Name: budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications
Uploaded: 2013-10-30T22:35:00
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우리는 그들의 지원을 위해 Kerscher 연구실의 모든 구성원을 감사드립니다. 저희는 효모 균주 MHY3765에 대한 마크 Hochstrasser 감사합니다. 이 작품은 NSF 교부금 1,051,970 (OK)로와 하워드 휴즈 의학 연구소 학부 여행 그랜트 먼로 학자 프로그램 그랜트 (ES를)에 의해 지원되었다.

기본 조건에서 발아 효모 세포에서 발현 6xHIS - 태그 단백질의 정제 1. 단백질 발현의 효모 세포와 유도의 성장 (2에서 수정) 선택 사항 : 관심 대신 아래에 설명 된 갈락토스에 의한 문화의 단백질을 표현 대수 성장 효모 배양을 사용합니다. <ol><li> 플라스미드 인코딩 갈락토오스 유도 선택의 단백질 6xHIS - 태그와 함께 걸 + 효모 균주?...

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein.">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to protein purification. , (1990).</li><li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+Method:+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid.">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).</li><li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

이 프로토콜은 그대로, 네이티브의 준비에 초점을 맞추고, 사후 translationally 다운 스트림 응용 프로그램의 신진 효모 세포에서 단백질을 수정했습니다. 이 프로토콜을 시도하기 전에, 그것은 관심의 단백질이 쉽게 상태에게 12 변성에서 준비 단백질 추출물에서 발견 할 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 클론 항체를 사용할 수없는 경우는 융합 단백질은 서양 말에서 감지 할 수 있도록...

효모 유전학의 최고 힘은 전설이지만, 신진 효모 인 Saccharomyces cerevisiae의,에서 네이티브 단백질의 준비 및 분석은 종종 문제가 고민입니다. 후자는 상당한 기계적 강도와 효모 세포벽 1의 탄력성 때문이다. 다른 방법은 효소, 화학, 기계, 압력 기반의 전체 세포 단백질 추출물 2-6를 얻기 위해 효모 세포의 파괴에 대해 설명하고있다. 이 기술은 이후의 분석이나 정제 단계에 사용할 수있는 휴대 대표 네이티브 단백질 추출물을 산출하기 위해 효능 널리 다릅니다. 예를 들어, 효모 세포벽은 세포 용해 효소 (예 : zymolyase) 및 결과 spheroblasts으로 제거 할 수는 전단, 세제, 또는 단백질을 해제 삼투 용해에 의해 중단 될 수 있습니다. 이 방법은 성공적으로 많은 세포 내 fractionations의 시작 지점으로 고용하지만 긴에서 incubate을 필요로하고있다일부 단백질 7의 안정성과 호환되지 않습니다. 효모 세포의 단백질의 화학적 추출을위한 독자적인 효모 용해 시약 (예 : 세제)를 상업적으로 사용할 수 있지만이 단백질 추출 시약 및 단백질의 후속 생화학 적 특성에 미치는 영향의 효과는 항상 8 명확하지 않습니다. 자주 프랑스어 프레스로 불리는 고압 균질는 효과적으로 최초의 고압에게 복종하고 압력 셀에있는 작은 구멍을 통해 그들을 압출하여 효모 세포를 휴식. 이 기술은 높은 품질의 추출물을 생산하지만, 장비는 매우 고가이며, 세포 또는 여러 샘플 9 소량 적합하지 않을 수 있습니다. 따라서, 비드 밀 효모 세포의 기계적 장애는 종종 기본 효모 단백질 제제 10에 대한 선택의 방법입니다. 이 기술은 산 워싱턴 주와 효모 세포 벽의 기계적 장애를 포함셰이커, vortexers 또는 비드 공장의 다양한 수행 할 수 유리 구슬을 흘렸다. 특히이 방법은 동시에 여러 작은 샘플 (세포 이하 1 ㎖)을 처리하는 데 사용할 수 있습니다. 많은 다른 구슬 또는 구슬 밀 중단 매트릭스는 이제 2 ㎖ 튜브에 세포 유형의 거의 모든 종류를 방해하는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 다른 기술과 장비를 고려, 비드 밀 단백 분해 효소 및 / 또는 프로 테아 억제제의 적절한 버퍼를 활용하고, 특히 효모 세포의 파괴와 같은 sumoylation로 번역 후 수정 사항을 보존하는 데 도움이 매우 빠르게 발생하는 추가 이점이 있습니다 및 추출물의 온도 제어됩니다. 이 프로토콜은 단백질 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하는 궁극적 인 목표와 부드러운 상태에서 내생 이상 발현 단백질의 빠르고 효과적이며 신뢰할 수있는 추출에 초점을 맞추고 있습니다. 성장 매체, 세포 용해 버퍼조성 및 비드 밀 설정은 단백질 상호 작용과 같은 sumoylation와 ubiquitylation로 번역 후 수정 사항을 유지하기 위해 최적화되어 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

