Name: budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications
Uploaded: 2013-10-30T22:35:00
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Wir danken allen Mitgliedern der Kerscher Labor für ihre Unterstützung. Wir danken Mark für Hochstrasser Hefestamm MHY3765. Diese Arbeit wurde von der NSF 1051970 (OK) und Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Reisestipendium und Monroe Scholars Program Grant (ES) unterstützt.

Reinigung von 6xHis-markierte Proteine ​​in Hefe-Zellen unter nativen Bedingungen ausgedrückt 1. Wachstum von Hefe-Zellen und Induktion der Proteinexpression (Geändert von 2) Optional: Verwenden logarithmisch wachsenden Hefekulturen Ausdruck Protein von Interesse anstelle der Galaktose-induzierten Kulturen beschrieben. <ol><li> Verwandeln Zellen eines Gal + Hefestamm mit einem Plasmid, das ein Galaktose-induzierbaren 6XHIS-marki...

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein.">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. 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W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Herstellung von intakten, nativen und posttranslational modifizierte Proteine ​​von Hefe-Zellen für down-stream Applikationen. Bevor dieses Protokoll, ist es wichtig zu bestimmen, ob das Protein von Interesse kann leicht in Proteinextrakte unter denaturierenden Bedingungen 12 hergestellt detektiert werden. Wenn polyklonale Antikörper nicht verfügbar sind, kann es vorteilhaft sein, Epitop-Markierung des Proteins von Interesse, so dass das Fusionsprotein auf Wes...

Die gewaltige Kraft der Hefegenetik ist legendär, aber die Vorbereitung und Analyse von nativen Proteinen aus Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, ist oft mit Problemen behaftet. Letzteres ist aufgrund der hohen mechanischen Festigkeit und Elastizität der Hefezellwand 1. Verschiedene Mittel sind für die enzymatische, chemische, mechanische und Druck auf die Unterbrechung des Hefe-Zellen zu erhalten, Ganzzell-Proteinextrakt 2-6 beschrieben. Diese Techniken sind sehr unterschiedlich in ihrer Wirksamkeit zu Zell-Vertreter, native Protein-Extrakte, die für spätere Analysen oder Reinigungsschritte verwendet werden können, zu erhalten. Zum Beispiel kann das Hefe-Zellwand mit lytischen Enzymen (zB Zymolyase) und die daraus resultierenden Sphäroblasten entfernt werden kann durch Scherung, Detergenzien oder osmotische Lyse, um Proteine ​​freizusetzen werden. Dieser Ansatz wurde erfolgreich als Ausgangspunkt für viele subzelluläre Fraktionierung eingesetzt, aber es erfordert langwierige Inkubationendie nicht kompatibel sind mit der Stabilität einiger Proteine ​​7. Proprietary Hefelyse Reagenzien (z. B. Waschmittel) für die chemische Extraktion von Proteinen von Hefezellen sind im Handel erhältlich, aber die Wirksamkeit dieser Reagenzien in Protein-Extraktion und ihre Wirkung auf nachfolgende biochemische Charakterisierung von Proteinen ist nicht immer klar, 8. Hochdruckhomogenisatoren, die oft als Französisch Pressen bezeichnet, effektiv zu brechen Hefezellen durch sie einer ersten hohen Druck und anschließend extrudiert durch eine kleine Öffnung in einer Druckzelle. Diese Technik produziert hochwertige Extrakte aber die Ausrüstung ist sehr teuer und nicht geeignet für kleine Mengen von Zellen oder mehrere Proben 9. Daher ist die mechanische Störung der Hefezellen in einer Kugelmühle oft die Methode der Wahl für die native Hefeprotein Zubereitungen 10. Diese Technik beinhaltet mechanische Zerstörung des Hefe-Zellwand mit Säure-waSchuppen Glasperlen, die mit einer Vielzahl von Schüttler, Vortexer oder Kugelmühlen durchgeführt werden kann. Insbesondere kann dieses Verfahren verwendet werden, um gleichzeitig zu verarbeiten mehrere kleine Proben (1 ml Zellen oder weniger) ist. Viele verschiedene Perlen oder Kugelmühle Störung Matrizen sind jetzt im Handel erhältlich für fast jede Art von Zelltyp in 2-ml-Röhrchen zu stören. Unter Berücksichtigung der sonstigen Techniken und Ausrüstung hat eine Perlmühle den zusätzlichen Vorteil, dass die Unterbrechung des Hefe-Zellen sehr schnell, die hilft, posttranslationale Modifikationen wie sumoylation erhalten auftritt, vor allem, wenn die entsprechenden Puffer mit Protease-und / oder Proteasom-Inhibitoren verwendet werden, und die Temperatur der Extrakte gesteuert wird. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die schnelle, effektive und zuverlässige Extraktion von endogenen und überexprimierten Proteine ​​unter schonenden Bedingungen mit dem Ziel, um Protein-Funktion, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten. Nährmedien, ZelllysepufferZusammensetzungen und Perlmühle Einstellungen optimiert, um Protein-Wechselwirkungen und posttranslationale Modifikationen wie sumoylation und Ubiquitinierung halten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

