Name: microwave-assisted functionalization of poly(ethylene glycol) and on-resin peptides for use in chain polymerizations and hydrogel formation
Uploaded: 2013-10-29T18:30:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation at JoVE.com

这项工作被资助了一部分由霍华德休斯医学 - 到 - 研究生奖学金（AVH），由罗切斯特大学和骨科研究和教育基金会/肌肉骨骼移植基金会（OREF提供给丹妮尔伯努瓦博士启动资金/ MTF）。作者要感谢詹姆斯·麦格拉思博士利用他的设备。

1。 PEGDM的微波辅助合成<ol><li>为了防止污染水，而1小时用在烤箱（&gt; 60℃）预干所有的玻璃器皿。 注：需要的玻璃器皿包括：两个100毫升的烧杯，一个250毫升烧杯中，3勺，一个250毫升的布氏烧瓶，一个7厘米布氏漏斗，一个10厘米的表玻璃。 </li><li>预冷100-150毫升无水乙醚（74.12克/摩尔）为沉淀后倾入烧杯中，覆盖烧杯用表玻璃，并把烧杯成重结晶皿装满冰执行在步骤1.6。移动台微波炉和涡流混合器成化学通风柜。 注意：乙醚也可以通过将烧杯中的化学冷冻预冷。通过冷却在冰箱中实现的较低乙醚温度会增加速率和沉淀效率。 </li><li>在小掂量船，权衡molecu总分为5分克聚（乙二醇）（PEG）拉尔重你的选择（1000〜100000道尔顿）的。 <ol><li>如果存在，从闪烁瓶的盖子取下塑料片。去皮小瓶，并免除10摩尔过量甲基丙烯酸酐为每方程1在引擎盖小瓶（MA，154.16克/摩尔）。添加PEG的闪烁瓶中。 <img alt="式（1）" fo:content-width="200px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.jpg" width="250px" /> （1） 哪里<img alt="公式1.1" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.1.jpg" width="30px" />是PEG在克质量， <img alt="公式1.2" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.2.jpg" width="40px" />是PEG的分子量以g / mol的<img alt="公式1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="40px" />是末端OH基团上的PEG数目，以及<img alt="公式1.4" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.4.jpg" width="40px" />是molecu拉尔重量硕士克/摩尔。 </li></ol></li><li>松散拧盖到闪烁瓶中。微波设置为5分钟的最大功率。戴防热手套，从微波炉取出小瓶，每30秒。 <ol><li>完全拧紧瓶盖，涡旋30秒。重复，直到解决方案已用于微波全5分。盖可能需要在手术过程中被替换，由于开裂。 </li></ol></li><li>与帽松动，让PEGDM冷却至室温。溶解PEGDM中的二氯甲烷（DCM，84.93克/ mol）的少量（10-15毫升）。 注意：这是建议的PEGDM被允许显著（〜5分钟）之前，添加DCM冷却，以防止DCM（一种可疑的致癌物）的沸点由于余热。该PEGDM可分为使用抹刀一小块一小块，并在涡旋解散帮助。 </li><li>沉淀PEGDM在20分钟的10倍过量的冰冷二乙醚洗涤。 注意：这可能是必要的SC隔距烧杯侧用刮刀以启动结晶形成，沉淀的低分子量的PEG（2500道尔顿），但是，PEG具有低于1,000 Da的分子量不会沉淀尽管划伤。 </li><li>使用布氏漏斗和烧瓶，收集PEGDM通过真空过滤。不过滤来完成干燥，因为这将促进水吸附到PEGDM。 注意：如果需要使用的特定的真空系统，真空陷阱可以放置在过滤设置和真空源以溶剂蒸汽，以保护真空泵从损伤之间。 </li><li>过滤后PEGDM转移到50毫升锥形管具有大针头穿过帽通风刺穿。在真空室中干燥过夜储存。 </li><li>再溶解PEGDM在DCM和再沉淀（如在步骤1.5-1.7）作为最终的步骤，以除去未反应的马。再一次擦干如步骤1.8。 </li></ol> 2。 PEGDM功能化的表征<ol><li>使用氘代氯仿（120.38克/摩尔）作为溶剂，制备样品1 H-NMR。放置PEGDM（≈10mg）的一个小样品中的闪烁瓶中用少量的溶剂（≈1.0ml）中的。目标浓度是10毫克/毫升。 <ol><li>一旦将样品溶解后，将其传送到一个​​干净的NMR管中。样品应填写下方4-5厘米核磁共振管。 </li></ol></li><li>收集的质子NMR谱。我们的数据是使用400MHz的光谱仪收集。在室温下进行的样品至少64扫描，以获得足够的数据分辨率。 </li><li>如果NMR分析（ 图4）表明PEGDM官能小于90％时，methacrylation过程应重复。调整MA的质量用来解释非官能化PEG的量减少。 </li></ol>注：PEG的官能化到PEGDM百分数可以从观察到的计算：终端methacr的理论比ylate质子（a，b和c）在中央PEG质子（四）（ 图4）。对于线性PEG，PEG中央质子的理论数量的计算方法公式2： <img alt="公式2" fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.jpg" width="200px" /> （2） 哪里<img alt="公式2.1" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.1.jpg" width="40px" />是在PEG克/摩尔的分子量和<img alt="公式2.2" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.2.jpg" width="70px" />是一个单一的PEG重复（44克/摩尔）的分子量。对于非线性的PEG时，这个方程必须被修改以反映具体的分支结构（ 图1）。百分比官能然后，可以使用公式3计算： <img alt="式（3）" fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.jpg" width="300px" /> （3） 哪里<img alt="公式3.1" fo:content-width="30px" sRC =“/ files/ftp_upload/50890/50890eq3.1.jpg”宽度=“40PX”/&gt;是下峰D中观察到的区域（δ= 6.63 ppm的）， <img alt="公式3.2" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.2.jpg" width="40px" />是根据甲基丙烯酸酯质子峰的观察区域（a，δ= 1.94 ppm的; b和c，δ= 5.57和6.12 ppm）设为<img alt="公式3.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.3.jpg" width="40px" />是甲基丙烯酸酯的质子的理论数（= 3 * <img alt="公式1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> ，B = 1 * <img alt="公式1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" />和c = 1 * <img alt="公式1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> - 6,2和2分别为线性PEG）。官能化百分比计算，应使用的峰A，B分别求均值来执行和C，然后编，以获得百分之整体功能化。 注意：进行充分的官能PEGDM然后可透析（在水中，对水的），并通过冷冻干燥收集以除去残留的甲基丙烯酸酐和甲基丙烯酸。最终产品应抑制剂，如柠檬酸或维生素C的少量（0.01重量％）混合，并在-20℃直至使用存储有干燥剂。最终PEGDM产品可用于生产水凝胶，通过Khetan和伯迪克22所详述的朱庇特的文章中。 3。对树脂肽微波辅助功能化注意：我们的肽是用Fmoc-甘氨酸-Wang树脂合成时，使用自动肽合成仪，用紫外监测，并在N-甲基吡咯烷酮（NMP 99.1克/摩尔）的0.2M氨基酸溶液。 