Name: culture of isolated floor plate tissue and production of conditioned medium to assess functional properties of floor plate-released signals
Uploaded: 2014-02-11T17:30:00
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Wir danken Karine Kindbeiter, Muriel Bozon und Florie Reynaud für ihre Hilfe. Die Arbeit wird von CNRS, ANR YODA Programm und Labex DevWeCan unterstützt.

TAG 1 1. Dissektion der Spinal Cord Bodenplatte (FP) aus E12.5 Maus Embryonen Hinweis: Das gesamte Verfahren erfordert die Verwendung von sterilen Bedingungen. Es ist bevorzugt, die Dissektion unter einer Haube Dissektion durchführen, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Oberfläche der Abzugshaube mit Ethanol gereinigt werden. Alle Dissektionsinstrumente sterilisiert und aufbewahrt werden in einer sterilen Petrischale. Die Flüssigkeiten (medium,...

<ol>
	<li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system:+how+to+cross+the+midline.">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li><li>Placzek, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+floor+plate:+multiple+cells,+multiple+signals.">The floor plate: multiple cells, multiple signals.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).</li><li>Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).</li><li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates.">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li><li>Ruiz de Almodovar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+mediates+commissural+axon+chemoattraction+through+its+receptor+Flk1.">VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1.</a> Neuron. 70, 966-978 (2011).</li><li>Charoy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gdnf+activates+midline+repulsion+by+Semaphorin3B+via+NCAM+during+commissural+axon+guidance.">gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance.</a> Neuron. 75, 1051-1066 (2012).</li><li>Kiecker, C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+organizers+in+patterning+the+nervous+system.">The role of organizers in patterning the nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).</li><li>Le Dreau, G., Marti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+of+the+neural+tube:+a+tale+of+three+signals.">Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals.</a> Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+collaborates+with+netrin-1+to+guide+axons+in+the+spinal+cord.">The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord.</a> Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).</li><li>Bechara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAK-MAPK-dependent+adhesion+disassembly+downstream+of+L1+contributes+to+semaphorin3A-induced+collapse.">FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse.</a> EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).</li></ol>

Die Produktion von Bodenplatte konditionierten Medium bietet eine effiziente und einfache Möglichkeit für die Beurteilung der biologischen Eigenschaften der Bodenplatte frei Signale. Das Plasma-Thrombin-Matrix bietet eine hervorragende Voraussetzung für die Gewebeüberlebens. Dennoch könnte diese angereicherten Umgebung eine Beschränkung für einige Typen von Experimenten. So kann die Bodenplatte Gewebe auch in Agarose-Matrix kultiviert werden. Die Qualität der Bodenplatte konditionier...

Die Bodenplatte ist eine bekannte Muster Zentrum der Entwicklung von Rückenmark, spielen Schlüsselrollen in der Spezifikation von Vorläufern und postmitotische Zelllinien und Steuerung Axon Navigation 7,8. Die hier beschriebene FP cm erzeugen experimentelle Verfahren ermöglicht Forschern, die funktionellen Eigenschaften der Bodenplatte abgeleiteten Signale in einem verschiedenen Kontexten von Entwicklungsprozessen von Zelle Strukturierung und das Überleben zu Zelle und Axon Migration zu beurteilen. Um die Verwendung solcher FP cm erläutern, werden dorsalen Rückenmarksgewebe enthält kommissuralen Neuronen seziert, dilacerated und mit der FP cm stimuliert. Die Gewebe können dann zur Western-Blot-Analyse verarbeitet. Dies ermöglicht die Untersuchung Bestimmungen des Axon Führung Maschinen durch Bodenplatte freigegeben Signale. Das Verfahren zur Behandlung von dilacerated frischem Gewebe hält den großen Vorteil der Erhaltung der Mikroumgebung der Zellen innerhalb the Gewebe. Somit werden die Auswirkungen der Behandlung von FP cm oder jede Behandlungsarten werden in einer physiologischen Weise als in Zell-und Gewebekulturbedingungen geprüft.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS REQUIRED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, Ca2+/Mg2+- free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-3266</td>
			<td>1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4648</td>
			<td>10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (260g/mol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5513</td>
			<td>0,5M pH8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>2189</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04 693 116 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TOOLS AND MATERIAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Fine Tips forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10136-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Tools and material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="2">Dissection and FP culture</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Ethanol 70%</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>dissection hood</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>dissection microscope</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Petri dishes</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>glass coverslips</td>
						<td>18mm x 18mm</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Bunsen gas burner</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>24 well plate</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>tissue culture incubator (37&#176;C, 5% CO2, humidity controlled)</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Centrifuge</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">RECIPES</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">FP culture media</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Neurobasal</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>B27</td>
						<td>1/50e dilution from stock</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">HBSS - Thrombin</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>HBSS</td>
						<td>1 ml</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Thrombin 10mg/ml</td>
						<td>30 &#956;l</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Lysis Buffer pH7,4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Hepes (260 g/mol)</td>
						<td>25mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>EDTA (pH8)</td>
						<td>5mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>MgCL2</td>
						<td>1mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Glycerol</td>
						<td>10%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>IGEPAL (NP40)</td>
						<td>0.10%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
						<td>1X</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Sodium Orthovanadate</td>
						<td>0,2M</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>H2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Laemmli Buffer</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Tris 0,5M, pH 6,8</td>
						<td>375 mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>SDS</td>
						<td>6%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Glycerol</td>
						<td>60%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>DTT</td>
						<td>0,6M</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Bromophenol blue</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>H2O</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of isolated floor plate tissue and production of conditioned medium to assess functional properties of floor plate-released signals

