Name: culture of isolated floor plate tissue and production of conditioned medium to assess functional properties of floor plate-released signals
Uploaded: 2014-02-11T17:30:00
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우리는 그들의 도움을 카린 Kindbeiter, 뮤리엘 Bozon 및 Florie 위 Reynaud 감사합니다. 작품은 CNRS, ANR YODA 프로그램과 Labex DevWeCan에 의해 지원됩니다.

1 일 1. E12.5 마우스 배아에서 척수 바닥 플레이트 (FP)의 해부 참고 : 전체 절차는 멸균 조건의 사용을 필요로한다. 이것은 오염을 피하기 위해 해부 후드 절개를 수행하는 것이 바람직하다. 후드의 표면은 에탄올로 청소해야합니다. 모든 해부 악기 멸균 페트리 접시에 소독 및 보관해야합니다. 액체 (매체, 해부 매체는) 밀폐 보관하고 얼음 욕조?...

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	<li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system:+how+to+cross+the+midline.">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li><li>Placzek, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+floor+plate:+multiple+cells,+multiple+signals.">The floor plate: multiple cells, multiple signals.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).</li><li>Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).</li><li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates.">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li><li>Ruiz de Almodovar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+mediates+commissural+axon+chemoattraction+through+its+receptor+Flk1.">VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1.</a> Neuron. 70, 966-978 (2011).</li><li>Charoy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gdnf+activates+midline+repulsion+by+Semaphorin3B+via+NCAM+during+commissural+axon+guidance.">gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance.</a> Neuron. 75, 1051-1066 (2012).</li><li>Kiecker, C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+organizers+in+patterning+the+nervous+system.">The role of organizers in patterning the nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).</li><li>Le Dreau, G., Marti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+of+the+neural+tube:+a+tale+of+three+signals.">Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals.</a> Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+collaborates+with+netrin-1+to+guide+axons+in+the+spinal+cord.">The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord.</a> Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).</li><li>Bechara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAK-MAPK-dependent+adhesion+disassembly+downstream+of+L1+contributes+to+semaphorin3A-induced+collapse.">FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse.</a> EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).</li></ol>

바닥 판 에어컨 매체의 생산은 바닥 판 출시 신호의 생물학적 특성을 평가하기위한 효율적이고 쉬운 방법을 제공합니다. 플라즈마 트롬빈 매트릭스는 조직의 생존을위한 최상의 조건​​을 제공합니다. 그럼에도 불구하고,이 풍부한 환경 실험의 몇 가지 유형에 대한 제한이있을 수 있습니다. 따라서, 바닥 판 조직은 또한 아가 로스 매트릭스에서 배양 될 수있다. 바닥 판 에...

바닥 판은 조상과 postmitotic 세포 계통의 사양에 중요한 역할을 수행하고 축삭 탐색 7,8를 제어, 개발 척수의 잘 알려진 패턴 센터입니다. FP의 CM을 생산하기 위해 여기에 설명 된 실험 절차는 수사관 세포 패턴과 생존의 세포와 축삭 이주, 발달 과정의 다양한 상황에서 바닥 판에서 파생 된 신호의 기능적 특성을 평가할 수 있습니다. 이러한 FP의 CM의 사용을 설명하기 위해, commissural 신경 세포를 포함하는 등의 척수 조직은 해부 dilacerated 및 FP의 CM로 자극된다. 조직은 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리 될 수있다. 이 바닥 판 발매 신호에 의한 축삭지도 기계의 규정을 조사 할 수 있습니다. dilacerated 신선한 조직의 치료 방법 일 이내에 세포 미세 환경을 보존하는 큰 장점을 보유전자 조직. 따라서 FP의 cm 의해 치료 또는 치료의 종류의 영향은 세포 및 조직 배양 조건에서보다 더 많은 생리적 방법으로 평가된다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS REQUIRED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, Ca2+/Mg2+- free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-3266</td>
			<td>1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4648</td>
			<td>10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (260g/mol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5513</td>
			<td>0,5M pH8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>2189</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04 693 116 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TOOLS AND MATERIAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Fine Tips forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10136-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Tools and material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="2">Dissection and FP culture</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Ethanol 70%</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>dissection hood</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>dissection microscope</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Petri dishes</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>glass coverslips</td>
						<td>18mm x 18mm</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Bunsen gas burner</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>24 well plate</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>tissue culture incubator (37&#176;C, 5% CO2, humidity controlled)</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Centrifuge</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">RECIPES</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">FP culture media</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Neurobasal</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>B27</td>
						<td>1/50e dilution from stock</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">HBSS - Thrombin</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>HBSS</td>
						<td>1 ml</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Thrombin 10mg/ml</td>
						<td>30 &#956;l</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Lysis Buffer pH7,4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Hepes (260 g/mol)</td>
						<td>25mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>EDTA (pH8)</td>
						<td>5mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>MgCL2</td>
						<td>1mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Glycerol</td>
						<td>10%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>IGEPAL (NP40)</td>
						<td>0.10%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
						<td>1X</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Sodium Orthovanadate</td>
						<td>0,2M</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>H2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Laemmli Buffer</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Tris 0,5M, pH 6,8</td>
						<td>375 mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>SDS</td>
						<td>6%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Glycerol</td>
						<td>60%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>DTT</td>
						<td>0,6M</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Bromophenol blue</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>H2O</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of isolated floor plate tissue and production of conditioned medium to assess functional properties of floor plate-released signals

