Name: quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium
Uploaded: 2013-11-07T19:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) giver R01-DK080752 og P50-DK064540. Vi takker J. Loughman for hendes indsats med at etablere denne analyse.

1.. Dyrkning 5637 Blære epithelialceller Udfør følgende trin i en laminar strømning cellekultur hætte tilberedt med UV-bestråling og tørres af med 70% ethanol. <ol><li> Forbered RPMI-1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) [betegnes RPMI +], filter steriliseres under anvendelse af en 0,22 um porestørrelse, og opvarmes til 37 ° C i et vandbad. </li><li> Optø en cryovial af 5637-celler (American Type Culture Collection HTB-9, stammer fra blærecarcinom) i et 37 ° C...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+chamber+in+chemotaxis.">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li><li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration:+implications+in+mediating+epithelial+injury.">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li><li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+migration+of+neutrophils:+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury.">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria.">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li><li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration.">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+by+uropathogenic+bacteria+attenuates+innate+responses+to+epithelial+infection.">Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection.</a> J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).</li><li>Haraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+resistance+to+urinary+tract+infection.">Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection.</a> J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).</li><li>Billips, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+innate+immune+response+in+the+bladder+by+uropathogenic+Escherichia+coli.">Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).</li><li>Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase.">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li><li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration.">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li><li>S&#228;ve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration.">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li><li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism.">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

Ved hjælp af en dyrket blære epitelcellelinie og frisk isolerede humane PMN etablerede vi en in vitro model af transuroepithelial neutrofil migration. Denne model har været medvirkende begynder at dissekere kompleksiteten i respons det medfødte immunforsvar i løbet af urinvejsinfektion (UTI), en yderst almindelig bakteriel infektion typisk forårsaget af UPEC 9.. Under infektion af blæren eller blærebetændelse, er afgørende for bakteriel clearance 10 rekruttering af PMN til blære...

Bevægelsen af ​​celler i hele kroppen, ofte over store afstande, der kræves for vækst og udvikling, sårheling og immunrespons. Cellemigrering er kompleks og kræver koordinering af mange forskellige processer, herunder signaleringskaskader og omlejring af cytoskeletale komponenter. Celler kan bevæge sig tilfældigt (kemokinese) samt mod definerede kemiske gradienter (chemotaxis). Mange teknikker er blevet udviklet til at studere celle-migration in vitro. Den ældste og mest almindelige teknik, den Boydenkammer, består af en lodret to-kammer-system, hvor en chemoattractant Stoffet anbringes i den nederste kammer og celler af interesse er placeret i den øverste kammer 1.. Overvåges Bevægelsen af ​​celler på tværs af gennemtrængelige filter med porer med defineret størrelse, der adskiller de to kamre. Yderligere teknikker er blevet udviklet for at undersøge cellemigration herunder Zigmond kammeret 2 og Dunn kammer3. Disse kollektive tilgange har givet betydelig indsigt i bevægelsen af ​​mange forskellige celletyper. Ud over at udspørgende de grundlæggende principper for kemokinese og kemotaxi, har to-kammer assays lettet undersøgelsen af ​​cellemigrering gennem ekstracellulære matrixkomponenter og både endotelceller og epitelceller lag. En fordel ved to-kammer-systemer i forhold til andre teknikker er, at den porøse membran kan overtrækkes med proteiner, såsom collagen eller fibrinogen, og cellemigration over en ekstracellulær matrix-lignende barriere kan vurderes. Derudover kan dyrkede cellelinier dyrkes og differentieres på de gennemtrængelige understøtninger. For at undersøge bevægelsen af ​​celler på tværs af en endotel barriere er dyrkede endotelceller podes og dyrkes i det øvre reservoir af gennemtrængelige understøtninger. Motile celler, såsom immunceller, tilsættes til den øvre reservoir og migration ind i det nedre reservoir over enobserveres dothelial barriere i fysiologisk apikal-til-basolateral retning. Denne model har været uvurderlig i forståelsen ekstravasation af immunceller ud af blodet. I modsætning til transendothelial migration, forekommer typisk flytning af celler på tværs af en epitelbarriere i den basolaterale-til-apikal retning. For at modellere disse begivenheder in vitro forskere frø og vokse dyrkede epitelceller på undersiden af de gennemtrængelige understøtninger. Motile celler tilsættes til det øvre reservoir og migration over epitelbarrieren, repræsenterer den basolaterale-til-apikale retning, overvåges. Sådanne modeller af transepithelial migration har bidraget betydeligt til vores forståelse af inflammatoriske reaktioner på slimhindeoverflader, især i lungerne og gut 4,5. I modsætning hertil har immuncelle handel gennem epitel urinvejene fået meget mindre opmærksomhed. For at fremme vores understanding medfødte immunresponser i urinvejene under infektion med uropatogen Escherichia coli (UPEC), har vi udviklet et in vitro assay transuroepithelial neutrofil migration assay, der muliggør undersøgelse af polymorfkernede leukocyt (PMN; neutrofiler) bevægelse på tværs af en blære epitelbarrieren 6 -8. Som med andre to-kammer modeller af transepithelial migration, er dyrkede humane blære epitelceller dyrket på undersiden af ​​en permeabel støtte og danner konfluerende epiteliale lag. Humane neutrofiler, isoleret fra venøst ​​blod, der anvendes til den basolaterale side af epithellaget og migration over epitelet i fysiologisk relevant basolaterale-til-apikale retning kvantificeres som reaktion på infektion med forskellige stammer af E. coli eller tilstedeværelsen af kemotiltrækkende molekyler. Meget forskning havde fokuseret på neutrofil bevægelse, både kemokinese og kemotaksi i fravær af yderligere celletyper. Den transuroepithelial neutrofilmigration analysen er fordelagtig, da det tager hensyn til komplekse vekselvirkninger mellem blære epitelceller og immunceller under infektion. Dette medgørlig in vitro-model har potentiale til at tillade detaljeret undersøgelse af immunreaktioner på uroepitele overflader.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Inserts (i.e.&#160;permeable supports)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>6.5 mm, 3 &#956;m pore, polyester membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>366480</td>
			<td>16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>367281</td>
			<td>21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use, nonstackable holder</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4876</td>
			<td>From Leuconostoc mesenteroides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>24-well, clear flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reconstituted in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CXCL8/IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td>Reconstituted in PBS to 100 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium

Rekrutteringen af ​​immunceller fra periferien til stedet for inflammation er et vigtigt skridt i indsatsen på enhver slimhindeoverflade medfødte immunforsvar. Under infektion af urinblæren, polymorfkernede leukocytter (PMN; neutrofiler) migrere fra blodbanen og krydse blæren epitel. Manglende løse infektion i fravær af en neutrofile respons viser betydningen af ​​PMN i blæren forsvar. For at lette kolonisering af blæren epitel, uropatogen Escherichia coli (UPEC), det kausative middel for hovedparten af urinvejsinfektioner (UVI), dæmpe akut inflammatorisk reaktion ved hjælp af en række delvist definerede mekanismer. For yderligere at undersøge samspillet mellem vært og bakterielt patogen, udviklede vi en in vitro model for dette aspekt af reaktionen på UPEC medfødte immunreaktion. I transuroepithelial neutrofilmigration assay, en variation på Boydenkammer, kulturperler blære epithelial Cellerne dyrkes til konfluens på undersiden af ​​en permeabel støtte. PMN isoleres fra humant veneblod og er anbragt på den basolaterale side af blæren epitelcelle lag. PMN migration repræsenterer fysiologisk relevant basolaterale-til-apikale retning som reaktion på bakteriel infektion eller kemotiltrækkende molekyler optælles ved hjælp af et hæmocytometer. Denne model kan anvendes til at undersøge interaktionen mellem UPEC og eukaryote celler, såvel som at forespørge de molekylære krav til traversal blære epithel af PMN. Den transuroepithelial neutrofilmigration model vil fremme vores forståelse af den oprindelige inflammatoriske respons på UPEC i blæren.

Den transuroepithelial neutrofil migration assay muliggør kvantitativ vurdering af menneskelige PMN-migration over dyrkede blære epitelcelle lag som reaktion på forskellige stimuli (figur 1B). Mens protokollen er ligetil, er der en række variable, der kan påvirke PMN migration og dermed påvirke reproducerbarheden af ​​denne assay. Der bør træffes foranstaltninger, mens udarbejdelsen af ​​de gennemtrængelige understøtninger og PMN at mindske variationen mellem de tekniske og biologiske ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium at JoVE.com

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Kvantitativ vurdering af human neutrofil migration over en Kulturperler Blære epitel

Vi har udviklet en in vitro-model, der efterligner en vigtig komponent i den akutte inflammatoriske respons under infektion af blæren med uropatogen Escherichia coli. Den transuroepithelial neutrofil migration assay muliggør kvantitativ vurdering af human neutrofil migration over blæren epitel, dyrket på permeable understøtninger, som reaktion på bakteriel infektion eller kemotiltrækkende stoffer.

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

En kvantitativ vurdering af Cell Migration af Phagokinetic Track Motilitet Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay at vurdere Patogen induceret Neutrophil Trans-epitel Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Human neutrofil strømningskammeret adhæsionsassay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Udvikling og Identifikation af en roman underpopulation af human neutrofil-afledte Giant fagocytter<em&gt; In vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine neutrofile ekstracellulære fælde dannelse: Dynamisk og kvantitativ analyse af Fluorescens mikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Vurdering af lymfocyt migration i et ex vivo-Transmigrerings system

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Funktionel vurdering af tarmgennemtrængelighed og neutrofil transepithelial migration hos mus ved hjælp af en standardiseret tarmsløjfemodel

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...