구슬을 쳐서 균질화 방해 악명 어려운 신진 효모 세포에서 DNA, RNA, 단백질 및 대사 산물을 해제하는 빠르고 효율적인 방법입니다. 여기에서 우리는 기능, 상호 작용과 단백질의 번역 후 수정 사항을 유지하기 위해 최적화 된 버퍼로 단백질의 추출을위한 비드 밀 균질의 사용을 설명합니다. 관심의 단백질을 발현 대수 성장 세포 선택 액상 성장 미디어에서 재배된다. 성장 매체를 유도 프로모터 (예 : 갈락토스)에서 단백질 발현을 유도하는 약으로 보충 할 수 있습니다 (예 : nocodazole) 세포주기 단계를 동기화하거나 (예 : MG132) 프로 테아 기능을 억제. 세포는 침전 및 분해 효소 및 / 또는 인산 가수 분해 효소 억제제를 포함하는 적절한 버퍼에 재현 탁하고도 즉시 처리 또는 나중에 사용하기 위해 액체 질소에 냉동. 균질화은 20 초 BEA의 여섯 사이클에 의해 수행됩니다D-구타 (5.5 m / 초), 얼음의 한 분 배양 한 다음 각. 결과 균질는 원심 분리에 의해 제거되고 작은 입자는 여과에 의해 제거 할 수 있습니다. 결과 삭제 전체 세포 추출물 (WCE)은 웨스턴 블롯 다음 SDS-PAGE로 전체 단백질의 직접적인 분석을 위해 TCA 20 %를 사용하여 침전된다. 추출물은 특정 단백질의 친화력 정화, 번역 후 수정 또는 공동 정화 단백질의 분석의 검출에 적합하다. 대부분의 단백질 정화 프로토콜의 경우와 같은 일부 효소와 단백질은 정제 및 다른 사람을위한 유일한 조건이나 버퍼 조성물에 명시된 조건을 불안정하거나 용해 할 수 필요할 수 있습니다. 후자의 경우, 제시된 프로토콜은 경험적으로 단백질 추출 및 정제를위한 가장 비드를 제패 전략을 결정하는 데 유용한 출발점을 제공 할 수 있습니다. 우리는 에피토프 태그가 SUMO E3 리가, Siz1, 세포주기의 추출 및 정제를 보여Slx5, sumoylated 및 인산화뿐만 아니라, SUMO-대상 유비퀴틴 리가 소단위 모두되어 단백질을 규제.

우리의 대표적인 결과를 설명 비드 구타와 단백질 추출 프로토콜 스트림 응용 프로그램 (표 2에 요약)의 다양한 단백질의 재현성 준비에 유용 밝히지. WCEs의 쿠마시 염색 이어 SDS-PAGE 단백질 (~ 12&gt; 250 kDa의)의 넓은 범위 재현성 효모 세포 (그림 1A)에서 추출 할 수 있음을 보여줍니다. 분자량의 범위 이산 밴드는 양질의 단백질 추출물의 지표입니다. 추출물의 품질은 서양 ?...

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Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

높은 품질의 효모 세포 추출물의 준비를 개별 단백질 또는 전체 프로테옴의 분석에 필요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서 우리는 단백질의 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하기 위해 최적화 된 신진 효모 세포에 대한 빠르고, 효율적이며 신뢰성있는 균질화 프로토콜을 설명합니다.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

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