Name: quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium
Uploaded: 2013-11-07T19:40:00
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この作品は、衛生研究所（NIH）の国立研究所によってサポートされていましたR01-DK080752およびP50-DK064540を付与します。私たちは、このアッセイを確立する彼女の努力のためにJ·ロフマンに感謝します。

1。 5637膀胱上皮細胞を培養層流の組織培養フードUV照射を用いて調製し、70％エタノールで拭いで次の手順を実行します。 <ol><li>水浴中で10％ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI-1640培地を調製[RPMI +称される]、フィルターは、0.22μmの孔径のフィルターを用いて滅菌し、37℃に加温し。 </li><li> 37℃の水浴中で、5637細胞（膀胱癌由来アメリカン·タイプ·カルチャー·コレクショ?...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+chamber+in+chemotaxis.">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li><li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration:+implications+in+mediating+epithelial+injury.">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li><li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+migration+of+neutrophils:+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury.">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria.">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li><li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration.">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+by+uropathogenic+bacteria+attenuates+innate+responses+to+epithelial+infection.">Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection.</a> J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).</li><li>Haraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+resistance+to+urinary+tract+infection.">Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection.</a> J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).</li><li>Billips, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+innate+immune+response+in+the+bladder+by+uropathogenic+Escherichia+coli.">Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).</li><li>Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase.">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li><li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration.">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li><li>S&#228;ve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration.">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li><li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism.">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

培養された膀胱上皮細胞株および新たに単離されたヒトPMNを使用して、我々はtransuroepithelial好中球遊走のインビトロモデルを確立した。このモデルは、尿路感染症（UTI）の間に自然免疫応答、通常UPEC 9に起因する非常に一般的な細菌感染症の複雑さを分析し始めに尽力されています。膀胱、または膀胱炎の感染の間に、膀胱内腔へのPMNの補充は、細菌のクリアランス10?...

全身の細胞の動きは、多くの場合、長い距離を越え、成長と発展、創傷治癒、および免疫応答に必要です。細胞移動は複雑であり、シグナル伝達カスケードおよび細胞骨格成分の再配置を含む多くの異なるプロセスの調整を必要とする。細胞は（ケモキネシス）だけでなく、定義された化学勾配（走化性）に向かってランダムに移動することができます。多くの技術は、 インビトロで細胞遊走を研究するために開発されてきた。最も古く、最も一般的な手法、Boydenチャンバーは、化学誘引物質は下部チャンバー内に配置され、目的の細胞を上部チャンバー1内に配置された垂直2チャンバシステムで構成されています。二つのチャンバーを分離する規定サイズの孔を有する通気フィルターを横切る細胞の移動は、監視される。さらなる技術は、Zigmond室2及びダンチャンバを含む、細胞移動を研究するために開発されている3。これらの集合的なアプローチは、多くの異なる細胞型の移動に重要な洞察が得られている。 ケモキネシスおよび走化性の基本原理に問い合わせることに加えて、二チャンバーアッセイは、細胞外マトリックス成分との両方の内皮細胞および上皮細胞層を介して細胞移動の調査を促進した。他の技術上の2つのチャンバシステムの利点は、多孔質膜は、例えば、コラーゲンまたはフィブリノーゲンのようなタンパク質でコーティングすることができる、および細胞外マトリックス状の障壁を横切る細胞移動を評価することができることである。さらに、培養細胞株を増殖させ、透過性の支持体上で区別することができる。内皮障壁を横切る細胞の移動を調べるために、培養内皮細胞を播種し、透過性支持体の上部リザーバ中で増殖させる。例えば、免疫細胞などの運動性細胞は、エン全体の下池に上部貯水池と移行に追加されます生理学的な頂端から側底方向にdothelial障壁が観察される。このモデルは、血流からの免疫細胞の血管外遊出を理解する上で非常に貴重であった。移行を経内皮とは対照的に、上皮バリアを横切る細胞の移動は、典型的には、側底側から頂端方向に発生する。 インビトロでこれらのイベントをモデル化するために、研究者らは、透過性支持体の下側に培養上皮細胞を播種し、成長する。運動性の細胞は側底から頂端方向を表す、上皮バリアを横切る上側リザーバおよび遊走に追加され、監視される。経上皮の移行のようなモデルが大幅に粘膜表面での炎症反応、特に肺のものと、4,5腸の我々の理解に貢献した。 対照的に、尿路の上皮を介して免疫細胞の輸送はそれほど注目されている。私たちのunderstandiを促進するために膀胱上皮バリア6渡って動き、（好中球、PMN）NG尿路病原性大腸菌 （UPEC）による感染時の尿路内の自然免疫応答のため、我々は多形核白血球の調査を可能にするin vitroアッセイ、transuroepithelial好中球遊走アッセイを開発-8。経上皮遊走の他の二チャンバーモデルと同様に、培養されたヒト膀胱上皮細胞は、透過性支持体の下側に増殖させ、コンフルエント上皮層を形成している。静脈血から単離されたヒト好中球は、上皮層の側底側に適用され、生理学的に関連する側底から頂端方向に上皮を横切る遊走は、E.の異なる株による感染に応答して定量化される大腸菌や化学誘引分子の存在。多くの研究は、追加の細胞型の非存在下での好中球の移動、ケモキネシスおよび走化性の両方に焦点を当てていた。それは考慮感染の間、膀胱上皮細胞と免疫細胞との間の複雑な相互作用を要するようtransuroepithelial好中球遊走アッセイは有利である。この扱いやすいin vitroモデルは、尿路上皮表面における免疫応答の詳細な調査を許可する可能性を秘めている。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Inserts (i.e.&#160;permeable supports)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>6.5 mm, 3 &#956;m pore, polyester membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>366480</td>
			<td>16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>367281</td>
			<td>21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use, nonstackable holder</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4876</td>
			<td>From Leuconostoc mesenteroides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>24-well, clear flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reconstituted in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CXCL8/IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td>Reconstituted in PBS to 100 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium

炎症部位への周囲からの免疫細胞の動員は、任意の粘膜表面での自然免疫応答において重要なステップです。膀胱の感染の間に、多形核白血球（PMN、好中球）は、血流から移動した膀胱上皮を横断する。好中球応答がない場合に感染を解決しないと、膀胱防御にPMNの重要性を示している。膀胱上皮、尿路病原性大腸菌 （UPEC）、尿路感染症（UTI）の大部分の原因物質の定着を促進するために、部分的に定義された様々な機構を使用して急性炎症反応を弱める。さらに、ホストおよび細菌病原体の間の相互作用を調べるために、我々はUPECに対する自然免疫応答のこの態様のインビトロモデルを開発した。 transuroepithelial好中球遊走アッセイでは、Boydenチャンバーのバリエーション、培養された膀胱epithelial細胞は透過性支持体の下側に密集するまで成長させる。 PMNは、ヒト静脈血から単離され、膀胱上皮細胞層の側底側に適用される。細菌感染または化学誘引物質の分子に反応して、生理的に適切な基底外側への頂端方向を表すPMNの移行は、血球計数器を使用して列挙されている。このモデルは、UPECおよび真核細胞間の相互作用を調査するために、ならびにPMNによる膀胱上皮のトラバーサルのための分子の要件を調べるために使用することができる。 transuroepithelial好中球遊走モデルは、膀胱内のUPECへの初期炎症反応の我々の理解を促進します。

transuroepithelial好中球遊走アッセイは、種々の刺激（ 図1B）に対応して培養し、膀胱上皮細胞層全体の人間のPMNの移行の定量的評価が可能になります。プロトコルは単純であるが、PMN遊走に影響を及ぼし、その結果、このアッセイの再現性に影響を与えることができる変数の数がある。技術的、生物学的反復間の変動を減らすために透過性をサポートし、PMNの準備中な処置を行う?...

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Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

培養された膀胱上皮を越えるヒト好中球の移行の定量的評価

私たちは、尿路病原性大腸菌で膀胱の感染中の急性の炎症反応の重要な要素を模倣したin vitroモデルを開発しました。 transuroepithelial好中球遊走アッセイは、細菌感染や化学誘引物質に反応して、透過性の支持体上で培養、膀胱上皮間でヒト好中球の遊走の定量的評価が可能になります。

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

インビトロ 病原体誘導性好中球トランス上皮移動を評価するコーカルチャーアッセイ

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

ヒト好中球由来の巨大食細胞の新規亜集団の開発および同定<em&gt;インビトロ</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

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体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...