Name: budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications
Uploaded: 2013-10-30T22:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications at JoVE.com

אנו מודים לכל החברים במעבדה Kerscher על תמיכתם. אנו מודים למארק Hochstrasser לזן שמרי MHY3765. עבודה זו נתמכה על ידי NSF מענק 1051970 (לאישור) והווארד יוז רפואי במכון לתואר ראשון ומסעות מענק מונרו חוקרי גרנט תכנית (לES).

טיהור של חלבוני 6xHIS-מתויגים המתבטאים בתאי שמרי ניצנים בתנאים מקומיים 1. צמיחה של תאי שמרים ואינדוקציה של ביטוי חלבון (שונה מ 2) אופציונלי: השתמש וגריתמית תרבויות ש?...

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein.">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to protein purification. , (1990).</li><li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+Method:+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid.">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).</li><li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת שלמה, ילידים, ולאחר translationally שונה חלבונים מתאי שמרי ניצנים עבור יישומים למטה הנחל. לפני שאנסה פרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי לקבוע אם החלבון של עניין ניתן לאתר בקלות בתמציות חלבונים שהוכנו תחת denaturing תנאי 12. אם נוגדני polyclonal אינם זמינים זה עש...

כוח האדיר של שמרי גנטיקה הוא אגדי, אבל ההכנה והניתוח של חלבוני ילידים משמרי ניצנים, Saccharomyces cerevisiae, הוא לעתים קרובות כרוכה בבעיות. האחרון הוא כתוצאה מהחוזק מכאני הניכר והאלסטיות של תא שמרי 1 הקיר. אמצעים שונים כבר תאר להאנזימטית, כימית, מכאני, ומבוסס לחץ השיבוש של תאי שמרים להשיג תמצית חלבון כל תא 2-6. טכניקות אלו משתנות במידה רבה ביעילותם להניב תמציות חלבוני תא נציגויות, ילידים שיכולים לשמש לניתוחים שלאחר מכן או צעדי טיהור. לדוגמה, ניתן להסיר את דופן תא השמרים עם אנזימים ממסים (למשל zymolyase) וכתוצאה מכך יכול spheroblasts להיות מופר על ידי גז, חומרי ניקוי, או תמוגה האוסמוטי לשחרר חלבונים. גישה זו כבר מועסק בהצלחה כנקודה מוצאת לחלוקות subcellular רבות אבל זה דורש incubations ארוךשאינם תואם את היציבות של חלבונים מסוימים 7. ריאגנטים תמוגה שמרי קנייניות (כגון חומרי ניקוי) למיצוי הכימי של חלבונים של תאי שמרים זמינים מסחרי, אבל היעילות של חומרים כימיים האלה במיצוי חלבון והשפעתם על האפיון ביוכימי הבא של חלבונים לא תמיד ברורה 8. homogenizers לחץ גבוה, המכונה לעתים קרובות לוחץ צרפתית, ביעילות לשבור תאי שמרים על ידי חשיפתם הראשונה ללחץ גבוה ולאחר מכן extruding אותם דרך פתח קטן בתא לחץ. טכניקה זו מייצרת תמציות באיכות גבוהות, אבל הציוד מאוד יקר ולא יכול להיות מתאים לכמויות קטנות של תאים או במספר רב של דגימות 9. לכן, הפרעה מכאנית של תאי שמרים בטחנת חרוז היא לעתים קרובות את שיטת בחירה של חלבון הכנות שמרי ילידים 10. טכניקה זו כרוכה בהפרעה מכאנית של דופן תא השמרים עם חומצה-WAלשפוך חרוזי זכוכית, אשר יכול להיות שנערכו עם מגוון רחב של המלשינים, vortexers או טחנות חרוזים. יש לציין, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעבד בו זמנית מספר רב של מדגמים קטנים יותר (1 מ&quot;ל של תאים או פחות). חרוזים שונים או מטריצות שיבוש טחנת חרוז זמינים מסחרי לשבש כמעט כל סוג של תא בסוג 2 צינורות מ&quot;ל עכשיו. בהתחשב בטכניקות ובציוד האחרות, יש טחנת חרוז יתרון נוסף שהשיבוש של תאי שמרים מתרחש מהר מאוד, מה שעוזר לשימור לאחר translational שינויים כגון sumoylation, במיוחד כאשר את המאגרים המתאימים עם פרוטאז ו / או מעכבי proteasome מנוצלים והטמפרטורה של תמציות נשלטת. פרוטוקול זה מתמקד בחילוץ המהיר, יעיל, ואמין של חלבונים אנדוגניים וביטוי יתר בתנאים עדינים עם המטרה הסופית לשמר את תפקוד חלבון, יחסי גומלין, ולאחר translational שינויים. תקשורת צמיחה, מאגר תמוגה תאקומפוזיציות והגדרות טחנת חרוז מותאמות לשמור על אינטראקציות חלבון ולאחר translational שינויים כגון sumoylation וubiquitylation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