5％的哌嗪（86.1克/摩尔）在二甲基甲酰胺（DMF 73.1克/摩尔）被用于脱保护，0.5M O-苯并三唑-N，N，N&#39;，N&#39;-四甲基脲鎓 - hexafluoro - 磷酸盐（HBTU，379.3克/摩尔）在DMF中用作活化剂，和2M二异丙基乙胺（DIEA，129.3克/摩尔）在NMP中用作活化剂基础。肽也可以从商业供应商的肽获得的。当使用商业来源是很关键的肽促使树脂上的氨基酸侧链保护基团完整，而不是完全解理，因为是标准的。 注意：重​​要的是，任何氨基酸与活性侧链被保护，以确保甲基丙烯酰胺官能化仅发生在序列的N-末端的伯胺。 见表1的氨基酸反应性侧链基团，并且典型的保护基团。氨基酸的保护基团掺入到序列中的肽合成中的相同方式未受保护的氨基酸，以及通常可以从相同的氨基酸的供应商。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502"&gt; <colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> 氨基酸 </td><td style="width:163px;"> 反应基团 </td><td style="width:196px;"> 保护基 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;">赖氨酸</td><td style="width:163px;">伯胺</td><td style="width:196px;">叔丁氧羰基（BOC） </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;">丝氨酸</td><td style="width:163px;">伯醇</td><td style="width:196px;">叔丁基（TBU） </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;">苏氨酸</td><td style="width:163px;">仲醇</td><td style="width:196px;"> TBU </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;">酪氨酸</td><td style="width:163px;">苯酚</td><td style="width:196px;"> TBU </td></tr></tbody></table> 表1：活性氨基酸和典型的保护基团。 <ol><li>使用标准的固相肽合成法合成肽，并在4℃下在DMF中的树脂储存直至准备使用。 </li><li>使用7厘米布氏漏斗用滤纸和250毫升的烧瓶中，收集从DMF中通过过滤的肽树脂。 </li><li>如果存在从闪烁小瓶的盖子取下塑料片。在树脂转移到闪烁瓶中。使用一次性吸管，添加足够MA覆盖在闪烁瓶中的树脂。 </li><li>盖子松松地放置到闪烁瓶中。微波设置为在最大功率3分钟。戴隔热手套，从微波炉中取出小瓶每次15-20秒。 <ol><li>完全拧紧瓶盖，涡旋15秒。重复，直到解决方案已用于微波的福LL 3分钟。 </li></ol></li><li>与盖松开，让所述肽溶液冷至室温。用少量DMF中，并用布氏漏斗用滤纸和烧瓶，收集小瓶中的肽树脂。 </li><li>肽树脂转移到一个新的闪烁瓶中并切割和脱保护肽。 <ol><li>每0.25毫摩尔树脂中，我们使用与旋转2小时的室温反应，用18.5毫升三氟乙酸（TFA，114.02克/摩尔）裂解混合物与每个三异丙基硅烷为0.5ml（TIPS，158.36克/摩尔）， 3,6 - 二氧杂-1,8 - 辛二硫醇（DODT，182.30克/摩尔）和去离子水（18.02克/摩尔）。 注意：这种鸡尾酒是足以满足大多数肽，但不会脱保护2,2,4,6,7 - 五甲基二氢苯并呋喃-5 - 磺酰基（PBF）-保护的氨基酸（通常用于保护精氨酸侧链）。如果序列中包含的任何PBF-保护的群体，0.5毫升TFA的应及时更换用0.5毫升茴香硫醚（124。20克/摩尔）和裂解时间增加到4小时。 注：如果一个阴天，结晶物质形式的裂解混合物，该肽可能崩溃出液和裂解混合物的量应加倍。 </li></ol></li><li>冰浴400毫升无水乙醚中布满了手表的玻璃烧杯中。 </li><li>肽沉淀在10倍过量的二乙醚中，均匀地划分该溶液之中4 50ml锥形管中。离心机在3,200 xg离心10分钟，收集的肽。 <ol><li>滗去乙醚，重悬肽在100毫升250米锥形管之间的新鲜乙醚分。重复离心过程，重新悬浮在50毫升新鲜乙醚两次，共4乙醚洗涤。 注意：这消除在裂解缓冲液中的化学品和裂解的保护基团从该固体肽。 </li></ol></li><li>最后的离心步骤后，滗出废物等她的和干燥的肽过夜真空下。 </li></ol> 4。肽功能化的表征<ol><li>使用50:50的H 2 O：乙腈（41.05克/摩尔）+0.1％TFA，作为肽样品的MALDI-TOF分析的溶剂。放置一个小样本 - 在1.5ml Eppendorf管中肽（1 2毫克）并溶解于1ml的MALDI溶剂的样品。 </li><li>准备基质溶液。通常使用的基质是α-氰基-4 - 羟基肉桂酸（CHCA，189.2克/摩尔）作为基质。溶解10毫克/毫升基质的MALDI溶剂中，形成了股票基质溶液。 注意：该矩阵原液可以存储在室温下不超过一周，以获得更多的分析。 </li><li>结合以1:1的比例将肽和基质溶液。发现这种联合解决方案上的MALDI样品板上三个不同地点，加入1μL/点。 <ol><li>干燥的斑点，或者通过空气干燥或用热枪。 Respot和每干样品。 注：Respotting产生更均匀的肽/基体样品，并协助取得一个明确的信号。一个标准的肽组合也应结合以1:1的比例基质溶液和斑点（仅一次）到MALDI板。 </li></ol></li><li>收集MALDI-TOF数据。由于添加了甲基丙烯酰胺基团与肽的N-末端的，应该有高于单独的肽的分子量为68 g / mol的分子量增加。 注意：不同于PEGDM合成，肽不能refunctionalized，因为在切割时被除去的氨基酸反应性侧链保护基团，而N-末端的选择性功能不再能够保证。 <ol><li>如果MALDI分析（ 图5）表示的肽，正确地官能化和所有的保护基团适当地切割，所述肽可以被透析（在水中，对水的），并通过冷冻干燥收集到祛瘀Ë污染物残留（裂解混合物，乙醚，裂解保护基团等 ）。将固体肽应转移到一个小离心管中并储存于-20℃直至使用。 </li></ol></li></ol>

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作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。

先前说明的方法是非常宝贵的PEGDM的合成和肽或其它含胺化合物的甲基丙烯酰胺官能化。然后可以用于再生医学和药物递送应用中，这些材料。由于PEG的亲水性质，由PEG大分子单体形成的水凝胶具有较高的水含量相似，在主体2的许多组织中。这个质量，使PEG与蛋白质的吸附非常耐热，因此在本体3的惰性。然而，PEG的吸湿性能的官能化过程中证明麻烦。如果methacrylation过程中有水存在的PEG样品中的甲基丙烯酸酐将优先与水反应以生产甲基丙烯酸和聚乙二醇官能化会导致较差。 因此，可以采取以确保PEG或肽的成功methacrylation最重要的步骤之一是维持无水劳斯反应条件。在使用前干燥所有玻璃器皿的推荐步骤是为了防止水的污染。水的样品中的存在可以看出，在NMR分析，如在1.7 ppm的宽峰（ 图4）。如果methacrylation不佳，甚至晒所有玻璃器皿观察后，化学品可能会用硫酸镁或在使用前其他干燥剂（分子筛等 ） 的钠。蒸馏也可以用于除去水和纯化的甲基丙烯酸酐在使用前，和共沸蒸馏可用于干燥的PEG 23。在极端的情况下，合成，可以进行在一个手套箱中，以进一步确保充分的无水条件。还可以进行第二轮methacrylation的，按照相同的程序，以增加官能化。因为总有一个机会，附加轮官能化将被要求，应注意在步骤1.7和1.9是迅速收集PEGDM通过真空过滤。真空过滤为长于是PEG的绝对必要增大暴露在空气中，增加了机会，水的吸附。 即使％过量的甲基丙烯酸酐与羟基官能团保持不变，在PEG前体的增加的PEG的官能化（ 例如，臂＃）通常用百分比官能减小实现（未发表的结果中，Benoit实验室）相关联。抢先解决这种减少在官能化效率，或者如果特定方面遇到困难实现足够高的官能化，在微波反应的持续时间可能会增加，只要该微波间隔保持在30秒。而10摩尔过量通常是足够的，也可以提高在反应中使用的甲基丙烯酸酐的量增加达到12％的该官能化。 