Name: culture of isolated floor plate tissue and production of conditioned medium to assess functional properties of floor plate-released signals
Uploaded: 2014-02-11T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals at JoVE.com

نشكر كارين Kindbeiter، مورييل بوزون، وفلوري رينو لمساعدتهم. ويدعم هذا العمل من قبل CNRS، برنامج وكالة الاستخبارات الوطنية يودا وLabex DevWeCan.

DAY 1 1. تشريح الحبل الشوكي الدور لوحة (FP) من E12.5 أجنة الفئران ملاحظة: يتطلب هذا الإجراء بأكمله استخدام ظروف معقمة. فمن الأفضل لإجراء تشريح تحت غطاء تشريح لتجنب التلوث. يجب تنظيف السطح من هو?...

<ol>
	<li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system:+how+to+cross+the+midline.">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li><li>Placzek, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+floor+plate:+multiple+cells,+multiple+signals.">The floor plate: multiple cells, multiple signals.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).</li><li>Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).</li><li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates.">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li><li>Ruiz de Almodovar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+mediates+commissural+axon+chemoattraction+through+its+receptor+Flk1.">VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1.</a> Neuron. 70, 966-978 (2011).</li><li>Charoy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gdnf+activates+midline+repulsion+by+Semaphorin3B+via+NCAM+during+commissural+axon+guidance.">gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance.</a> Neuron. 75, 1051-1066 (2012).</li><li>Kiecker, C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+organizers+in+patterning+the+nervous+system.">The role of organizers in patterning the nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).</li><li>Le Dreau, G., Marti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+of+the+neural+tube:+a+tale+of+three+signals.">Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals.</a> Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+collaborates+with+netrin-1+to+guide+axons+in+the+spinal+cord.">The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord.</a> Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).</li><li>Bechara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAK-MAPK-dependent+adhesion+disassembly+downstream+of+L1+contributes+to+semaphorin3A-induced+collapse.">FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse.</a> EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).</li></ol>

إنتاج الأرض وحة مكيفة المتوسطة يوفر وسيلة فعالة وسهلة لتقييم الخصائص البيولوجية لوحة الطابق إشارات الافراج عنهم. مصفوفة البلازما الثرومبين يوفر حالة ممتازة للبقاء الأنسجة. ومع ذلك، هذه البيئة المخصب قد يكون وجود قيود لبعض أنوا?...

في لوحة الأرض هي مركز الزخرفة المعروفة من الحبل الشوكي النامي، ولعب دورا رئيسيا في تحديد الأسلاف والأنساب خلية تالية للتفتل والسيطرة على محور عصبي الملاحة 7،8. إجراء التجارب وصفها هنا لإنتاج FP سم يسمح للمحققين لتقييم الخصائص الفنية للإشارات المشتقة من الكلمة لوحة في سياقات مختلفة من العمليات التنموية، من الزخرفة الخلية والبقاء على قيد الحياة إلى الخلية والهجرة محور عصبي. لتوضيح استخدام هذه FP سم، يتم تشريح الأنسجة الحبل الشوكي الظهري تحتوي على الخلايا العصبية صواري، dilacerated وحفز مع FP سم. ويمكن بعد ذلك معالجة الأنسجة لتحليل لطخة غربية. وهذا يسمح التحقيق أنظمة آلية التوجيه محوار بواسطة الكلمة لوحة إشارات الافراج عنهم. طريقة العلاج من الأنسجة الطازجة dilacerated يحمل ميزة كبيرة للحفاظ على المكروية من الخلايا داخل اله الأنسجة. وبالتالي يتم تقييم الآثار المترتبة على العلاج FP سم أو أي نوع من أنواع العلاج بطريقة أكثر من الفسيولوجية في الخلايا وظروف زراعة الأنسجة.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS REQUIRED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, Ca2+/Mg2+- free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-3266</td>
			<td>1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4648</td>
			<td>10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (260g/mol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5513</td>
			<td>0,5M pH8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>2189</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04 693 116 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TOOLS AND MATERIAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Fine Tips forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10136-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Tools and material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="2">Dissection and FP culture</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Ethanol 70%</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>dissection hood</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>dissection microscope</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Petri dishes</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>glass coverslips</td>
						<td>18mm x 18mm</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Bunsen gas burner</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>24 well plate</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>tissue culture incubator (37&#176;C, 5% CO2, humidity controlled)</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Centrifuge</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">RECIPES</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">FP culture media</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Neurobasal</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>B27</td>
						<td>1/50e dilution from stock</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">HBSS - Thrombin</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>HBSS</td>
						<td>1 ml</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Thrombin 10mg/ml</td>
						<td>30 &#956;l</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Lysis Buffer pH7,4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Hepes (260 g/mol)</td>
						<td>25mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>EDTA (pH8)</td>
						<td>5mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>MgCL2</td>
						<td>1mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Glycerol</td>
						<td>10%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>IGEPAL (NP40)</td>
						<td>0.10%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
						<td>1X</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Sodium Orthovanadate</td>
						<td>0,2M</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>H2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Laemmli Buffer</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Tris 0,5M, pH 6,8</td>
						<td>375 mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>SDS</td>
						<td>6%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Glycerol</td>
						<td>60%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>DTT</td>
						<td>0,6M</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Bromophenol blue</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>H2O</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of isolated floor plate tissue and production of conditioned medium to assess functional properties of floor plate-released signals

