Name: stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier
Uploaded: 2013-10-26T23:00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tysk Research Foundation) under tilskud nummer FO 315/4- og Den Europæiske Union syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale nr. HEALTH-F2-2009 til 241.778 til CF.

1.. Podning af endotelceller i brønde <ol><li> Dyrk murine hjerne mikrovaskulære endotelceller (cEND) i T75 dyrkningskolbe, ændre medium (DMEM indeholdende 10% FCS, 50 U / ml penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin) to gange om ugen, indtil sammenløb er nået. (For generering og immortaliseringen af hjernens mikrovaskulære endotelceller, se venligst Burek et al, 2012;. Förster et al, 2005 21,19.). </li><li> Vask cellerne med phosphatpufret saltvand (PBS). Fjern PBS og Trypsinisér cellerne med 2 ml varm trypsin-EDTA-opløsning. </li><li> Inkuber cellerne ved 37 ° C i 5 minutter, eller indtil cellelaget er dispergeret. </li><li> Tilsæt 8 ml dyrkningsmedium i cellerne. Tryk kolben flere gange for at løsne cellerne. </li><li> Se celler under mikroskop for at sikre fuldstændig adskillelse fra kolben. </li><li> Pipette medium med fritliggende celler op og ned. Swirl kolben at blande cellen suspensipå. </li><li> Tag 20 pi af cellesuspensionen sættes i et hæmocytometer og tælle antallet af celler. </li><li> Bestemme celletætheden og frø 20.000 celler / cm 2 i brønden. </li><li> Overfør cellesuspensionen i collagen1 forbestryges 6 brønde fleksibel bund dyrkningsplader (57,75 cm2) i et samlet volumen på 3 ml / brønd. Hver brønd har et areal på 9,62 cm2. </li><li> Dyrke cellerne ved 37 ° C i en uge, indtil sammenflydende. Ændre dyrkningsmediet to gange om ugen. </li></ol> 2.. Celledifferentiering Før Stretch-induceret skade <ol><li> Ændre dyrkningsmediet af cellerne med differentiering medium (DMEM indeholdende 1% serum-strippet føtalt kalveserum (ssFCS), 50 U / ml penicillin / streptomycin). </li><li> Inkuber cellerne ved 37 ° C i 24 timer. </li></ol> 3.. Stretch-induceret skade af endotelceller <ol><li> Tænd celleskade controller enhed. </li><li> Indstille forsinkelsen til 50 msek. </li><li> Indstil regulator tryk til 15 psi, og tryk på aftrækkeren et par gange, indtil den registrerede peak trykket bliver stabilt. </li><li> Indstil regulatoren trykket til den ønskede værdi. Brug tabel 1 som en guide til at generere forskellige grader af stretch skade. </li><li> Placer 6-brønds fleksibel bund kultur plade (57,75 cm 2) i bakken holderen. Sørg for, at de godt er indstillet til den korrekte godt størrelse (dvs. stort godt). </li><li> Placer adapterstik fast over brønden. Hold i stikket på plads med den ene hånd, mens den anden side skubber aftrækkeren. </li><li> Optag peak genererede tryk. </li><li> Straks sætte pladen tilbage i 37 ° C inkubator for den ønskede længde af tid eller bruge med det samme for succes forsøg eller evaluering. </li></ol> 4.. Vurdering af Stretch skade ved farvestofoptagelse Assay <ol><li> Umiddelbart efter at cellerne var strætset (trin 3.7), tilsættes 30 pi af en 1 mg / ml opløsning af levedygtigheden plet, der fungerer som en cytotoksicitet markør (se supplerende tabel af materialer og udstyr) til cellekulturmediet (Bemærk: 10 ul af farveopløsning skal anvendes for hver ml cellekulturmedium). </li><li> Ved tilsætning af farvestof til cellerne, vist umiddelbart under et fluorescensmikroskop. </li></ol> 5.. Vurdering af Stretch skade ved Lactatdehydrogenase (LDH) Udgivelsesdato <ol><li> Umiddelbart efter strækning cellerne (trin 3.7), fjernes 200 pi cellekulturmedium fra brønden. Gør det samme for hver gang point efter skaden, du gerne vil inkludere i din undersøgelse af LDH frigivelse (dvs. fx 30 min, 1 time, 2 timer osv.) </li><li> Centrifugeres cellekulturmediet ved den højeste indstilling af en mikrocentrifuge i 5 minutter for at fjerne eventuelle cellerester. Fjern supernatanten og bruge denne til de efterfølgende trin. </li><li> Når du have færdig trin 5.1 og har taget de nødvendige prøver, du gerne vil have fra de forskellige tidspunkter, du gerne vil undersøge, lysere cellerne ved hjælp af lyseopløsningen inkluderet i LDH assaykit (se supplerende tabel af materialer og udstyr). </li><li> Put 100 ul af testsubstratet inkluderet i assayet Kitto hver brønd af en 96-brønde plade tilvejebragt i kittet. </li><li> Put 100 ul af celle-fri celledyrkningsmedium i to parallelle brønde i en 96-brønde plade indeholdt i assaykittet. </li><li> Inkubér pladen ved 37 ° C i 30 min. </li><li> Læs absorbansen ved 492 nm. </li></ol>

