+ovo+electroporation.">Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation.</a> J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos.">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), (2007).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+of+miRNA-based+plasmids+in+the+developing+neural+tube+and+assessment+of+phenotypes+by+DiI+injection+in+open-book+preparations.">In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li><li>Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin/neuropilin+complexes+mediate+repulsion+by+the+axonal+guidance+signal+semaphorin+3A.">Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A.</a> Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J. Vis. Exp. (8), (2007).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+actin+control+polarized+expression+of+TI-VAMP+vesicles+to+neuronal+growth+cones+and+their+fusion+with+the+plasma+membrane.">Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+endosomes:+how+many+varieties+and+why.">Evolving endosomes: how many varieties and why.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li><li>Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+clathrin-mediated+endocytosis+drives+repulsive+growth+cone+guidance.">Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance.</a> Neuron. 66, 370-377 (2010).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).</li><li>Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+role+for+synaptojanin+1+in+rod+and+cone+photoreceptors.">Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors.</a> J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).</li><li>Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+local+circuits+and+their+implications+for+olfactory+processing+in+the+fly+antennal+lobe.">Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe.</a> Cell. 128, 601-612 (2007).</li><li>Dittman, J. S., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+regulating+the+abundance+and+localization+of+synaptobrevin+in+the+plasma+membrane.">Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).</li><li>Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+neuronal+activity+by+targeted+expression+of+a+genetically+encoded+probe+in+the+mouse.">In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse.</a> Neuron. 42, 9-21 (2004).</li><li>Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+vesicle-SNARE+recycling+in+synapses+of+the+central+nervous+system.">Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system.</a> Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).</li><li>Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+cell+labeling+for+cell+tracing+in+avian+development.">Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development.</a> CSH Protoc.. 2008, (2008).</li><li>Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+variants+as+ratiometric+dual+emission+pH+sensors.+1.+Structural+characterization+and+preliminary+application.">Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application.</a> Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).</li><li>Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+refinement+of+vesicle+cycling+at+schaffer+collateral+synapses.">Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses.</a> Neuron. 77, 1109-1121 (2013).</li><li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pHTomato,+a+red,+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity.">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).</li><li>de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li></ol>

פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב כדי לעקוב אחר הדינמיקה של קולטן הדרכה אקסון הן בתרבות התא והן בהקשר ההתפתחותי של חוט השדרה עובר אפרוח.
כדי לעצב חלבון מתויג דה נובו pHluorin, שתי נקודות צריך להילקח בחשבון לגבי אסטרטגיית השיבוט. ראשית, תג pHluorin צריך להיחשף לומן של אנדוזומים ח...

