Name: quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium
Uploaded: 2013-11-07T19:40:00
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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health (NIH) unterstützt gewährt R01-DK080752 und P50-DK064540. Wir danken J. Loughman für ihre Bemühungen bei der Schaffung dieses Tests.

1. Kulti 5637 Blase Epithelzellen Führen Sie die folgenden Schritte in einer Laminar-Flow-Gewebekultur Kapuze mit UV-Bestrahlung vorbereitet und sich mit 70% Ethanol abgewischt. <ol><li> Vorbereitung RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) [bezeichnet RPMI +], Filter sterilisiert unter Verwendung eines 0,22 &amp;mgr; m Porengröße filtriert und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Tauwetter ein Kryoröhrchen von 5637 Zellen (American Type Culture Collection HTB-9, v...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+chamber+in+chemotaxis.">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li><li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration:+implications+in+mediating+epithelial+injury.">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li><li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+migration+of+neutrophils:+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury.">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria.">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li><li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration.">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase.">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li><li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration.">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li><li>S&#228;ve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration.">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li><li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism.">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

Mit einem kultivierten Blasenzelllinie und frisch isolierten menschlichen PMN, haben wir ein in vitro Modell der transuroepithelial Migration von Neutrophilen. Dieses Modell wurde bei der Anfang, um die Komplexität der angeborenen Immunantwort während Harnwegsinfektion (HWI), eine extrem häufige bakterielle Infektion in der Regel durch UPEC 9 verursacht sezieren. Während der Infektion der Blase oder Zystitis ist Rekrutierung von PMN zu den Blasenlumen wichtig für bakterielle Clearance 10.</...

Die Bewegung der Zellen im gesamten Körper, oft über lange Strecken, für Wachstum und Entwicklung, Wundheilung, Immunantwort und erforderlich. Zellmigration ist komplex und erfordert die Koordinierung der verschiedenen Verfahren, einschließlich Signalkaskaden und die Umlagerung von Zytoskelett-Komponenten. Die Zellen können nach dem Zufallsprinzip zu definierten chemischen Gradienten (Chemotaxis) bewegen (Chemokinese) sowie. Viele Techniken wurden entwickelt, um die Zellmigration in vitro zu studieren. Die älteste und am weitesten verbreitete Technik, die Boyden-Kammer, bestehend aus einer vertikalen Zweikammersystem, in dem eine chemoattraktive Substanz in der unteren Kammer und die interessierenden Zellen angeordnet sind in der oberen Kammer 1 angeordnet. Die Bewegung der Zellen über die durchlässige Filter mit Poren definierter Größe zwischen den beiden Kammern wird überwacht. Zusätzliche Techniken entwickelt worden, um Zellmigration zu untersuchen, einschließlich der Zigmond Kammer 2 und der Kammer Dunn3. Diese kollektive Ansätze wichtige Einblicke in die Bewegung von vielen verschiedenen Zelltypen ergeben. Zusätzlich zur Abfrage der Grundprinzipien der Chemokinese und Chemotaxis, haben Zweikammer-Tests für die Untersuchung von Zellmigration durch extrazelluläre Matrixkomponenten und sowohl endotheliale und epitheliale Zellschichten erleichtert. Ein Vorteil des Zweikammersysteme gegenüber anderen Techniken ist, dass die poröse Membran mit Proteinen wie Kollagen oder Fibrinogen beschichtet werden, und die Zellmigration in einem extrazellulären Matrix-ähnlichen Barriere kann beurteilt werden. Zusätzlich kann kultivierten Zelllinien gezüchtet und auf den durchlässigen Träger unterschieden werden. Um die Bewegung von Zellen in einer endothelialen Barriere zu untersuchen, werden kultivierte Endothelzellen ausgesät und in das obere Reservoir der durchlässigen Träger aufgewachsen. Bewegliche Zellen, wie Immunzellen, sind in den oberen Stausee und Migration in das untere Reservoir über die en hinzugefügtEndothel-Barriere in der physiologischen apikal-to-basolateralen Richtung beobachtet wird. Dieses Modell wurde im Verständnis Extravasation von Immunzellen aus dem Blutstrom von unschätzbarem Wert. Im Gegensatz zu transendotheliale Migration, die Bewegung von Zellen in einer epithelialen Barriere tritt typischerweise in der basolateralen-zu-apikal. Um diese Ereignisse in-vitro-Modell, Forschern und Samen wachsen kultivierten Epithelzellen an der Unterseite der durchlässigen Träger. Bewegliche Zellen werden in das obere Reservoir und Migration über die epitheliale Barriere, die die basolaterale-zu-apikal zugegeben wird überwacht. Solche Modelle der transepithelialen Migration haben wesentlich zu unserem Verständnis von Entzündungsreaktionen an Schleimhautoberflächen, insbesondere der Lunge und Darm 4,5 beigetragen. Im Gegensatz dazu hat Immunzelltransport durch das Epithel der Harnwege viel weniger Aufmerksamkeit erhalten. Um unsere understandi weiter(; Neutrophilen PMN) Bewegung über eine Blase epithelialen Barriere 6 ng der angeborenen Immunantwort in den Harnwegen während der Infektion mit uropathogenen Escherichia coli (UPEC), einem in-vitro-Test, der die Migration von Neutrophilen transuroepithelial Assay, die Untersuchung von polymorphkernigen Leukozyten ermöglicht entwickelten wir -8. Wie bei anderen Zweikammer-Modelle der transepithelialen Migration werden kultivierten humanen Epithelzellen der Blase an der Unterseite einer durchlässigen Träger gewachsen und bilden konfluente epitheliale Schichten. Menschliche Neutrophile aus venösem Blut isoliert werden zur basolateralen Seite der epithelialen Schicht aufgebracht, und die Migration in das Epithel im physiologisch relevanten basolateralen zu apikaler Richtung in Reaktion auf eine Infektion mit verschiedenen Stämmen von E. quantifiziert coli oder das Vorhandensein von chemoattraktiven Moleküle. Viel Forschung auf Neutrophilen Bewegung konzentriert hatte, sowohl Chemokinese und Chemotaxis, in Abwesenheit von zusätzlichen Zelltypen. Die transuroepithelial Migration von Neutrophilen-Test ist von Vorteil, da es berücksichtigt komplexen Wechselwirkungen zwischen Blase Epithelzellen und Immunzellen während der Infektion. Diese gefügig in vitro-Modell hat das Potenzial, um die detaillierte Untersuchung von Immunreaktionen bei uroepithelial Oberflächen zu ermöglichen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Inserts (i.e.&#160;permeable supports)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>6.5 mm, 3 &#956;m pore, polyester membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>366480</td>
			<td>16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>367281</td>
			<td>21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use, nonstackable holder</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4876</td>
			<td>From Leuconostoc mesenteroides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>24-well, clear flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reconstituted in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CXCL8/IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td>Reconstituted in PBS to 100 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium

