Name: budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications
Uploaded: 2013-10-30T22:35:00
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Nous remercions tous les membres du laboratoire Kerscher pour leur soutien. Nous remercions Mark Hochstrasser pour la souche de levure MHY3765. Ce travail a été soutenu par la NSF subvention 1051970 (OK) et Hughes Medical Institute cycle de subvention de voyage Howard et Monroe Scholars Programme de subventions (pour ES).

Purification des protéines marquée à la 6XHis exprimés dans les cellules de levure en herbe dans des conditions natives 1. La croissance des cellules de levure et l&#39;induction de l&#39;expression des protéines (Modification de 2) OPTION: Utilisez croissance logarithmique des cultures de levures exprimant la protéine d&#39;intérêt à la place des cultures galactose induits décrits ci-dessous. <ol><li> Transformer des cellules d&#39;un...

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein.">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to protein purification. , (1990).</li><li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+Method:+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid.">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).</li><li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

Ce protocole met l&#39;accent sur la préparation du intact, indigène, et modifications post-traductionnelles des protéines à partir de cellules de levure en herbe pour les applications en aval. Avant de tenter ce protocole, il est essentiel de déterminer si la protéine d&#39;intérêt peut être facilement détectée dans des extraits protéiques préparés dans des conditions dénaturantes 12. Si des anticorps polyclonaux sont pas disponibles, il peut être avantageux d&#39;épitope tag la protéine d&...

La puissance impressionnante de levure génétique est légendaire, mais la préparation et l&#39;analyse des protéines natives de levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae, est souvent source de nombreux problèmes. Celle-ci est due à la résistance mécanique importante et l&#39;élasticité de la paroi une cellule de levure. Différents moyens ont été décrits pour la perturbation des cellules de levure pour obtenir un extrait de protéines de cellules entières 2-6 enzymatique, chimique, mécanique, et basée sur la pression. Ces techniques varient considérablement dans leur efficacité à produire des extraits de protéines de cellules représentatives, indigènes qui peuvent être utilisés pour des analyses ultérieures ou des étapes de purification. Par exemple, la paroi cellulaire de la levure peut être retiré avec des enzymes lytiques (par exemple zymolyase) et sphéroblastes résultant peut être perturbé par cisaillement, des détergents, ou lyse osmotique pour libérer des protéines. Cette approche a été utilisée avec succès comme point de départ pour de nombreux fractionnements subcellulaires mais il exige de longues incubationsqui ne sont pas compatibles avec la stabilité de certaines protéines 7. Propriétaires réactifs de lyse de levure (tels que les détergents) pour l&#39;extraction chimique des protéines de cellules de levure sont disponibles dans le commerce, mais l&#39;efficacité de ces réactifs dans l&#39;extraction des protéines et de leurs effets sur la caractérisation biochimique ultérieure des protéines n&#39;est pas toujours clair 8. Homogénéisateurs haute pression, souvent appelés presses françaises, briser efficacement les cellules de levure d&#39;abord en les soumettant à une pression élevée, puis les extruder à travers une petite ouverture dans une cellule de pression. Cette technique produit des extraits de haute qualité, mais le matériel est très coûteux et peut ne pas convenir pour de petites quantités de cellules ou de plusieurs échantillons 9. Par conséquent, une rupture mécanique des cellules de levure dans un broyeur à billes est souvent la méthode de choix pour les préparations de protéines de levure indigène 10. Cette technique implique la rupture mécanique de la paroi cellulaire de la levure avec de l&#39;acide-wajeter des perles de verre, qui peut être réalisé avec une variété de shakers, vortexeurs ou broyeurs à billes. Notamment, cette méthode peut être utilisée pour traiter simultanément plusieurs échantillons plus petits (1 ml de cellules ou moins). De nombreuses perles différentes matrices de perles ou de perturbation de l&#39;usine sont maintenant disponibles commercialement pour perturber presque n&#39;importe quel genre de type de cellule en tubes de 2 ml. Compte tenu des autres techniques et de l&#39;équipement, un broyeur à billes a l&#39;avantage supplémentaire que la perturbation des cellules de levure se produit très rapidement, ce qui contribue à préserver modifications post-traductionnelles telles que la sumoylation, surtout quand les tampons appropriés avec la protéase et / ou inhibiteurs du protéasome sont utilisés et la température d&#39;extraits est contrôlée. Ce protocole porte sur l&#39;extraction rapide, efficace et fiable de protéines endogènes et surexprimé dans des conditions douces avec l&#39;objectif ultime de préserver la fonction des protéines, des interactions et des modifications post-traductionnelles. Les milieux de culture, tampons de lyse cellulairecompositions et les paramètres de broyeur à billes sont optimisés pour maintenir les interactions entre protéines et des modifications post-traductionnelles telles que la sumoylation et l&#39;ubiquitination.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