Homogenization ממכות חרוז הוא דרך מהירה ויעילה כדי לשחרר דנ&quot;א, רנ&quot;א, חלבונים ומטבוליטים מתאי שמרי ניצנים, שהם קשים לשמצה לשבש. כאן אנו מתארים את השימוש בטחנה homogenizer חרוז להפקת חלבונים לתוך המאגרים מותאמים לשמור את הפונקציות, אינטראקציות ולאחר translational שינויים של חלבונים. תאים גדלים וגריתמית המבטאים את החלבון של עניין הם גדלו בתקשורת צמיחה נוזלית של בחירה. את תקשורת הצמיחה עלולה להיות בתוספת חומרים כימיים כדי לגרום ביטוי חלבון מיזמים מושרים (למשל גלקטוז), לסנכרן את שלב מחזור תא (לדוגמא nocodazole), או לעכב פונקצית proteasome (למשל MG132). תאים אז pelleted וresuspended בחיץ מתאים המכיל פרוטאז ו / או מעכבי phosphatase ומעובדים או מייד או קפוא בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר. Homogenization מושגת על ידי שישה מחזורים של 20 שניות ביהD-מכות (5.5 מ &#39;/ שנייה), כל אחד ואחריו דגירה דקה אחת על קרח. Homogenate כתוצאה מכך אינו מסומן על ידי צנטריפוגה וניתן להסיר חלקיקים קטנים על ידי סינון. כל תמצית התא פינה כתוצאה מכך (WCE) הוא זירז באמצעות 20% TCA לניתוח ישיר של חלבונים הכולל ב-SDS אחריו מערבי סופג. תמציות מתאימות גם לטיהור זיקה של חלבונים מסוימים, זיהוי של לאחר translational שינויים, או הניתוח של חלבוני שיתוף לטיהור. כמו במקרה של רוב פרוטוקולי טיהור חלבונים, אנזימים וחלבונים מסוימים עשויים לדרוש תנאים ייחודיים או בהרכבי חיץ לטיהורם ואחרים עשויים להיות לא יציבים או לא מסיס בתנאים האמורים. במקרה האחרון, שהוצג הפרוטוקול עשוי לספק נקודת התחלה שימושית אמפירי כדי לקבוע את אסטרטגית חרוז המכות הטובה ביותר למיצוי חלבון וטיהור. אנחנו מראים את השאיבה וטיהור של epitope מתויג SUMO E3 האנזים, Siz1, מחזור תאמוסדר חלבון שהופך גם sumoylated וphosphorylated, כמו גם למקטע האנזים היוביקוויטין SUMO ממוקד, Slx5.

תוצאות הנציג שלנו מגלות כי פרוטוקול חילוץ חרוז מכות וחלבון תאר שימושי להכנה לשחזור של חלבונים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם (בטבלה 2). -SDS אחריו מכתים Coomassie של WCEs מראה כי מגוון רחב של חלבונים (~ 12 ל&gt; 250 KDA) ניתן לחלץ reproducibly מתאי שמרים (איור 1 א). להק?...

Watch this Scientific Journal Video about Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications at JoVE.com

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

הכנת תמציות תא שמרים איכותיות היא צעד ראשון הכרחי בניתוח של חלבונים בודדים או proteomes שלם. כאן אנו מתארים פרוטוקול homogenization מהיר, יעיל, ואמין לתאי שמרי ניצנים שעבר אופטימיזציה כדי לשמר פונקציות חלבון, אינטראקציות, ולאחר translational שינויים.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

גילוי אינטראקציות חלבון ואפיון תפקוד חלבון באמצעות HaloTag טכנולוגיה

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...