这是很重要的附加的沉淀步骤（1.9）进行，以实现良好的NMR信号。虽然这是很有诱惑力执行第二沉淀的同一天，合成，过夜干燥样品前再沉淀已被发现有助去除多余的甲基丙烯酸酐和甲基丙烯酸。样品制备也是实现清洁NMR谱的重要，因此样品应使用推荐的条件下制备。 图4展示了代表1 H-NMR结果正确官能PEGDM。通过分析末端甲基丙烯酸酯质子中心的PEG质子的比例，PEGDM决心充分的官能。 MALDI样品制备是实现一个明确的阅读同样重要。 MALDI是特别敏感的盐和高浓度样品的存在。如果一个明确的MALDI阅读（50以上任意单位（AU强度），具有高信号：信噪比）无法获得，样本S辨率应该被合并与基质溶液和重新分析前稀释在MALDI溶剂1:100， 图5展示了正确的肽功能化，裂解和样品制备后代表MALDI-TOF的结果。树脂前的官能化（ 图5A）的一个小样本的裂解显示了正确的合成肽GKRGDSG的，与图5B中所示的肽的正确甲基丙烯酰胺官能化。 而树脂上的肽的官能化是一个相对健壮的程序，需要对每一个序列的裂解条件，常常需要调整。对于其中许多氨基酸都受保护的侧链（&gt; 30个氨基酸长，或&gt; 15个氨基酸的保护基团），长序列，切割的持续时间应增加一小时。然而，如果切割时间延长太多，肽键裂解，可能会导致由于长期酸性曝光。 MALDI模拟<html>裂解可以是非常有益的揭示发生在肽合成或裂解的任何错误。低于预期的分子量的观察减少可能表明氨基酸（S）没有正确的夫妇，或发生的肽分馏（ 见表2的分子量通常观察到的变化的来源）。如果所观察到的分子量是通过较高的使用的保护基团的重量比预期的，它很可能是裂解和​​脱保护不充分，所述肽应再切割，以获得更多的时间。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="492"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="65"><td height="65" style="height:65px;width:103px;"> 氨基酸的缺失 </td><td style="width:64px;"> 兆瓦变化（克/摩尔） </td><td style="width:91px;"> 未切割的保护基 </td>X上;“&gt; 兆瓦变化（克/摩尔） </td><td style="width:108px;"> 通常存在离子 </td><td style="width:64px;"> 兆瓦变化（克/摩尔） </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;width:103px;">翼</td><td style="width:64px;"> -71 </td><td style="width:91px;">乙酰</td><td style="width:64px;"> +42 </td><td style="width:108px;">氯- </td><td style="width:64px;"> +35 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;width:103px;">精氨酸</td><td style="width:64px;"> -158 </td><td style="width:91px;">烯丙基</td><td style="width:64px;"> +40 </td><td style="width:108px;"> K + </td><td style="width:64px;"> +39 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;width:103px;"> ASN </td><td style="width:64px;"> -114 </td><td style="width:91px;">的Alloc </td><td style="width:64px;"> +85 </td><td style="width:108px;"> Mg 2 +的</td> &lt;运输署风格=“宽度：64PX;”&gt; 24 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;width:103px;"> ASP </td><td style="width:64px;"> -115 </td><td style="width:91px;">中国银行</td><td style="width:64px;"> 100 </td><td style="width:108px;">的Na + </td><td style="width:64px;"> +23 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;">半胱氨酸</td><td style="width:64px;"> -103 </td><td style="width:91px;"> FMOC </td><td style="width:64px;"> 223 </td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;">谷氨酰胺</td><td style="width:64px;"> -128 </td><td style="width:91px;"> OTBU </td><td style="width:64px;"> +56 </td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;"> GLU </td><td style="width:64px;"> -129 </td><td style="width:91px;"> PBF<html></td><td style="width:64px;"> 252 </td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;">甘氨酸</td><td style="width:64px;"> -57 </td><td style="width:91px;"> TBU </td><td style="width:64px;"> +56 </td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;">他的</td><td style="width:64px;"> -137 </td><td style="width:91px;"> TRT </td><td style="width:64px;"> +242 </td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;">法兰西岛大区</td><td style="width:64px;"> -113 </td><td style="width:91px;"></td><td style="width:64px;"></td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;">新列伊</td><html>嗞嗞：64PX;“&gt; -113 </td><td style="width:91px;"></td><td style="width:64px;"></td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;">赖氨酸</td><td style="width:64px;"> -128 </td><td style="width:91px;"></td><td style="width:64px;"></td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;">会见</td><td style="width:64px;"> -131 </td><td style="width:91px;"></td><td style="width:64px;"></td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;">苯丙氨酸</td><td style="width:64px;"> -147 </td><td style="width:91px;"></td><td style="width:64px;"></td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><html> 03px;“&gt;临</td><td style="width:64px;"> -97 </td><td