במהלך הניווט שלהם, אקסונים משלבים רמזים סביבתיים מרובים המנחים אותם לעבר המטרה שלהם. רמזים אלה להפעיל קולטני הדרכה על פני השטח של מסופי אקסון, קונוסים הצמיחה, אשר בתורו ליזום מסלול איתות מתאים. לכן, הרגולציה הזמנית והמרחבית של התפלגות פני התא של הקולטנים היא קריטית כדי להגדיר את הרגישות של חרוט הצמיחה1. בהקשר זה, חציית קו האמצע על ידי אקסונים קומיסרים היא מודל מצוין לחקור את הרגולציה של רמות פני התא הקולטן. בחוט השדרה המתפתח, אקסונים קומיסרים נמשכים בתחילה לכיוון צלחת הרצפה הגחונית שבה הם חוצים את קו האמצע. לאחר חציית הגבול, הם מאבדים את ההיענות שלהם למשיכת צלחת הרצפה ולקבל תגובה דוחי צלחת הרצפה, כך שהם יכולים לצאת צלחת הרצפה לנווט לכיוון היעד הסופי שלהם בצד הנגדי של מערכת העצבים2,3. ויסות זמינות הקולטן על משטח חרוט הצמיחה הוא אחד המנגנונים שבבסיס המתג של היענות רמזים קו האמצע4,5. לכן, ניטור סלקטיבי של הקולטנים נוכח קרום הפלזמה של קונוסים צמיחה הוא בעל חשיבות עליונה. אנו מתארים כאן שיטה המבוססת על מאפיין פלואורסצנטי תלוי pH של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) גרסה כדי לדמיין באופן ספציפי את קולטני הדרכה אקסון הממוענים קרום פלזמה במבחנה in vivo, בחוט השדרה אפרוח המתפתח.
רוטמן ועמיתיו מהונדסים על ידי מוטציות נקודתיות גרסאות רגישות pH של GFP כולל pHluorin האקליפטי6. pHluorin האקליפטי יש את המאפיין של להיות nonfluorescent כאשר נחשף pH חומצי (<6), תוך היותו פלואורסצנטי ב- pH ניטרלי. זה מאפשר להבחין קולטנים שאינם פלואורסצנטיים מקומיים בתאים חומציים תאיים(כלומר אנדוזומים, סחר בשלפוחיות) מקולטנים פלואורסצנטיים המשולבים בקרום הפלזמה ובכך נחשפים ל- pH ניטרלי חוץ-תאי7. ניצלנו זאת כדי לנטר את לוקליזציית קרום הפלזמה של plexinA1, קולטן הדרכה אקסון המתווך את תגובת חרוט הצמיחה לסמפורין דוחה קו האמצע 3B5 (איור 1A). אנו מתארים כאן אפיון במבחנה של מבנה pHluorin-plexinA1, יחד עם ב- ovo electroporation8-10 של מבנה זה בחוט השדרה אפרוח המתפתח ואחריו ניתוח מיקרוסקופי של cryosections המאפשרים לעקוב אחר הדינמיקה קולטן הדרכה אקסון ב vivo עם רזולוציות מרחביות וטמפורליות כאחד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1007">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">COS7 cells</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:219px;">CRL-1651</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">DMEM GlutaMAX</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:264px;">Exgen500 reagent</td>
			<td style="width:147px;">Euromedex Fermentas</td>
			<td style="width:219px;">ET0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">PBS -Ca2+ -Mg2+</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fast green dye</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">32% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscopy</td>
			<td style="width:219px;">15714-S</td>
			<td>Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryomount</td>
			<td style="width:147px;">Histolab</td>
			<td style="width:219px;">00890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Hoechst 34580</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:219px;">H21486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:219px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Bottom-glass 35 mm dish</td>
			<td style="width:147px;">MatTek</td>
			<td style="width:219px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">5 ml Syringe</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">SS-05S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Needles 0.9 mm x 25 mm</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">NN-2025R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Capillaries</td>
			<td style="width:147px;">CML</td>
			<td style="width:219px;">PP230PO</td>
			<td>capillaries are stretched manually in the flame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4951PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Microscalpel</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">10316-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">Dumont #5 REF#11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Equipment/software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Time lapse microscope</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:219px;">Observer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Temp module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">CO2 module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:147px;">Metamorph</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Eggs incubator</td>
			<td style="width:147px;">Sanyo</td>
			<td style="width:219px;">MIR154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electroporator apparatus</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electrodes</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY611P7-4</td>
			<td>4 mm platinum electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td style="width:147px;">LEICA</td>
			<td style="width:219px;">MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryostat</td>
			<td style="width:147px;">MICROM</td>
			<td style="width:219px;">HM550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;">FV1000, X81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluoview software</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CLC Main Workbench software</td>
			<td style="width:147px;">CLC Bio</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of phluorin to assess the dynamics of axon guidance receptors in cell culture and in the chick embryo

במהלך הפיתוח, קולטני הדרכה אקסון לשחק תפקיד מכריע בוויסות רגישות אקסונים רמזים אטרקטיביים ודוחה כאחד. ואכן, הפעלת קולטני ההנחיה היא הצעד הראשון של מנגנוני האיתות המאפשרים לאקסון טיפים, קונוסים לצמיחה, להגיב לליגנדים. ככזה, אפנון הזמינות שלהם על פני התא הוא אחד המנגנונים המשתתפים בקביעת רגישות חרוט הצמיחה. אנו מתארים כאן שיטה כדי לדמיין במדויק את הדינמיקה פני השטח של תא spatio-temporal של קולטן הדרכה אקסון הן במבחנה in vivo בחוט השדרה אפרוח המתפתח. ניצלנו את מאפיין הפלואורסצנטיות תלוי ה- pH של וריאנט חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כדי לזהות באופן ספציפי את השבר של קולטן ההנחיה של האקסון הממוען לקרום הפלזמה. אנו מתארים לראשונה את אימות במבחנה של מבנים תלויי pH כאלה ואנו מפרטים עוד יותר את השימוש בהם ב- vivo, באקורד עמוד השדרה של הגוזל, כדי להעריך את הדינמיקה המרחבית-טמפורלית של קולטן ההדרכה של האקסון.

<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1.jpg"> איור 1. א. ערכת תכונות הפלואורסצנטיות pHluorin-plexinA1 בהקשר סלולרי. PHluorin הוא nonfluorescent בתאים תאיים שבהם ה- pH הוא חומצי (<6) כגון בסחר בשלסים או באנדוזומים והוא פלואורסצנטי כאשר נחשף ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo at JoVE.com

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

אנו מתארים כאן את השימוש בגרסת חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש pH, pHluorin, כדי לחקור את הדינמיקה המרחבית-זמנית של קולטני הדרכה אקסון סחר על פני התא. הקולטן pHluorin מתויג מתבטא הן בתרבות התא in vivo, באמצעות electroporation של העובר אפרוח.

שימוש pHluorin כדי להעריך את הדינמיקה של קולטני הדרכה אקסון בתרבות התא בעובר אפרוח

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

השימוש של התניה קלאסית Eyeblink מעקב כדי להעריך תפקוד בהיפוקמפוס במודל של עכברים של אלכוהול עוברית ספקטרום הפרעות

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...