Name: culture of isolated floor plate tissue and production of conditioned medium to assess functional properties of floor plate-released signals
Uploaded: 2014-02-11T17:30:00
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हम उनकी मदद के लिए Karine Kindbeiter, मुरिएल Bozon, और Florie रेनौड धन्यवाद. काम CNRS, ANR Yoda कार्यक्रम और LABEX DevWeCan द्वारा समर्थित है.

DAY 1 1. E12.5 माउस भ्रूण से रीढ़ की हड्डी मंजिल थाली (एफपी) के विच्छेदन नोट: इस पूरी प्रक्रिया में बाँझ शर्तों के उपयोग की आवश्यकता है. यह संक्रमण से बचने के लिए एक विच्छेदन हुड के नीचे ...

<ol>
	<li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system:+how+to+cross+the+midline.">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li><li>Placzek, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+floor+plate:+multiple+cells,+multiple+signals.">The floor plate: multiple cells, multiple signals.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).</li><li>Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).</li><li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates.">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li><li>Ruiz de Almodovar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+mediates+commissural+axon+chemoattraction+through+its+receptor+Flk1.">VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1.</a> Neuron. 70, 966-978 (2011).</li><li>Charoy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gdnf+activates+midline+repulsion+by+Semaphorin3B+via+NCAM+during+commissural+axon+guidance.">gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance.</a> Neuron. 75, 1051-1066 (2012).</li><li>Kiecker, C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+organizers+in+patterning+the+nervous+system.">The role of organizers in patterning the nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).</li><li>Le Dreau, G., Marti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+of+the+neural+tube:+a+tale+of+three+signals.">Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals.</a> Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+collaborates+with+netrin-1+to+guide+axons+in+the+spinal+cord.">The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord.</a> Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).</li><li>Bechara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAK-MAPK-dependent+adhesion+disassembly+downstream+of+L1+contributes+to+semaphorin3A-induced+collapse.">FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse.</a> EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).</li></ol>

मंजिल प्लेट वातानुकूलित माध्यम से उत्पादन मंजिल प्लेट जारी किया संकेतों के जैविक गुणों का आकलन करने के लिए एक कुशल और आसान तरीका प्रदान करता है. प्लाज्मा थ्रोम्बिन मैट्रिक्स ऊतक अस्तित्व ?...

मंजिल प्लेट progenitors और postmitotic सेल प्रजातियों के विनिर्देशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है और अक्षतंतु नेविगेशन 7,8 को नियंत्रित करने, विकासशील रीढ़ की हड्डी के एक प्रसिद्ध patterning केंद्र है. एफपी सेमी का उत्पादन करने के लिए यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया जांचकर्ताओं सेल patterning और अस्तित्व से सेल और अक्षतंतु प्रवास करने के लिए, विकास की प्रक्रिया का एक विभिन्न संदर्भों में मंजिल थाली व्युत्पन्न संकेतों के कार्यात्मक संपत्तियों का आकलन करने के लिए अनुमति देता है. ऐसे एफपी सेमी का उपयोग का वर्णन करने के लिए, जोड़ संबंधी न्यूरॉन्स युक्त पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के ऊतकों, विच्छेदित dilacerated और एफपी मुख्यमंत्री के साथ प्रेरित कर रहे हैं. ऊतकों तो पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए कार्रवाई की जा सकती. इस मंजिल प्लेट जारी किया संकेतों से अक्षतंतु मार्गदर्शन मशीनरी के नियमों की जांच की अनुमति देता है. dilacerated ताजा ऊतक के उपचार की विधि वें भीतर कोशिकाओं के microenvironment के संरक्षण के महान लाभ रखती हैई ऊतक. इस प्रकार एफपी सेमी द्वारा इलाज या उपचार के किसी भी प्रकार के परिणामों सेल और टिशू कल्चर शर्तों में से एक अधिक शारीरिक तरह से मूल्यांकन कर रहे हैं.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS REQUIRED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, Ca2+/Mg2+- free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-3266</td>
			<td>1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4648</td>
			<td>10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (260g/mol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5513</td>
			<td>0,5M pH8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>2189</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04 693 116 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TOOLS AND MATERIAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Fine Tips forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10136-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Tools and material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="2">Dissection and FP culture</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Ethanol 70%</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>dissection hood</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>dissection microscope</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Petri dishes</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>glass coverslips</td>
						<td>18mm x 18mm</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Bunsen gas burner</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>24 well plate</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>tissue culture incubator (37&#176;C, 5% CO2, humidity controlled)</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Centrifuge</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">RECIPES</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">FP culture media</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Neurobasal</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>B27</td>
						<td>1/50e dilution from stock</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">HBSS - Thrombin</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>HBSS</td>
						<td>1 ml</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Thrombin 10mg/ml</td>
						<td>30 &#956;l</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Lysis Buffer pH7,4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Hepes (260 g/mol)</td>
						<td>25mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>EDTA (pH8)</td>
						<td>5mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>MgCL2</td>
						<td>1mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Glycerol</td>
						<td>10%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>IGEPAL (NP40)</td>
						<td>0.10%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
						<td>1X</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Sodium Orthovanadate</td>
						<td>0,2M</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>H2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Laemmli Buffer</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Tris 0,5M, pH 6,8</td>
						<td>375 mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>SDS</td>
						<td>6%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Glycerol</td>
						<td>60%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>DTT</td>
						<td>0,6M</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Bromophenol blue</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>H2O</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of isolated floor plate tissue and production of conditioned medium to assess functional properties of floor plate-released signals