style="width:91px;"></td><td style="width:64px;"></td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;">辑</td><td style="width:64px;"> -87 </td><td style="width:91px;"></td><td style="width:64px;"></td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;">苏氨酸</td><td style="width:64px;"> -101 </td><td style="width:91px;"></td><td style="width:64px;"></td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:103px;">色氨酸</td><td style="width:64px;"> -186 </td><td style="width:91px;"></td><td style="width:64px;"></td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="20">20“的风格=”高度：20像素，宽度：103px;“&gt;酪氨酸</td><td style="width:64px;"> -147 </td><td style="width:91px;"></td><td style="width:64px;"></td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:103px;">瓦尔</td><td style="width:64px;"> -99 </td><td style="width:91px;"></td><td style="width:64px;"></td><td style="width:108px;"></td><td style="width:64px;"></td></tr></tbody></table> 表2。一般观察到的变化的肽的分子量。 采用微波辅助methacrylation方法产生大分子单体可以以许多再生医学或药物递送的应用中使用。所述官能化的肽和PEGDM这里合成的，也可以掺入到使用氮氧自由基调控聚合（NMP），原子转移自由基聚合（ATRP），可逆或ADDI聚合物化-断裂链转移（RAFT）方法24。水凝胶的网络也可以在细胞中的存在产生的，作为朱庇特的文章中由Khetan和伯迪克22以前证明。这往往需要细胞粘附肽，如RGD或细胞外基质分子的结合，如PEG本身并不能提供电池材料的相互作用为生存而某些细胞类型25和功能的关键。肽，例如，可以使用传统的固相肽合成合成并按照此处的说明，允许掺入到凝胶网络中官能化。就像在图6中 ，夹杂物的甲基丙烯酰胺官能化的细胞粘附肽RGDS的GK的G中的水凝胶（0.5毫米）促进人间 ​​充质干细胞（MSCs）的密合性的PEG水凝胶的表面，增加了连接的数量和扩展细胞（ 图6B ）相比，PEG水凝胶，而不细胞粘附肽（ <str翁&gt;图6A）。然而，先前的工作已经证明，细胞 - 材料相互作用由夹杂物的3400粘合剂的肽和水凝胶网络之间沓PEG间隔进一步增强，减少肽-整合位阻。不包含隔板的，细胞可以用PEG水凝胶通过该吸附到该肽的非特异性蛋白相互作用，而不是通过用肽26整合素介导的相互作用。将这一PEG间隔和避免非特异性相互作用，多肽可偶联经由N-羟基琥珀酰亚胺活化酯以monofunctionalized PEG，如由埃尔南德斯和哈贝尔26。 水凝胶网络的应用需要严格控制材料的性能。一个显著的优势，以PEG水凝胶是对这些特性的控制程度高。例如，分子量，臂数，并在水凝胶网络的形成所用的PEG的重量百分比可以改变，以精细墩Ë特性的具体应用。这使严格控制水凝胶网眼尺寸（ξ），其控制水凝胶的溶胀率（Q）和刚度（弹性模量，E）。这一点在图7A和量化在图8中，其中增加在增加水凝胶的网孔大小（ 图8A）和在水凝胶硬度（ 图8B）的减少的PEG大分子单体的分子量的结果。 其控制在这些水凝胶网络散装行为相关的物理特性，网眼的大小，是使用的Flory-Rehner公式16计算。为了执行这种计算，容积膨胀比（Q）是首先从式（4）计算： <img alt="公式4" fo:content-width="100px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq4.jpg" width="120px" /> （4） 其中ρs为水的密度（1克/毫升）中，ρp是PEG浓度（1.12克/毫升）中，M s是肿质量的水凝胶和M D的是，水凝胶的干质量（通常冷冻和水凝胶的冷冻干燥后测得）。交联键（M c表示，单位为g / mol）的点之间的分子量，然后由式（5）计算： <img alt="方程（5）" fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq5.jpg" width="240px" /> （5） 其中M，N是PEG的数均分子量（以克/摩尔）， <img alt="公式5.05" fo:content-width="15px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq5.05.jpg" width="15px" />是聚合物的比容<img alt="公式5.1" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq5.1.jpg" width="60px" /> ，V 1是水的摩尔体积（18毫升/摩尔），V 2是水凝胶的平衡聚合物的体积分数 （ <img alt="公式5.2" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq5.2.jpg" width="40px" /> ），且X 1 </子&gt;是聚合物-溶剂相互作用参数为PEG和水（0.426）16。的交联键（正）之间的键的数目，然后由式（6）计算： <img alt="公式6" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq6.jpg" width="50px" /> （6） 其中N b是债券的PEG重复数（3）和M r是重复的PEG（44克/摩尔）27兆瓦。这允许根均方端至端的距离的聚合物链的<img alt="式（6.1）" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq6.1.jpg" width="40px" /> （以nm为单位），以从式（7）来计算： <img alt="公式7" fo:content-width="80px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq7.jpg" width="120px" /> （7） 其中l为平均键长（0.146 nm的基础上，CC和CO键长计算）和C n是聚合物（4.0的PEG）28的特征比值。网络连接应受，所述水凝胶的网孔大小可从式（8）计算： <img alt="公式8" fo:content-width="80px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq8.jpg" width="120px" /> （8） 水凝胶的性质可以类似地，通过调整聚乙二醇在水凝胶的形成所使用的量来调节。减小的PEG大分子单体的结果在增加水凝胶的网孔尺寸的重量百分数，其随后降低了水凝胶的硬度。 图7B示出了与图9中量化如何PEG的重量百分比使用的水凝胶形成可以被用于控制网目尺寸（ 图9A）以及合成水凝胶硬度（ 图9B）。作为底物的刚度已被证明影响细胞的行为，例如干细胞分化29，严格控制刚度的能力，是在水凝胶制造的一个重要特征。 水凝胶也可以用于对照醇给药。 如图7A和图展示在图10中，增加的PEG大分子单体的分子量增大了的水凝胶网络的网眼尺寸，其后增加封装的模型药物，牛血清白蛋白（BSA）的释放。而在本研究中水凝胶样品在t = 195小时为销毁允许水凝胶湿法和干群众网眼尺寸计算的测量，这是我们的经验，继续将已发生的样本被培养时间更长BSA的释放。不完全释放的BSA在图10中观察到并不意外，因为其他团体也报道称，BSA的耐内PEG水凝胶网络30的扩散。封装的蛋白质的不完全释放可能是由于蛋白质和PEG大分子单体，或共价键的聚乙二醇和赖氨酸残基中的BSA 31伯胺基团的甲基丙烯酸酯基团之间的结合之间的氢键</s了&gt;。