Während der Entwicklung Vorfahren und post-mitotischen Neuronen empfangen Signale von benachbarten Gebieten, die ihr Schicksal zu regulieren. Die Bodenplatte ist eine Gruppe von Gliazellen entlang der Ependymzellen Kanal in Bauchlage. Die Bodenplatte drückt Taste Morphogenen Beitrag zur Strukturierung der Zelllinien in das Rückenmark. In späteren Entwicklungsstadien, die Bodenplatte regelt die Navigation der Axone im Rückenmark, als ein Hindernis für die Überquerung des ipsilateralen Axone und Controlling Mittellinie Kreuzung von kommissuralen Axone 1 zu verhindern handeln. Diese Funktionen werden durch die Sekretion verschiedener Führungssignale erreicht. Einige dieser Hinweise dienen als Lockmittel und Repellentien für die wachsenden Axone während andere regeln Führung Rezeptoren und nachgeschalteten Signal, um die Empfindlichkeit der Axone zu den lokalen Führungssignale 2,3 modulieren. Hier beschreiben wir eine Methode, die die Untersuchung der Eigenschaften von Boden-Platte abgeleiteten Signale in einer Vielzahl von Ent erlaubtlopmental Zusammenhänge, bezogen auf die Produktion von Boden-Platte konditionierten Medium (FP cm) 4-6. Wir veranschaulichen dann die Verwendung dieses FP cm im Rahmen der Axon Führung. Zunächst wird das Rückenmark von Mausembryo bei E12.5 isoliert und der Boden-Platte herauspräpariert und in einem Plasma-Thrombin-Matrix (Abbildung 1) kultiviert. Zweite zwei Tage später, sind kommissuralen Gewebe aus E12.5 Embryonen seziert, zerrieben und mit der FP cm ausgesetzt. Drittens werden die Gewebe für die Western-Blot-Analyse der Kommissuren Marker verarbeitet.

Kommissur-Gewebe wurden durch das FP cm behandelt, und die Proben wurden zur Analyse der Rezeptorspiegel im Western-Blot bearbeitet. Die Anwendung der FP cm wurde gezeigt, um die Ebenen eines Führungs Rezeptor, PlexinA1, die die Empfindlichkeit des kommissuralen Axone der Mittellinie abweisend Semaphorin3B nach der Überquerung (Abbildung 2) vermittelt zu erhöhen. Dies zeigte, dass Signale, die von der FP veröffentlicht regulieren PlexinA1 Ebenen 4,6. <p class="jo...

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Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals

Die Bodenplatte ist eine wichtige Struktur der Entwicklung des Rückenmarks und bietet diffusionsfähige Signale an Vorläuferzellen und Neuronen differenzieren. Wir beschreiben eine Methode zur Bodenplatte konditionierten Medium zu produzieren, um es an die frische Rückenmarksgewebe anzuwenden und die Auswirkungen auf die Proteine ​​von Interesse durch Biochemie beurteilen.

Kultur von isolierten Bodenplatte Tissue und Produktion von konditioniertem Medium, um funktionelle Eigenschaften von Bodenplatte aufgelegt Signale beurteilen

During development, progenitors and post-mitotic neurons receive signals from adjacent territories that regulate their fate. The floor-plate is a group of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Forschung

Neurowissenschaften

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Aufnahme Menschliche Electrocorticographic (ECoG) Signale für neurowissenschaftliche Forschung und Real-time Funktionelle kortikale Mapping

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Verwendung von pHluorin zur Bewertung der Dynamik von Axon-Leitrezeptoren in der Zellkultur und im Küken-Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Closed-loop Neuro-Roboter-Experimente zur Computational Eigenschaften Neuronale Netze Testen

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Doppelläufige und Concentric Mikroelektroden zur Messung der extrazellulären Ionensignale im Hirngewebe

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

Charakterisieren Multiskalige Mechanische Eigenschaften von Gehirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Schlag Einrückungen und Rheometrie

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

Presynapse Formation Assay mit Presynapse Organizer Perlen und "Neuron Ball" Kultur

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...