Name: single-plant, sterile microcosms for nodulation and growth of the legume plant medicago truncatula with the rhizobial symbiont sinorhizobium meliloti 
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti at JoVE.

Detta arbete har finansierats av USDA National Institute of livsmedel och jordbruk, jordbruk och livsmedel Research Initiative bidrag 2010 till 65.108 - 20582 till KMJ Vi tackar Brian K. Washburn för kritisk granskning av manuskriptet.

Utför steg 1, 2, 4 och 6 i en steril huv med laminärt flöde är att rekommendera. 1. Beredning av M. truncatula A17 Plantor Notera: M. truncatula A17 frön som används i dessa studier produceras under kylda växthusförhållanden vid ~ 22 ° C, eller i ett växtodlingsrum hålls vid 22-26 ° C med ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 ljus. <ol><li> Häll frögroning plattor: Använd 100 mm kvadratiska plattor (15 mm djupa) och ...

<ol>
	<li>Galibert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composite+genome+of+the+legume+symbiont+Sinorhizobium+meliloti.">The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti.</a> Science. 293, 668-672 (2001).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520-524 (2011).</li><li>Glazebrook, J., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+techniques+in+Rhizobium+meliloti.">Genetic techniques in Rhizobium meliloti.</a> Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).</li><li>Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+in+medicago+truncatula+using+Tnt1+insertion+mutants.">Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants.</a> Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).</li><li>Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide-deficient+mutants+of+Rhizobium+meliloti+that+form+ineffective+nodules.">Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).</li><li>Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Petri+Dish+Technique+for+the+Aseptic+Synthesis+of+Ectomycorrhizae.">A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae.</a> Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).</li><li>Barker, D. G., Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Medicago truncatula handbook. , (2006).</li><li>Leonard, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Assembly+for+Use+in+the+Testing+of+Cultures+of+Rhizobia.">A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia.</a> J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).</li><li>Trung, B. C., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+Leonard+jar+assembly+for+screening+of+effective+rhizobium.">Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium.</a> Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).</li><li>Penmetsa, R. V., Cook, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+diverse+developmental+mutants+of+Medicago+truncatula.">Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).</li><li>Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P., Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Medicago truncatula handbook. , (2006).</li><li>Vincent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. , (1970).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Pladys, D., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+during+Development+and+Senescence+of+Effective+and+Plant+Gene-Controlled+Ineffective+Alfalfa+Nodules.">Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules.</a> Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).</li><li>Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abortion+of+infection+during+the+Rhizobium+meliloti-alfalfa+symbiotic+interaction+is+accompanied+by+a+hypersensitive+reaction.">Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction.</a> The Plant J. 4, 555-566 (1993).</li><li>Johnson, L. E. B., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+and+Biochemical+Comparisons+of+Plant+Induced+Ineffective+Nodules.">Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules.</a> Phytopathology. 71, 884 (1981).</li><li>Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+Comparisons+of+Plant+and+Rhizobium+Induced+Ineffective+Nodules+in+Alfalfa.">Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa.</a> Physiological Plant Pathology. 17, 167 (1980).</li><li>Van de Velde, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+legume+symbiosis.+A+molecular+view+on+nodule+senescence+in+Medicago+truncatula.">Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).</li><li>Jones, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+production+of+the+exopolysaccharide+succinoglycan+enhances+Sinorhizobium+meliloti+1021+symbiosis+with+the+host+plant+Medicago+truncatula.">Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula.</a> J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).</li><li>Queiroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+genomics+screen+identifies+a+Sinorhizobium+meliloti+1021+sodM-like+gene+strongly+expressed+within+host+plant+nodules.">A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules.</a> BMC Microbiol. 12, 74 (2012).</li></ol>

Det finns flera steg i protokollet som är avgörande för framgång: 1) Nödvändigheten av att använda renat, växtcellkultur testade agar kan inte nog understrykas. Detta är inte kritiskt för alfalfa plantor, men det är kritiskt för tillväxt av M. truncatula A17. 2) Det är viktigt att gro plantor på vertikala agarplattor som beskrivs i steg 1. Den utbredd teknik för groende plantor på en inverterad horisontell yta i en 15 mm djup tallrik 7 rekommenderas inte för detta protokoll eftersom...