此外，BSA是容易聚集和二硫键形成随着时间的推移，这可以增加其有效斯托克斯半径，阻碍​​从水凝胶的释放。作为链增长的水凝胶，如这些PEGDM水凝胶，容易发生非理想网络和异构凝胶网眼尺寸（ 图2A），但也有可能是被封装的BSA的一小部分被包含在具有显著小网眼的水凝胶的区域大小比凝胶内的整体平均，防止其释放。而残缺，nonFickian释放包封的牛血清白蛋白（数据未示出）中观察到这种情况下，许多其它的模型药物，包括胰岛素和卵清蛋白的受控菲克释放，一直用类似PEGDM水凝胶30证实。此外，沃特金斯和Anseth已经用激光扫描共聚焦显微镜，以证明从类似凝胶的荧光分子的释放与Fick扩散模型可以接受我thods 32。 而形成在这项研究中的水凝胶是不可降解的，网络退化是另一个参数，该参数可以被纳入并在这些网络内的调谐。提供用于控制水凝胶的降解可导致细胞行为33，促进组织生长或宿主组织向内生长或消除需要外植34改变。可降解的PEG水凝胶是通过开环水解降解的D，L-丙交酯，乙交酯或ε-己内酯基团上，以methacrylation 35先于PEG羟基的常用合成。这三组通过降低酯官能团水解，用具有乙酸酯的最大易感性降解，随后丙交酯，己内酯和酯，由于它们的不同的疏水性。水解降解组成立后，PEG可以进一步使用methacrylation程序的详细资料功能化这则文章，随后通过自由基引发链式聚合36,37能够形成水凝胶网络中。水凝胶网络的降解速率可通过改变水解降解的基团（乙交酯，丙交酯等 ）的身份以及通过改变在该结构35,38并入降解的重复次数来控制。 理论上，可以通过与丙烯酸酐，取代的甲基丙烯酸酐在步骤1.3和3.3分别用于PEG和肽的丙烯酸酯化此处展示的方法。然而，丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐39,40的20倍以上的成本，使得微波辅助的丙烯酸酯化显著缺乏吸引力比微波辅助methacrylation。 我们已经证明了一个简单，快速的方法来功能化PEG和肽，如何评价这一过程的效率，并给予资源，为了使u唱的合成材料，形成水凝胶网络。这些合成工具是高度灵活的在他们的应用程序，并应证明在任何数量的药物输送和材料研究实验室的主食。

聚（乙二醇）（PEG）水凝胶是在再生医学和药物递送应用1-3中使用共同的生物材料。这些水凝胶提供了比其他生物材料的显著优点。 PEG水凝胶是合成的，提供超过工程性能如弹性和降解速率相比，其天然生物材料的对应1的弹性模量控制的高度。因为它们是合成的，PEG具有显著少批与批之间的变化与天然衍生材料4。由于PEG的化学成分，这些水凝胶是高度亲水性，耐蛋白质吸附和生物相容性3。此抗蛋白吸附使PEG的水凝胶作为一种“白板”，使研究人员询问和研究特定生物或化学因素（药物，生物分子，细胞粘附肽等 ）和特定作用这些事实RS在控制细胞和/或组织的行为发挥。 <img alt="图1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig1.jpg" width="600px" /> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a> 。 图1：。聚（乙二醇）（PEG）结构A）的线性PEG B）4 -臂PEG与季戊四醇核心C）8臂PEG与六甘油核心D）的8臂PEG与实例三季戊四醇的核心。 n是聚乙二醇的数量在每个臂重复。每次重复具有44 g / mol的分子量，因此，n可以从整体分子量和结构/臂＃来计算。 聚乙二醇的前体，可与各种结构和分子量（ 图1<html> ）。不同的体系结构（臂＃）和PEG乙二醇重复（n）的可以被用于控制水凝胶的网络从这些大分子单体形成的特性。未修饰的PEG包含末端羟基而必须更换的备用功能通过聚合反应中，最通常使用的交联的策略的PEG水凝胶，之前形成的水凝胶的网络以促进共价交联。还有多种可以掺入PEG大分子单体，以促进聚合反应和交联网络（丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，乙烯基醚，降冰片烯等 ）的化学基团。尽管多种可用于促进交联的终端的功能，也有由该聚合可以发生只有两种机制：步骤和链增长（或两者，混合模式的混合物）。 g2.jpg“宽度=”600px的“/&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a> 。 图2：在理论水凝胶网络示意图一 ）传统的链增长聚合乙导致含有致密的聚（甲基丙烯酸甲酯）交联的区域，增加网络的非理想特性，如循环，未反应的前驱体，并永久纠葛异构网络）逐步聚合结果显著更均匀的网络结构（不按比例）。 功能通过链增长聚合的交联不要求额外的交联剂的存在下进行。然而，连锁聚合的水凝胶制备含有致密的交联的区域（ 图2A）1异构网络结构。与此相反，逐步增长聚合，地磁水库使用交联剂或共聚单体是具有聚乙二醇大分子单体的末端官能团反应的。作为对PEG的末端官能团可与交联剂反应的唯一和交联剂可以仅使用上的PEG的末端官能团发生反应，这将导致更大的网络结构的均匀性（ 图2B）1。逐步增长聚合反应中通常还导致更高的转化的官能团，从而降低未反应的前体和潜力由于可溶性的，未掺入大分子单体1的免疫/炎症反应的量。混合模式的聚合方法，也已开发了通过使用大分子单体，既可以自反应（链增长），并与交联剂（逐步增长）反应的同时结合步骤和链增长聚合。这将产生的水凝胶与每个聚合机理的特性，并且可以用于产生更复杂，多样的网络结构比任步或单独1链增长的网络。 虽然有大量的可用于官能PEG和促进凝胶形成性官能团，甲基丙烯酸酯和降冰片烯是一些最常见的链和分步增长聚合部分的分别。这两种功能都提供优良的时空控制网络聚合，而当用于封装细胞，这些网络支持高整体细胞生存能力5-7。通过链聚合二甲基丙烯酸酯官能化的聚乙二醇（PEGDM）的交联和通过共聚合以丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯- ，或类似的官能化的生物分子的5,6可用于生物分子或其他因素的结合。 PEGDM水凝胶有超过交替链增长聚合系统，如丙烯酸酯官能化聚乙二醇（PEGDA）显著优点。用传统方法，PEGDA可以更迅速，比PEGDM合成;浩WEVER，采用微波辅助合成，PEGDM合成是更有效的。 PEGDA通常合成过夜8或24小时9的反应，但也可以在四小时内合成在升高的温度10。 PEGDM也是传统上由反应过夜11或24小时5合成的，具有一定的方式延长反应时间4天12。使用这里演示的微波辅助的方法，PEGDM可以在5分钟的反应来制备。而PEGDM具有较慢的反应动力学比PEGDA 13，用于PEGDM交联反应仍然是快速，在几分钟内发生，并达到比PEGDA更大的大分子单体转化为甲基丙烯酸酯基团增加了在溶液中的官能团的聚集的增加的疏水性，由此增加的概率转移自由基和甲基丙烯酸酯的转换14。 PEGDM水凝胶还具有增加细胞活力及增长，相关的相比PEGDA水凝胶，可能是由于在任何给定时间，从而降低自由基浓度和存在14未反应的大分子单体的下降中的反应速率。硫醇 - 烯的聚合反应，例如那些通过逐步增长聚合反应，用降冰片烯官能化的聚乙二醇（PEGN）形式的水凝胶，并需要使用PEGN的，并且含有平均大于2的官能团的交联剂。因为生成硫中心自由基反应与降冰片烯的碳-碳双键，含多硫醇交联剂通常用于交联PEGN水凝胶，使肽与半胱氨酸氨基酸官能7的轻便掺入。虽然有通过逐步增长聚合反应，其中许多其他化学（迈克尔加成反应，如巯基丙烯酸酯15和巯基乙烯基砜16，“点击”反应，如炔-叠氮化物17 等 ），巯基-降冰片烯的水凝胶是很常见的，因为从应变该降冰片烯环显著提高反应速率，并降低了降冰片烯双键正在接受链聚合7的机会。 以促进凝胶形成丙烯酸甲酯，降冰片烯，或替代功能化的决定主要是基于该方法。例如，链增长聚合PEGDM网络已被证明是非常适合于控制细胞定位中的组织工程骨膜18,19的发展。逐步增长聚合的PEG网络是更适合的肽序列的掺入，以促进酶促反应性水凝胶降解，由于易于使用含有肽的巯基（半胱氨酸），酶底物序列的掺入与降冰片烯官能大分子单体20。如果所研究的问题将得到最好的利用逐步增长凝胶处理，费尔班克斯等人提供了降冰片的详细说明内内功能化策略PEG 7。本文将详细介绍如何PEG和肽序列可功能化（与甲基丙烯酸酯的聚乙二醇和甲基丙烯酰胺肽）的链式聚合反应。 传统上，PEGDM通过用甲基丙烯酰氯和三乙胺在二氯甲烷中反应的PEG制备。使反应在室温下过夜11或24小时5前进，以延长反应时间4天12过滤，沉淀于乙醚中，并收集之前的一些方法。虽然这种方法的许多变体存在，所有费时，需要一个大阵列的化学合成设备，而不是环境友好的，因为它们涉及使用较大量的高纯度试剂和溶剂。为了规避这些限制，林吉布森等人开发了一种微波辅助无溶剂法，以功能化的PEG与德<html> rminal甲基丙烯酸酯基团（ 图3A）12。