خلال التنمية، والأسلاف والخلايا العصبية بعد الإنقسامية تلقي إشارات من الأراضي المجاورة التي تنظم مصيرهم. في لوحة الكلمة هو مجموعة من الخلايا الدبقية بطانة القناة البطانة العصبية في موقف بطني. في لوحة تعبر عن الكلمة morphogens الرئيسية المساهمة في الزخرفة الأنساب الخلايا في الحبل الشوكي. في مراحل النمو في وقت لاحق، والكلمة لوحة ينظم الملاحة من محاور عصبية في الحبل الشوكي، التي تعمل كحاجز لمنع عبور المحاور المماثل وعبور خط الوسط السيطرة من قبل المحاور صواري 1. يتم تحقيق هذه المهام من خلال إفراز العظة التوجيه المختلفة. بعض هذه الإشارات بمثابة جاذبة وطارد للمحاور المتزايد في حين أن آخرين تنظيم مستقبلات التوجيه وإشارات المصب لتعديل حساسية المحاور إلى العظة التوجيه المحلي 2،3. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يسمح بالتحقيق في خصائص الكلمة لوحة إشارات المشتقة في مجموعة متنوعة من ديفيسياقات lopmental، استنادا إلى إنتاج المتوسطة الطابق بلايت مكيفة (FP سم) و 4-6. نحن بعد ذلك مثالا على استخدام هذا FP سم في سياق توجيهات محوار. أولا، يتم عزل الحبل الشوكي من جنين فأر في E12.5 ويتم تشريح لوحة الكلمة من وزراعتها في مصفوفة البلازما الثرومبين (الشكل 1). في وقت لاحق الثانية يومين، يتم تشريح الأنسجة صواري خروج من أجنة E12.5، المسحوقة وتتعرض لFP سم. الثالثة، تتم معالجة الأنسجة لتحليل لطخة غربية من علامات صواري.

تم علاج الأنسجة صواري من قبل FP سم وتمت معالجة العينات لتحليل مستويات مستقبلات في لطخة غربية. وقد تبين تطبيق FP سم إلى زيادة مستويات مستقبلات التوجيه، PlexinA1، التي تتوسط حساسية المحاور صواري لخط الوسط طارد Semaphorin3B بعد عبور (الشكل 2). وكشف هذا أن الإشار?...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals at JoVE.com

Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals

لوحة الكلمة هو بنية حاسمة من وضع الحبل الشوكي، وتوفير إشارات إنتشاري إلى الأسلاف والتفريق الخلايا العصبية. نحن تصف طريقة لإنتاج لوحة الطابق مكيفة المتوسطة، لتطبيقه على أنسجة الحبل الشوكي الطازجة، وتقييم العواقب على البروتينات من الاهتمام من خلال الكيمياء الحيوية.

ثقافة معزولة الأنسجة الطابق بلور وإنتاج مشروطة متوسطة لتقييم خصائص وظيفية من الطابق إشارات اطلاق سراحهم لوحة

During development, progenitors and post-mitotic neurons receive signals from adjacent territories that regulate their fate. The floor-plate is a group of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

وحدة للسيارات وظيفية في صحن الثقافة: شارك في ثقافة Explants النخاع الشوكي وخلايا العضلات

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

تسجيل الإنسان Electrocorticographic (ECOG) إشارات للبحوث العلمية العصبية في الوقت الحقيقي ورسم الخرائط القشرية وظيفي

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

تشريح والثقافة، وتحليل<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأنسجة الجنينية الشبكية

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

استخدام pHluorin لتقييم ديناميات مستقبلات الإرشاد أكسون في زراعة الخلايا وفي الجنين الفرخ

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

حلقة مغلقة العصبية الروبوتية تجارب لاختبار خصائص الحاسوبية من الشبكات العصبية

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

الميكروية مزدوجة الماسورة والمركزة لقياس خارج الخلية ايون إشارات في أنسجة المخ

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

تميز خصائص متعددة النطاقات الميكانيكية للأنسجة المخ عن طريق مجهر القوة الذرية، تأثير المسافة البادئة، وRheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

العزلة وثقافة Microglia القوارض تعزيز دينامية تتفرع مورفولوجيا في المتوسط خالية من المصل

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

رواية السلبي مسح أساليب للإنتاج السريع للشفافية الضوئية في كامل أنسجة الجهاز العصبي المركزي

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

Presynapse تشكيل التبيّن باستخدام الخرز المنظم Presynapse و "الكرة العصبية" الثقافة

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...