Samspelet mellan legume värdväxten Medicago truncatula A17 och baljväxtbakterier bakterie Sinorhizobium meliloti 1021 är en av de mest tractable modellsystem för studium av rot knöl utveckling och kvävefixerande symbios. Genom av både symbiotiska parter har sekvense 1,2 och både växt-och bakterie kan bli föremål för genetisk manipulation 3,4. Analys av fenotyper av både växt-och bakterie mutanter kräver förmåga att observera stadier knöl utveckling och för att kvantifiera den symbiotiska produktivitet över tid. Här beskriver vi en metod för att observation av rot knöl utveckling av M. truncatula cv. Jemalong A17 inokulerade med S. meliloti 1021 inom enskilda mikrokosmos gjorda av standard, rund 100 mm diameter, 15 mm djupa laboratorieplattor (Figur 1A). Den skjuta exponeras och växer genom en tandad portal i sidan av plattan (Figures 1B, 1C och 1E). Rötter är inrymda i de mikrokosmos och hållas sterilt, samtidigt som observation genom locket hos plattan (figur 1D). Eftersom skjuta är åtkomlig, är dess tillväxt begränsas inte och den kan mätas vid periodiska intervall utan att äventyra steriliteten hos roten. Den metod för att skapa hack-platta mikrokosmos utvecklades ursprungligen av Leigh, et ​​al. 5 för att odla alfalfa växter, men det var inte allmänt antagits trots sina många fördelar jämfört med andra metoder. En variant av denna metod har också utvecklats för att analysera samspelet mellan växtrötter och mykorrhiza 6. Vi har nu anpassas och optimeras denna metod för tillväxt av M. truncatula växter. Fördelarna med detta protokoll över mer vanligaste metoderna beskrivs nedan. Det finns flera metoder som för närvarande används i stor utsträckning för nodulation studier av M. truncatula inocurade med S. meliloti 7. Den vanligaste metoden för storskalig framställning av nodulerade rötter är tillväxten i aeroponic kassuner 7. I denna metod är växter upphängd över ett stort kärl och rötter är luftades med en blandning av S. meliloti och näringslösning 7. Denna metod är praktiskt om bara en genotyp av S. meliloti ska testas. Eftersom det kräver aerosolisering av höga koncentrationer av bakterier, finns det en hög sannolikhet för korskontaminering mellan kassuner inokulerade med olika bakteriestammar. En annan metod som ofta används för att framställa stora mängder av inokulerade plantorna är tillväxt i baljor eller krukor av perlit, vermikulit, sand eller kalcinerad lera som är infunderas med näringslösning och inokulerades med S. meliloti 7. Denna metod kräver användning av öppna baljor eller krukor, och kräver vattning och förvaltning av den näringslösning. En annan nackdel med krukor är att växtermåste tas bort från denna partikelmatris för granskning av rötter och knölar. En annan nackdel med denna metod är att ett stort område av inkubatorn utrymme behövs då många olika S. meliloti genotyper skall jämföras, eftersom en separat kruka måste användas för varje bakterie genotyp. Den &quot;Leonard burk&quot; är en variation på denna metod 8,9. En Leonard burk består av två steriliserade kärl staplade den ena ovanpå den andra och förbundna med en veke. Tillväxtmedium är placerad i den undre kärlet och dras genom veken genom kapillärverkan in i en tillväxt matris av perlit, vermikulit, sand eller kalcinerad lera, i det övre kärlet. Plantan (er) är placerade i tillväxtmatris och inokulerades med S. meliloti. Denna metod kräver inte vattning, men undersökning av rötter och knölar kräver att plantan tas ur partikeltillväxtmatrisen. Det finns flera metoder som inte tillåter enkel undersökning av roots. En av dessa är den transparenta plast &quot;tillväxt påse&quot; 7. En nackdel med denna metod är att täta vattning krävs eftersom endast ≤ 10 ml vätskemedium är optimal för att odla M. truncatula i påsar 7. Pouch experiment också vanligtvis begränsad till ~ 2 veckor 7, på grund av nedbrytning av pappers veken i påsen. Två andra metoder som allmänt används liknar vår metod att växterna odlas på agar och rötterna är synliga, men dessa metoder har också nackdelar som vår procedur undviker. I dessa metoder är växter helt innesluten i 24.5 cm x 24.5 cm agarplattor förseglade runt toppen med porös kirurgisk tejp eller odlas i agar-vinkling rör igenkorkade med bomullsproppar eller plastlock 7. Båda dessa metoder möjliggör enkel undersökning av rötter och kan hållas sterila. Men de agarsluttning rören vanligtvis odlas med endast 20 ml agar medel 7 och kräver vattning och näringsämnen enddition för långsiktig tillväxt av växter. Växter som odlas inom de 24,5 cm x 24,5 cm agarplatta mikrokosmos har tillräckligt med fukt och näringsämnen för långsiktig tillväxt, men den växande skjuta snabbt blir begränsad inom den slutna plattan mikrokosmos och etengasen kan bygga upp hämmande nodulation 7. I det förfarande som beskrivs här, är fotograferingen exponeras och växer fritt utanför det mikrokosmos som innehåller ~ 70 ml av media, vilket gör att den långsiktiga tillväxten. Det förfarande som beskrivs här kan vara användbara inte bara för studier av nodulation av baljväxter växter, men också för att studera bakom fenotyper av andra medelstora anläggningar. Skillnaden mellan dessa mikrokosmos och en traditionell polykarbonat växtvävnadsodlings burk är att rötter i de platt microcosms beskrivs här växa på den vertikala ytan av agar i stället för nedåt till ett horisontellt skikt av agar vid botten av burken. Detta tillåter roten att lyftas bort av agarytan med minimal dkada på rothår och minimal vidhäftning av agar till rotytan, vilket underlättar undersökning av rothår genom mikroskopi.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agar purified, plant cell culture-tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7921</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

single-plant, sterile microcosms for nodulation and growth of the legume plant medicago truncatula with the rhizobial symbiont sinorhizobium meliloti