Homogenisierung Wulst Prügel ist eine schnelle und effiziente Möglichkeit, DNA, RNA, Proteine ​​und Metaboliten aus Hefe-Zellen, die notorisch schwer zu stören sind freizugeben. Hier beschreiben wir die Verwendung einer Perlmühle homogenisiert zur Gewinnung von Proteinen in Puffer optimiert, um die Funktionen, die Interaktion und post-translationalen Modifikationen von Proteinen zu erhalten. Logarithmisch wachsenden Zellen, die das Protein von Interesse in einem flüssigen Wachstumsmedium Wahl geworden. Die Nährmedien mit Reagenzien können ergänzt werden, um die Proteinexpression von Promotoren (zB Galaktose) zu induzieren, synchronisieren Zellzyklusstadium (zB Nocodazol) oder hemmen Proteasom-Funktion (zB MG132). Die Zellen werden dann pelletiert und in einem geeigneten Puffer, der Protease und / oder Phosphatase-Inhibitoren und entweder sofort verarbeitet oder in flüssigem Stickstoff für eine spätere Verwendung. Homogenisierung wird durch sechs Zyklen von 20 sec erreicht bead-Schlagen (5,5 m / sec), die jeweils von einem minütigen Inkubation auf Eis. Das erhaltene Homogenisat wird durch Zentrifugation geklärt und kleine Partikel kann durch Filtration entfernt werden. Die resultierende gelöscht Ganzzellextrakt (WCE) ausgefällt mit 20% TCA zur direkten Analyse des gesamten Proteine ​​durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blotting. Extrakte eignen sich auch zur Affinitätsreinigung von spezifischen Proteinen, die Detektion von post-translationalen Modifikationen, oder der Analyse der Co-Reinigung von Proteinen. Wie bei den meisten Proteinreinigung Protokolle können einige Enzyme und Proteine ​​eine eindeutige Bedingungen oder Puffer-Zusammensetzungen für die Reinigung und andere möglicherweise instabil oder unlöslich ist unter den angegebenen Bedingungen. Im letzteren Fall kann das Protokoll präsentiert einen nützlichen Ausgangspunkt, um empirisch die besten Perlen-Prügel Strategie für Protein Extraktion und Reinigung. Wir zeigen die Extraktion und Reinigung eines epitopmarkierter SUMO E3 Ligase Siz1 ein Zellzyklusreguliertes Protein, das sowohl sumoyliert und phosphoryliert, sowie eine gezielte SUMO-Ubiquitin-Ligase-Untereinheit Slx5 wird.

Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Perlen-Schläge und Protein Extraktionsprotokoll nützlich für die reproduzierbare Herstellung von Proteinen für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen (in Tabelle 2). SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung von WCES gefolgt zeigen, dass eine Vielzahl von Proteinen (~ 12 bis&gt; 250 kDa) reproduzierbar aus Hefezellen (1A) extrahiert werden. Diskrete Bands über einen Bereich von Molekulargewichten sind bezeichnend fü...

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Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Die Herstellung von hochwertigen Hefezelle Extrakte ist ein notwendiger erster Schritt in der Analyse einzelner Proteine ​​oder ganze Proteomen. Hier beschreiben wir eine schnelle, effiziente und zuverlässige Homogenisierung Protokoll für Hefe-Zellen, die optimiert wurde, um Protein-Funktionen, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Die Entdeckung und Charakterisierung von Protein-Wechselwirkungen Protein-Funktion Mit HaloTag Technologie

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...