개발하는 동안, 조상 및 사후 유사 분열 뉴런은 자신의 운명을 통제 인접 지역에서 신호를 수신합니다. 바닥 판은 복부 위치에 뇌실막 운하 안감 glial 세포의 그룹입니다. 바닥 판은 척수에있는 세포 계통의 패턴에 기여 키 morphogens을 표현한다. 나중에 발달 단계에서, 바닥 판은 commissural 축삭 1로 동측의 축삭과 제어 중간 선 횡단의 횡단을 방지하기 위해 장벽 역할을 척수에있는 축삭의 탐색을 조절한다. 이 기능은 여러지도 단서의 분비를 통해 달성된다. 다른 사람들이 현지지도 단서 2,3에 축삭의 감도를 조절하는 지침 수용체 및 다운 스트림 신호를 조절하면서 이러한 신호의 일부는 성장 축삭에 대한 유인 및 방충제 역할을합니다. 여기에서 우리는 deve을의 다양한 바닥 판 파생 된 신호의 특성을 조사 할 수있는 방법을 설명합니다바닥 플레이트 에어컨 매체 (FP의 CM) 4-6의 생산에 따라 lopmental 상황. 우리는 그 다음 축삭의 맥락에서이 FP의 cm의 사용을 예증. 첫째, 척수는 E12.5에서 마우스 배아에서 분리되어 바닥 판은 밖으로 해부 및 플라즈마 트롬빈 매트릭스 (그림 1)에서 재배된다. 둘째 이틀 후, commissural 조직은 E12.5 배아로부터 해부 분쇄 및 FP의 CM에 노출되어 있습니다. 셋째, 조직은 commissural 마커의 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리됩니다.

Commissural 조직은 FP의 CM에 의해 처리하고, 시료는 웨스턴 블롯에있는 수용체 수준의 분석을 위해 처리되었습니다. FP의 CM의 응용 프로그램 (그림 2)을 교차 한 후 중간 선 구충제 Semaphorin3B에 commissural 축삭의 감도를 매개 안내 수용체, PlexinA1의 수준을 높일 것으로 나타났다. 이 FP에 의해 발표 신호가 PlexinA1 수준에게 4,6를 조절하는 것으로 나타났다. <p class="jo...

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Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals

바닥 플레이트, 척수 개발 조상에 확산 신호를 제공하고 분화 신경의 중요한 구조이다. 우리는 바닥 플레이트 조정 배지를 생산하는 신선한 척수 조직에 적용하는, 생화학 의해 그 단백질에 영향을 평가하는 방법을 서술.

바닥 플레이트 출시 신호의 기능적 특성을 평가하기 위해 에어컨 중간의 절연 층 플레이트 조직과 생산의 문화

During development, progenitors and post-mitotic neurons receive signals from adjacent territories that regulate their fate. The floor-plate is a group of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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연구

신경과학

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

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Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

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During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...