Baljväxtbakterier bildar symbiotiska, kvävefixerande knölar på rötterna av kompatibla värd baljväxter växter. En av de mest välutvecklade modellsystem för att studera dessa interaktioner är växten Medicago truncatula cv. Jemalong A17 och baljväxtbakterier bakterie Sinorhizobium meliloti 1021. Upprepad avbildning av växternas rötter och poängsättning av symbiotiska fenotyper kräver metoder som är icke-förstörande antingen växter eller bakterier. Den symbiotiska fenotyper av vissa växt-och bakterie mutanter blivit uppenbart efter relativt korta perioder av tillväxt, och inte kräver långsiktig observation av värd / symbiont interaktion. Men subtila skillnader i symbiotiska effektivitet och knöl hudåldrande fenotyper som inte är uppenbara i de tidiga stadierna av nodulation processen kräver relativt långa tillväxtperioder innan de kan görs. Flera metoder har utvecklats för långsiktig tillväxt och observation av denna värd / symbiont par.Emellertid är många av dessa metoder kräver upprepad vattning, vilket ökar möjligheten för kontaminering av andra mikrober. Andra metoder kräver ett relativt stort utrymme för tillväxt av ett stort antal växter. Den metod som beskrivs här, symbiotiska tillväxten av M. truncatula / S. meliloti i sterila, enda växtmikrokosmos, har flera fördelar. Växter i dessa mikrokosmos har tillräcklig fukt och näringsämnen för att säkerställa att vattning krävs inte för upp till 9 veckor, förhindra korskontaminering under vattning. Detta gör fenotyper som ska kvantifieras som kan missas i kortsiktiga tillväxtsystem, såsom subtila förseningar i knöl utveckling och tidig knöl åldrande. Dessutom är de rötter och knölar i mikrokosmos lätt ses genom locket plattan, så upp-böka av växterna för observation inte behövs.

Beredningen och ympning av dessa plattmikrokosmos är relativt enkel jämfört med de flesta andra metoder som beskrivs i inledningen. Användning av dessa mikrokosmos tillåter också långvarig växtligheten (upp till 9 veckor) utan vattning eller näringstillskott, underhåll av rot sterilitet, både enkel undersökning av rötter och skydda rötterna från ljus, obegränsad tillväxt av växtskott, enkel tillgång till fotograferingen för längdmätning, och borttagning av växter från mikrokosmos med minimal skad...

Watch this Scientific Journal Video about Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti at JoVE.

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Tillväxt av Medicago truncatula växter i symbios med kvävefixerande bakterier Sinorhizobium meliloti i enskilda, sterila mikrokosmos gjorda av vanliga laboratorieplattor tillåter frekvent granskning av rotsystem och knölar utan att kompromissa med sterilitet. Växter kan upprätthållas i dessa tillväxtkammare under upp till nio veckor.

Single-växt, sterila mikrokosmos för Nodulation och tillväxt av legumeväxt<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Med baljväxtbakterier symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

Research

JoVE Journal

Environment

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

Metoder för att underlätta mikrobiell tillväxt på Pulp Mill avfallsflödena och karakterisering av Bionedbrytning Potential för Odlade Mikrober

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Transcript och metabolit profilering för utvärdering av tobaks Träd och poppel som råvara för biobaserade industri

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Användning av hög upplösning IR Termografi (HRIT) för studier av iskämbildande och Ice förökning i växter

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

En ny ansökan av elektriska penetration Graph (EPG) för att förvärva och mäta elektriska signaler i floem sikt Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

En invikta Thermogradient tabell att kontrollera Jord Temperaturer för att utvärdera Växternas tillväxt och övervakning mark

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Operation of a 25 KWth Calcium Looping Pilot-plant with High Oxygen Concentrations in the Calciner

Operation of a 25 KWth Calcium Looping Pilot-plant with High Oxygen Concentrations in the Calciner

Drift av en 25 KWth kalcium Looping Pilot-växt med höga syrehalter i Calciner

Calcium looping (CaL) is a post-combustion CO2 capture technology that is suitable for retrofitting existing power plants. The CaL process uses limestone ...

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Förfaranden av laboratoriet gasning för skadedjursbekämpning med kväveoxid Gas

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Den växt infektion testet: Spray och sår-medierad inympning med den växt patogen Magnaporthe länkar

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

En flexibel lågpris hydroponiska System för bedömning av anläggningen Svaren till små molekyler i sterila förhållanden

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Ett optimerat Rhizobox protokoll att visualisera rottillväxt och lyhördhet för lokaliserade näringsämnen

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...