在该反应中，PEG的末端基团的醇与甲基丙烯酸酐的羰基原子中的一个反应，形成羧基。这会产生PEGDM产品，与甲基丙烯酸作为副产物。这种合成具有许多的微波合成的特性的优点，包括减少的反应时间和无溶剂合成法21。微波合成优选前面讨论的方法，因为它是显著更快，需要更少的广泛合成设备（ 如玻璃器皿，反应板），并使用较少的总的试剂和溶剂量的溶剂时，才需要对产物纯化/集合而不是为合成，使其更经济，更环保。 0PX“/&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a> 。 图3：官能图解A）聚（乙二醇）化合物与10倍摩尔过量的甲基丙烯酸酐，以产生聚（乙二醇）甲基丙烯酸酯B）同样的方法可用于官能化的肽序列的N-末端，形成一个。甲基丙烯酰胺官能化的肽。通过从树脂裂解肽之前执行此过程，在N-末端的选择性功能可以被执行为氨基酸侧链基团仍受到保护。 n为PEG的数中的大分子单体重复（N = 45.5，227和455，分别为2，10和20kDa的线性PEG使用）。 R1至RN：氨基酸侧链。 PG1到PGN：侧链保护基。 TFA：三氟乙酸。 TIPS：三异丙基硅烷。 DODT：3,6 - 二氧杂-1,8 - 二氮杂octanedithiol。 H 2 O：水。 微波辅助methacrylation方法最近已经适应了我们的基官能化的肽的N-末端有甲基丙烯酰胺基团（ 图3B），以促进肽掺入到各种聚合物和聚合物网络。在该反应中，肽的N-末端的伯胺与甲基丙烯酸酐的羰基原子反应形成酰胺。这将生成丙烯酰胺官能化的肽，以产生作为副产物甲基丙烯酸。当使用这个程序来官能化的肽序列的N-末端，但重要的是含有反应性侧链的氨基酸（伯胺（赖氨酸），醇（丝氨酸，苏氨酸），以及酚（酪氨酸））氨基酸的官能化过程中得到保护，并保护基甲基丙烯酰胺成立后仅切割。 本文将展示这两种microw的AVE-辅助的方法来合成PEGDM和功能化的树脂肽序列，突出常见的陷阱，并提出排除故障的方法。在这篇文章中，执行常用来评估产品的功能化的分析化学技术方法进行详细说明，以及执行更高级的修改建议和资源将得到。典型的结果将证明，其中包括用合成PEGDM形成凝胶网络，利用所形成的水凝胶来控制模型药物的释放，并采用功能化肽促进细胞的水凝胶的相互作用。特别注意将支付给表征水凝胶网孔的大小和讨论如何水凝胶组合物可以进行调节，来影响这一基本物理性质，从而控制散装材料的性能如硬度和药物释放曲线。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="619">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol</td>
			<td style="width:115px;">Tokyo Chemical Industry Co, LTD</td>
			<td style="width:119px;">D2649</td>
			<td style="width:167px;">CAS 14970-87-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:115px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">UN1648</td>
			<td>CAS 75-05-8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amino Acids</td>
			<td style="width:115px;">AAPPTech</td>
			<td style="width:119px;">Glycine: AFG101</td>
			<td>CAS 29022-11-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:115px;"> </td>
			<td style="width:119px;">Arginine: AFR105</td>
			<td>CAS 154445-77-9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:115px;"> </td>
			<td style="width:119px;">Asparagine: AFD105</td>
			<td>CAS 71989-14-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:115px;"> </td>
			<td style="width:119px;">Serine: AFS105</td>
			<td>CAS 71989-33-8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anhydrous diethyl ether</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">UN1155</td>
			<td>CAS 60-29-7</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Citric acid</td>
			<td style="width:115px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1857</td>
			<td>CAS 77-92-9</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Deuterated chloroform</td>
			<td style="width:115px;">Cambridge Isotope Laboratories Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DLM-7-100</td>
			<td>CAS 865-49-6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">UN1593</td>
			<td>CAS 75-09-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Diisopropylethylamine</td>
			<td style="width:115px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">A1181</td>
			<td>CAS 7087-68-5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dimethylformamide</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D119-4</td>
			<td>CAS 68-12-2</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fmoc-Gly-Wang resin</td>
			<td style="width:115px;">Peptides International</td>
			<td style="width:119px;">RGF-1301-PI</td>
			<td>100-200 mesh size</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methacrylic anhydride</td>
			<td style="width:115px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">L14357</td>
			<td>CAS 760-93-0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Methylpyrrolidone</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH1141-4LG</td>
			<td>CAS 872-80-4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">On-resin peptides</td>