विकास के दौरान, progenitors और बाद mitotic न्यूरॉन्स उनके भाग्य को नियंत्रित करने वाले सटे प्रदेशों से संकेत प्राप्त करते हैं. मंजिल प्लेट उदर स्थिति में ependymal नहर अस्तर glial कोशिकाओं का एक समूह है. मंजिल प्लेट रीढ़ की हड्डी में सेल प्रजातियों के patterning के लिए योगदान कुंजी morphogens व्यक्त करता है. बाद में विकास के चरणों में, मंजिल प्लेट जोड़ संबंधी axons 1 से ipsilateral axons और नियंत्रित midline क्रासिंग को पार करने से रोकने के लिए एक बाधा के रूप में अभिनय, रीढ़ की हड्डी में axons की नेविगेशन नियंत्रित करता है. इन कार्यों के विभिन्न मार्गदर्शन cues के स्राव के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं. दूसरों स्थानीय मार्गदर्शन cues 2,3 करने axons की संवेदनशीलता को व्यवस्थित करना मार्गदर्शन रिसेप्टर्स और बहाव के संकेत विनियमित जबकि इन संकेतों के कुछ बढ़ते axons के लिए attractants और भगाने के रूप में कार्य. यहाँ हम विकास के उद्देश्यों की एक किस्म में फर्श प्लेट निकाली गई संकेतों की संपत्तियों की जांच की अनुमति देता है कि एक विधि का वर्णनमंजिल प्लेट वातानुकूलित मध्यम (एफपी सेमी) 4-6 के उत्पादन पर आधारित lopmental संदर्भों,. हम तो अक्षतंतु मार्गदर्शन के संदर्भ में इस एफपी सेमी का उपयोग उदाहरण देना. सबसे पहले, रीढ़ की हड्डी E12.5 पर माउस भ्रूण से अलग है और मंजिल की थाली बाहर विच्छेदित और एक प्लाज्मा थ्रोम्बिन मैट्रिक्स (चित्रा 1) में खेती की जाती है. दूसरा दो दिन बाद, जोड़ संबंधी ऊतक, E12.5 भ्रूण से बाहर विच्छेदित triturated और एफपी सेमी के संपर्क में हैं. तीसरा, ऊतक जोड़ संबंधी मार्करों के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए कार्रवाई कर रहे हैं.

जोड़ संबंधी ऊतकों एफपी सेमी द्वारा इलाज किया गया और नमूने पश्चिमी धब्बा में रिसेप्टर के स्तर के विश्लेषण के लिए प्रोसेस किया गया. एफपी सेमी का आवेदन (चित्रा 2) पार करने के बाद midline विकर्षक Sema...

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Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals

मंजिल की थाली, रीढ़ की हड्डी के विकास progenitors के लिए प्रसारण संकेतों प्रदान करने और फर्क न्यूरॉन्स की एक महत्वपूर्ण संरचना है. हम मंजिल प्लेट वातानुकूलित माध्यम के उत्पादन के लिए नए सिरे से रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को लागू करने, और जैव रसायन से ब्याज की प्रोटीन पर परिणामों का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन.

मंजिल थाली में जारी सिग्नल के कार्यात्मक संपत्तियों का आकलन करने के लिए वातानुकूलित माध्यम से पृथक मंजिल थाली ऊतक और उत्पादन की संस्कृति

During development, progenitors and post-mitotic neurons receive signals from adjacent territories that regulate their fate. The floor-plate is a group of ...

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