Homogénéisation en battant perle est un moyen rapide et efficace pour libérer l&#39;ADN, l&#39;ARN, les protéines et les métabolites à partir de cellules de levure en herbe, qui sont notoirement difficiles à perturber. Nous décrivons ici l&#39;utilisation d&#39;un homogénéiseur broyeur à billes pour l&#39;extraction des protéines dans des tampons optimisés pour maintenir les fonctions, les interactions et les modifications post-traductionnelles des protéines. Cellules en croissance logarithmique exprimant la protéine d&#39;intérêt sont cultivées dans un milieu de croissance liquide de choix. Les milieux de culture peuvent être complétées par des réactifs pour induire l&#39;expression de la protéine à partir de promoteurs inductibles (par exemple le galactose), synchroniser stade du cycle cellulaire (par exemple le nocodazole), ou d&#39;inhiber la fonction du protéasome (par exemple MG132). Les cellules sont ensuite culot et remises en suspension dans un tampon approprié contenant la protéase et / ou inhibiteurs de phosphatases et soient traités immédiatement ou congelés dans l&#39;azote liquide pour une utilisation ultérieure. L&#39;homogénéisation est réalisée par six cycles de 20 sec bead-battement (5,5 m / s), chacun suivi d&#39;une incubation d&#39;une minute sur la glace. L&#39;homogénat obtenu est clarifié par centrifugation et les petites particules peut être éliminé par filtration. L&#39;extrait de cellules entières dégagé résultant (WCE) est précipité en utilisant 20% de TCA pour l&#39;analyse directe des protéines totales par SDS-PAGE suivie par Western blot. Extraits sont également appropriés pour la purification par affinité de protéines spécifiques, la détection des modifications post-traductionnelles, ou l&#39;analyse de protéines co-purification. Comme c&#39;est le cas pour la plupart des protocoles de purification des protéines, des enzymes et des protéines peuvent exiger des conditions particulières ou des compositions de tampons pour leur purification et d&#39;autres peuvent être instables ou insoluble dans les conditions indiquées. Dans ce dernier cas, le protocole présenté peut fournir un point de départ utile pour déterminer empiriquement la meilleure stratégie de perles battre pour l&#39;extraction et purification des protéines. Nous montrons l&#39;extraction et la purification d&#39;un épitope étiqueté SUMO E3 ligase, SIZ1, un cycle cellulaireréglage protéine qui devient à la fois sumoylée et phosphorylé, ainsi que d&#39;une sous-unité de l&#39;ubiquitine ligase SUMO ciblée, Slx5.

Nos résultats représentatifs révèlent que le protocole d&#39;extraction de perles coups et protéine décrite est utile pour la préparation reproductible de protéines pour une variété d&#39;applications en aval (résumées dans le tableau 2). SDS-PAGE suivie d&#39;une coloration de Coomassie de ACEE montrent qu&#39;une large gamme de protéines (~ 12 à&gt; 250 kDa) peut être reproductible extrait des cellules de levure (figure 1A). Bandes discrètes sur une gamme de poids mol?...

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Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

La préparation d&#39;extraits de levure de haute qualité est une première étape nécessaire à l&#39;analyse des protéines individuelles ou protéomes entiers. Nous décrivons ici un protocole d&#39;homogénéisation rapide, efficace et fiable pour les cellules de levure en herbe qui a été optimisé afin de préserver les fonctions des protéines, des interactions et des modifications post-traductionnelles.

Bourgeonnement de levure extraction et purification des protéines pour l&#39;étude de la fonction, Interactions, et des modifications post-traductionnelles

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