Name: in vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices
Uploaded: 2013-11-25T21:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices at JoVE.com

MS und YZ werden von KCL KCL-und PhD student China unterstützt. MO wurde von einem Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council Doktoranden-Stipendium gefördert. Wir danken Masaru Okabe und Jun-ichi Miyazaki für die pCX-EGFP-Plasmid und Alain Chedotal und Athena Ypsilanti für wertvolle Erfahrungsberichte Elektroporation.

Dieses Verfahren steht im Einklang mit den britischen Home Office Verordnungen (Tier Scientific Procedures Act, 1986). Wissenschaftler sollten die etablierten und durch ihre institutionelle und nationale Regulierungsorganisationen Tier genehmigten Richtlinien zu folgen. 1. Postnatale Elektroporation 1.1. Herstellung von Glas-Kapillaren, DNA-Lösung und Electroporator <ol><li> Bereiten zogene Glaskapillaren (OD: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) für die DNA-Injektion. (Richt E...

<ol>
	<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain:+significant+answers+and+significant+questions.">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li><li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+and+new+memories:+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and.">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and.</a> 11, 339-350 (2010).</li><li>Lazarini, F., Lledo, P. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone+cell+migration:+lessons+from+quantitative+two-photon+microscopy.">Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy.</a> Front. Neurosci. 5, 30 (2011).</li><li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls:+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis.">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Dev. 6, 13 (2011).</li><li>Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-b2+regulates+the+proliferation+and+migration+of+neuroblasts+in+the+postnatal+and+adult+subventricular+zone.">Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone.</a> J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).</li><li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy.">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li><li>Tattersfield, A. 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T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration.">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li><li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease.">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. 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Effiziente Migration von neuralen Vorläuferzellen entlang der RMS sorgt für deren anschließende Reifung in funktionelle Neuronen 10. Prominent Streams von neuralen Vorläuferzellen in Richtung des OB gerichtet sind, sind in der menschlichen Kindheit sichtbar und werden wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der frühen postnatalen Entwicklung des menschlichen Gehirns 27 zu spielen. Darüber hinaus sind diese Zellen in der Lage, Websites des Gehirns durch Verletzungen und Neurodegeneration betroff...

Im Säugerhirn, die Erzeugung von neuen Neuronen (Neurogenese) erfolgt nach der Geburt vor allem in zwei Regionen, die Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel und der Subgranularzone im Gyrus dentatus des Hippocampus 1. Deutliche Beweise in den letzten Jahren gesammelt unterstützt eine entscheidende Rolle für die postnatalen Neurogenese im Hippocampus und Riechkolben Speicherfunktionen 1-3. Wichtig ist, daß die postnatale Neurogenese auch therapeutisches Potential aufgrund der Beziehung mit degenerativen neurologischen Störungen, und die Fähigkeit von Neuroblasten an verletzten Stellen im Gehirn 4-6 migrieren. Die Subventrikularzone (SVZ) hat vor kurzem als ein entscheidender neurogenen Nische. SVZ abgeleiteten Neuroblasten wandern zur Riechkolben (OB) über dem rostralen Migrationsstrom (Effektivwert), so dass dies die längste Migration in der postnatalen Gehirn 1,7,8. Die Säugetier SVZ / RMS / OB-System hat sich zu einemnützliches Modell, um verschiedene Schritte der Neurogenese, wie Proliferation, Migration und Differenzierung 1,8 studieren. Viele Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Signale regulieren SVZ Neurogenese und Migration entlang der RMS, aber die intrazellulären molekularen Mechanismen sind bei weitem nicht vollständig verstanden 1,9. Proper Migration entlang der RMS ist entscheidend für die spätere Reifung neugeborener Neuronen 10. Darüber hinaus haben einige Studien gezeigt, dass SVZ-derived Neuroblasten kann der RMS-Hirn-Verletzungen Websites 4-6,11-13 migrieren. So untersucht die Signalmechanismen Regelneuroblast Migration ist von grundlegender Bedeutung nicht nur für die Neurogenese zu verstehen, sondern auch für mögliche therapeutische Anwendungen. Hier ein ausführliches Protokoll zu SVZ neuralen Vorläuferzellen durch in vivo Elektroporation postnatale beschriften und Überwachung ihrer Wanderung entlang der RMS in akuten Hirnschnittkulturen mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie drehenden Scheibe beschreiben wirpy. Elektroporation ist weit verbreitet in Entwicklungsstudien aus embryonalen zu adulten Stadien 14-18 verwendet. Es ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um gezielt manipulieren SVZ neuralen Vorläuferzellen und ist ein kostengünstiger und wesentlich schnellere Alternative zu stereotaktische Injektion von viralen Vektoren oder Erzeugung transgener Modelle 1,15,19,20. Es ist ein relativ einfaches Verfahren, das nicht braucht, Chirurgie und hat eine hohe Überlebensraten. Elektroporation von shRNA oder CRE-Rekombinase-exprimierenden Plasmiden in Maus-Modellen Verwendung der genetischen LoxP System kann verwendet werden, um gezielt Gene von Interesse oder dauerhafte Kennzeichnung von SVZ Vorläuferzellen zu erreichen, stellt somit ein nützliches Werkzeug für die adulte Neurogenese Studien 21,22 werden. RMS Imaging Neuroblast Migration im intakten Gehirn ist immer noch eine Herausforderung aufgrund der aktuellen technischen Einschränkungen. Allerdings kann dieser Prozess mit Hilfe der konfokalen Spinning-Disk-Zeitraffer-Mikroskopie von akuten Hirnschnitten, die eine geeignete syst bieten überwacht werdenem sehr ähnlich der in vivo-Zustand, der auch offen für pharmakologische Manipulation 23,24. Kopplung in vivo Elektroporation mit postnatalen Zeitraffer-Imaging wird das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Neuroblast Beweglichkeit erleichtern und dazu beitragen, die Entwicklung von neuartigen Ansätzen zur Heilung des Gehirns zu fördern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Millicell</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:149px;">PICM0RG50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td style="width:149px;">P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gey&#39;s Balanced media</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose, 45%</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">10109-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (phenol red-free)</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Glass capillaries for injection</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">30-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:149px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sutter P-97 capillary puller</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:149px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Platinum Tweezertrodes 7 mm</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Footswitch Model 1250F</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel for electrodes</td>
			<td style="width:195px;">Cefar Compex</td>
			<td style="width:149px;">6602048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:195px;">Merial</td>
			<td style="width:149px;">AP/DRUGS/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:149px;">VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glue</td>
			<td>Roti coll</td>
			<td>Roti coll 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraViEW VoX spinning disk system</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Volocity software</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Acquisition, Quantitation, Visualization Modules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Environmental chamber for microscopy</td>
			<td style="width:195px;">Solent Scientific</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices

Die Subventrikularzone (SVZ) ist einer der wichtigsten neurogenen Nischen in der postnatalen Gehirn. Hier neuralen Vorläuferzellen vermehren sich und führen zu Neuroblasten in der Lage, entlang des rostralen Migrationsstrom (RMS) zum Bulbus olfactorius (OB) zu bewegen. Diese Fern Migration für die anschließende Reifung neugeborener Neuronen im OB benötigt, aber die molekulare Mechanismen, die diesen Prozess sind noch unklar. Untersuchung der Signalwege steuern Neuroblast Motilität kann nicht nur helfen, zu verstehen, einen entscheidenden Schritt in der Neurogenese, sondern auch therapeutische regenerative Potenzial, da die Fähigkeit der Neuroblasten zu Hirn Websites durch Verletzung, Schlaganfall oder Degeneration betroffen Ziel. In dieser Handschrift beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für in vivo-Elektroporation und anschließender postnatale Zeitraffer-Bildgebung Neuroblast von Migration in den Maus RMS. Postnatale Elektroporation kann SVZ Vorläufer effizient transfizierenZellen, die wiederum erzeugen Neuroblasten Migration entlang der RMS. Mit der konfokalen Spinning-Disk-Zeitraffer-Mikroskopie an akuten Hirnschnittkulturen, können Neuroblast Migration in einer Umgebung, sehr ähnlich der in vivo-Zustand überwacht werden. Außerdem kann Neuroblasten Motilität verfolgt und quantitativ analysiert werden. Als Beispiel beschreiben wir, wie man in vivo Elektroporation postnatale einer GFP-exprimierenden Plasmid verwenden, um zu kennzeichnen und zu visualisieren Neuroblasten Migration entlang der RMS. Elektroporation von shRNA oder CRE-Rekombinase-exprimierenden Plasmiden in Knockout-Mäusen unter Verwendung der loxP-System kann auch verwendet werden, um Gene von Interesse abzuzielen. Pharmakologische Manipulation von akuten Hirnschnittkulturen durchgeführt werden, um die Rolle der verschiedenen Signalmoleküle in Neuroblasten Migration zu untersuchen. Durch die Kopplung von In-vivo-Elektroporation mit Zeitraffer-Bildgebung, hoffen wir, die molekularen Mechanismen, die die Neuroblast Motilität verstehen und dazu beitragen, die Entwicklunglung neuer Ansätze zur Heilung des Gehirns zu fördern.

Kennzeichnung von SVZ-abgeleiteten Migrationsneuroblasten entlang der RMS beobachtet werden, in der Regel 4-8 Tage nach einer erfolgreichen Elektroporation (Abbildung 1B). Längere Zeitpunkte können auch gewählt werden, weniger Zellen werden in den RMS gefunden werden, da die meisten von ihnen die OB eingegeben. Neuroblasten starten Erwerb typische Morphologie und Eigenschaften von reifen Körnerzellen im OB etwa 2-3 Wochen nach der Elektroporation (nicht gezeigt). Nach Kultivierung für ~ 1 Stunde, k...

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In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast Migration ist ein grundlegendes Ereignis in der postnatalen Neurogenese. Wir beschreiben ein Protokoll für die effiziente Markierung von Neuroblasten durch in vivo Elektroporation postnatalen und anschließende Visualisierung der Migration mit Zeitraffer-Bildgebung der akuten Hirnschnitten. Wir sind eine Beschreibung für die quantitative Analyse von Neuroblast Dynamik von Video-Tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Forschung

Neurowissenschaften

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex-vivo-Bildgebung von Postnatale Kleinhirn-Körnerzellmigration mittels konfokaler Makros

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...