			<td style="width:115px;">Synthesized in-house</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:167px;">On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">O-Benzotriazole-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate</td>
			<td style="width:115px;">AnaSpec Inc</td>
			<td style="width:119px;">510/791-9560</td>
			<td>CAS 94790-37-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peptide Calibration Standard</td>
			<td style="width:115px;">Care</td>
			<td style="width:119px;">206195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Piperazine</td>
			<td style="width:115px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">A15019</td>
			<td>CAS 11-85-0</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear</td>
			<td style="width:115px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">B22181</td>
			<td>CAS 25322-68-3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear</td>
			<td style="width:115px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">B21955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear</td>
			<td style="width:115px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">81300</td>
			<td style="width:167px;">JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thioanisole</td>
			<td style="width:115px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">L5464</td>
			<td>CAS 100-68-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:115px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">A12198</td>
			<td>CAS 76-05-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triisopropylsilane</td>
			<td style="width:115px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">L09585</td>
			<td>CAS 6485-79-6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td style="width:115px;">Tokyo Chemical Industry Co, LTD</td>
			<td style="width:119px;">C1768</td>
			<td>CAS 28166-41-8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microwave-assisted functionalization of poly(ethylene glycol) and on-resin peptides for use in chain polymerizations and hydrogel formation

一种使用聚（乙二醇）（PEG）水凝胶中形成的大分子单体的主要优点是合成的通用性。从大量的PEG分子量和结构绘制能力（臂号，臂长和分枝格局）能提供研究人员严格控制水凝胶的结构和性能，包括杨氏模量和网目尺寸。此视频将说明一种快速，高效，无溶剂，微波辅助的方法以甲基丙烯酸聚乙二醇的前体成聚（乙二醇）二甲基丙烯酸酯（PEGDM）。这种合成方法提供了急需的原料，用于药物输送和再生医学的应用。所表现出的方​​法优于传统的methacrylation方法，因为它是显著更快和更简单，以及更经济的和环境友好的，使用更少量的试剂和溶剂。我们还将展示这种技术的适应上树脂methacr肽酰胺官能化。此树脂上的方法允许肽的N-末端与前脱保护和裂解由树脂甲基丙烯酰胺基团官能化。这允许选择性加成甲基丙烯酰胺基团的N-末端的肽，而氨基酸的反应性侧链基团（赖氨酸，例如伯胺，丝氨酸的伯醇，苏氨酸的仲醇，和酪氨酸的酚）受到保护，从而防止官能在多个站点。本文将详细介绍常用的分析方法（质子核磁共振谱（H-NMR）和基质辅助的飞行时间质谱激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF））来评估functionalizations的效率。常见的陷阱，并提出排除故障的方法将得到解决，因为它可以被用来进一步调整大分子功能的技术和水凝胶的意愿修改物理和化学属性。使用合成产品的水凝胶用于药物输送和细胞物质相互作用研究的形成将证明，并须修改水凝胶组合物，影响网目尺寸，控制水凝胶的硬度和药物释放特别注意。

质子核磁共振是最常用的分析技术来评估一个化学反应的效率1，由于各谱峰下的面积成比例，该质子在样品中的相对水平，从而确定产物和反应物的比率在该示例。对于该反应中，1 H-NMR分析（ 图4）可以被用来计算％的官能化的观察：末端甲基丙烯酸酯的质子的理论比（a，b和c），以中央的PEG质子（d）所示。在图4所示的PEGDM是2000沓之前官能化，因此N = 2000沓/（44沓/ PEG重复）= 45.5，因此d = 4 *（N-1）= 178，使得质子：NMR单元178比/ 102.16 = 1.74。在这种情况下，峰值在评估％官能一个不能被使用，因为水的样品中存在人为峰下的面积增加。使用B峰，该官能％为1.00 * 1.74 / 2 * 100％= 87.1％;全光照g峰值c时，％功能化是1.08 * 1.74 / 2 * 100％= 94.1％。因此，总的％官能化是91％，这PEGDM得到充分官能化在水凝胶的合成中使用。通常情况下，约90％的官能化之后的单个圆形methacrylation的实现。 由于众多的过程中出现的肽的1 H-NMR分析的质子的峰，肽功能化更容易使用MALDI-TOF质谱分析研究。这表现在图5中，合成并进行甲基丙烯酰胺官能化的肽GKRGDSG哪里。肽的一小部分裂解为prefunctionalization分子量的评估（ 图5A），这表明所观察到的分子量峰值发生676克/摩尔，所述肽的预期分子量，表明正确合成的肽序列。该肽的其余部分进行了甲基丙烯酰胺功能前乳沟化。作为该肽含有PBF保护Ř氨基酸，在含有​​4小时茴香硫醚鸡尾酒中进行裂解。甲基丙烯酰胺官能化之后，观察到的分子量的峰出现在744克/ mol的（ 图5B），在甲基丙烯酰胺官能化肽（67668克/摩尔）和预期的重量而不是在未官能化的肽的预期分子量，指示正确功能化。 以证明双方的PEG和甲基丙烯酰胺官能化肽的功能性，PEGDM水凝胶制备具有和不具有0.5mM的甲基丙烯酰胺官能化GKRGDSG（ 图6）。水凝胶制备用10％（重量）线性10kDa的PEGDM在PBS中，用0.05％（重量）锂苯基-2,4,6 - trimethylbenzoylphosphinate（LAP）作为光引发剂。在水凝胶前体溶液2载玻片通过载玻片间隔分离并用长尾夹保持在一起之间注入。前体溶液，然后暴露于365nm的紫外光在2毫瓦/厘米2 10分钟，以诱导交联，之后是用一圆柱形冲压收集直径为8 mm的凝胶。凝胶在PBS中漂洗并使其膨胀2天以确保平衡溶胀条件下分别实现了16,20。人MSC（通道3）生长至80％汇合，并接种于水凝胶以15,000细胞/ cm 2。