Die Rekrutierung von Immunzellen von der Peripherie zum Ort der Entzündung ist ein wesentlicher Schritt bei der angeborenen Immunantwort zu jedem Schleimhautoberfläche. Während der Infektion der Harnblase, polymorphkernige Leukozyten (PMN; Neutrophile) wandern aus dem Blutkreislauf zu durchqueren und die Blase Epithel. Nicht Infektion in Abwesenheit einer Antwort neutrophilen beheben zeigt die Bedeutung der PMN in der Blase Verteidigung. Zur Besiedlung der Blase Epithel, uropathogenen Escherichia coli (UPEC) zu erleichtern, der Erreger der Mehrheit der Harnwegsinfektionen (HWI), dämpfen die akute Entzündungsreaktion mit einer Vielzahl von teilweise definierten Mechanismen. Zur weiteren Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Wirt und Bakterien-Pathogen, ein in vitro-Modell von diesem Aspekt der angeborenen Immunantwort zu UPEC entwickelten wir. In der transuroepithelial Migration von Neutrophilen-Test, eine Variante der Boyden-Kammer, kultivierte Blase epithElial Zellen gezüchtet werden, um auf die Unterseite eines durchlässigen Träger Konfluenz. PMN aus menschlichem venösem Blut isoliert und zur basolateralen Seite der Blase epithelialen Zellschichten aufgebracht. PMN-Migration, das die physiologisch relevante basolateralen zu apikaler Richtung in Reaktion auf eine bakterielle Infektion oder chemoattraktive Moleküle mit einer Zählkammer gezählt. Dieses Modell kann verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen UPEC und eukaryontischen Zellen zu untersuchen sowie die molekularen Anforderungen für die Durchquerung von Blasen Epithelien von PMN abzufragen. Die Migration von Neutrophilen transuroepithelial Modell wird unser Verständnis der Anfangs entzündliche Reaktion auf UPEC in der Blase zu fördern.

Die transuroepithelial Neutrophilenmigration Assay ermöglicht die quantitative Bewertung der menschlichen PMN-Migration in kultivierten Epithelzellen Blasenschichten als Reaktion auf verschiedene Reize (Abbildung 1B). Während das Protokoll ist einfach, es gibt eine Reihe von Variablen, die PMN-Migration zu beeinflussen und folglich auf die Reproduzierbarkeit des Assays kann. Die Maßnahmen sollten während der Vorbereitung die durchlässigen Träger und der PMN an Variabilität zwischen technischen un...

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Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Quantitative Bewertung der humanen neutrophilen Migration Über eine Zucht Blasenepithel

Wir entwickelten ein in vitro-Modell, das eine wichtige Komponente der akuten Entzündungsreaktion während der Infektion der Blase mit uropathogenen Escherichia coli nachahmt. Die transuroepithelial Neutrophilenmigration Assay erlaubt die quantitative Beurteilung der humanen neutrophilen Migration über Blasen Epithelien auf lässigen Träger kultiviert, in Reaktion auf eine bakterielle Infektion oder chemoattraktiven Stoffen.

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

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Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

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In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...