该细胞被允许使用在10倍放大倍率被转移到含有0.5微升/毫升的钙黄绿素AM和2微升/毫升乙锭同型二聚体（购自Invitrogen LIVE / DEAD试剂盒存活率）的新鲜培养基并在相衬和荧光成像之前坚持48小时尼康的Eclipse钛2000。干细胞无法附着在未官能化的PEG的水凝胶（ 图6A），但在包含细胞粘附肽RGD的，他们能够坚持和铺展在水凝胶的表面（ 图6B）。在LIVE / DEAD图片呈现并不代表种子MSC群体的生存能力，如间充质干是粘附依赖性细胞的分离从死后的凝胶表面上，并在纸张传送过程中会被去除，从而导致接种细胞存活率人工充气。相反，在荧光图像的目的是在水凝胶的拓扑结构，根据相位相反它可以是单独难以粘附的细胞和小的变化之间划定。有趣的是，nonspread细胞接种于聚乙二醇仅凝胶染色阳性为钙黄绿素AM和乙锭同型二聚体，这表明细胞在成像时死亡。 一项所述的许多优点的PEG水凝胶是其高度可调性质。修饰的PEG水凝胶的具体组成，能提供研究过诸如弹性模量性能控制的高度。如示于图7中 ，两个PEG分子量（ 图7A）和重量百分比（ <stron克&gt;图7B）是已知的，以控制水凝胶的网孔大小（ξ）和合成水凝胶的硬度和释放包封的药物的速率。这证明了生产水凝胶具有不同的分子量PEGDM，并调查所得到的水凝胶的模量和网目尺寸（ 图8）。所有水凝胶制备用在PBS中的10％（重量）线性PEGDM，用0.05％（重量）的LAP作为光引发剂。 40微升的水凝胶前体的溶液的1毫升注射器切断，并暴露于365nm的紫外光在2毫瓦/厘米2和10分钟的提示，以形成水凝胶，产生圆柱形的几何形状约5毫米直径和2毫米的高度。凝胶被允许在PBS膨胀的力学性能试验前2天。凝胶弹性模量是用一个MTS QT / 5用5N载荷传感器，而以0.1毫米/秒的速率压缩初始水凝胶高度的5至10％来确定。经过力学测试完成后，网目尺寸是通过测量水凝胶MAS确定的pre-（M 次）和后期（M D），冻干通过的Flory-Rehner公式如在讨论部分，在MATLAB中执行的计算详细的24小时。作为推测，增加分子量的聚乙二醇大分子单体的增多引起水凝胶网眼尺寸（ 图8A）和在水凝胶硬度的降低（ 图8B）。水凝胶的网孔大小和所得到的凝胶硬度，也可通过改变重量百分比的PEG控制。水凝胶制备用线性10kDa的PEGDM的变化％（重量），和水凝胶的硬度和网眼尺寸如前所述（ 图9）进行了测定。如在图7B中所示，增加重量％的聚乙二醇引起网眼尺寸的显著下降（ 图9A），并增加水凝胶的硬度（ 图9B）。 使用不同molecula形成含有包封的牛血清白蛋白（BSA）的水凝胶Ř重量PEG（2，10，和20kDa）。所有水凝胶制备用含有50微克/毫升BSA的10％（重量）PEGDM在PBS中，以如对于图6。凝胶孵育于1ml PBS中，在37℃，并转移至新鲜的PBS中在每个时间点。采用Bradford法从Thermo Scientific的释放BSA进行定量。水凝胶网孔尺寸被描述为图8确定。 如图7A所示 ，BSA的释放发生更迅速地从使用较高分子量PEGDM形成的水凝胶，如在水凝胶内的较大的筛目尺寸（ 图10）的结果。 <img alt="图4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig4.jpg" width="500px" /> 图4。采用微波辅助方法的2 kDa的线性PEGDM代表1 H-NMR官能化。百分比的官能化可以是大约基于lculated观察：末端甲基丙烯酸酯质子理论比（a，b和c）中央PEG质子（四） <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a> 。 <img alt="图5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig5.jpg" width="500px" /> 图5。肽GKRGDSG（A）之前和（B）中使用的微波辅助的方法官能化后，需要注意的是官能化后所观察到的分子量的峰出现在744克/摩尔，在甲基丙烯酰胺官能化肽的预期质量（676 代表的MALDI-TOF 68克/摩尔），而不是在非功能化的肽（676克/摩尔）的预期分子量。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig5highres.jpg" target="_blank">点击这里查看大图</a> 。 图6。代表相衬（左）和LIVE / DEAD（绿色/红色）荧光图像的MSCs培养在孤独和B A）的PEG凝胶（右））含有0.5 mM的PEG凝胶甲基丙烯酰胺官能GKRGDSG。干细胞是无法坚持和传播上仅在PEGDA凝胶，但细胞粘附肽RGD注册成立时，都能够坚持和铺在水凝胶表面。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig6highres.jpg" target="_blank">点击这里查看大图</a> 。 <img alt="图7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig7.jpg" width="500px" /> 图7。 A）用于形成凝胶网络的PEG分子量和B）的重量百分比的PEG水凝胶的影响网格尺寸（_8 ;)和合成水凝胶的硬度和释放包封的药物的速率A）以恒定的重量百分比增加的PEG分子量（左到右）的增加水凝胶网眼尺寸，降低水凝胶的硬度和增加药物的释放。 乙速率）减小的重量聚乙二醇的百分比（从左至右）用于形成凝胶水凝胶增大网目尺寸，同样降低水凝胶的硬度和增加药物释放（不按比例）的速率。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig7highres.jpg" target="_blank">点击这里查看大图</a> 。 <img alt="图8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig8.jpg" width="500px" /> 图8。 A）随着对PEG大分子单体的分子量网格尺寸的增大和B）水凝胶硬度降低。N = 10，误差线=扫描电镜，*** P＆＃60; 0.001单因素方差分析与杜克的HSD事后检验。所有的统计分析均使用Prism 5执行。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig8highres.jpg" target="_blank">点击这里查看大图</a> 。 <img alt="图9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig9.jpg" width="500px" /> 图9。 A）筛孔尺寸减小和B）水凝胶硬度的增加而增加重量％的PEG。N = 9-10，误差线=扫描电镜，** P &lt;0.01，*** P &lt;0.001由单因素方差分析与杜克的HSD后hoc检验。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig9highres.jpg" target="_blank">点击这里查看大图</a> 。 <img alt="图10" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig10.jpg" width="500px" /> 图10。 enca的释放使用2 kDa的10 kDa的，20kDa的分子量的PEG形成水凝胶psulated模型药物牛血清白蛋白（BSA）。BSA的释放发生更迅速地从使用较高分子量PEGDM形成的水凝胶，如在水凝胶内的较大的筛目尺寸的结果。 N = 6，误差线=扫描电镜。释放的％BSA是显著差异（p &lt;0.0001），所有三组之间在除t = 1和2.5小时时从2和10 kDa的凝胶剂的释放是等效的，由双向重复测量方差分析和Bonferroni各时间点事后检验。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig10highres.jpg" target="_blank">点击这里查看大图</a> 。

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Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

此视频将说明为甲基丙烯酸酯的聚（乙二醇）的快速，有效的方法，使链聚合和水凝胶的合成。它将演示如何引入类似丙烯酰胺功能成肽，细节常用的分析方法来评估功能化的效率，提供故障排除和先进的修改建议，并展示典型的水凝胶的表征技术。

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