<ol>
	<li>Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+traumatic+brain+injuries:+a+global+perspective.">The impact of traumatic brain injuries: a global perspective.</a> NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).</li><li>Morrison, B., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+centralnervoussystemmodels+of+mechanicallyinducedtrauma:+a+review.">In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).</li><li>Albert-Weissenberger, C., Sir&#233;n, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+traumatic+brain+injury.">Experimental traumatic brain injury.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).</li><li>Morrison, B., Elkin, B., Doll&#233;, J. P., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+traumatic+brain+injury.">In vitro models of traumatic brain injury.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).</li><li>Cargill, R. S., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+alterations+in+[Ca2+]i+in+NG108-15+cells+subjected+to+high+strain+rate+deformation+and+chemical+hypoxia:+an+in+vitro+model+for+neural+trauma.">Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma.</a> J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).</li><li>Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+neuronal+stretch+injury+in+vitro+differ+with+the+model+of+trauma.">Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma.</a> J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).</li><li>Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+for+rapid+stretch-induced+injury+of+cells+in+culture:+characterization+of+the+model+using+astrocytes.">A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes.</a> J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).</li><li>McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+of+cultured+neuronal,+glial+and+endothelia+cells+(Effect+of+polyethylene+glycol-conjugated+superoxide+dismutase.">Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase.</a> Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).</li><li>Wanner, I. B., Deik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+of+the+glialscarinhibitsaxongrowth.">A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth.</a> Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).</li><li>Wanner, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vitro+Trauma+Model+to+Study+Rodent+and+Human+Astrocyte+Reactivity.">An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity.</a> Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).</li><li>Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+TRPP2+and+TRPC1+channels+in+stretch-induced+injury+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells.</a> Brain Res. 1436, 1-12 (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+brain+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+voltage-dependent+Mg2++blockade+of+NMDA+current+in+mechanically+injured+neurons.">Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons.</a> Science. 274, 1921-1923 (1996).</li><li>Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+glutathione+protects+cerebral+endothelial+cells+from+traumatic+brain+injury.">Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).</li><li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier.">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li><li>Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line,+b.End3,+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies.">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).</li><li>Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icreased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behaviour+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435-445 (1990).</li><li>RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normal+and+tumorigenic+endothelial+cells:+differences+in+thrombospondin+production+and+responses+to+transforming+growth+factor-beta.">Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta.</a> J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).</li><li>F&#246;rster, C., Silwedel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).</li><li>Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culturemodel+of+the+blood-brain+barrier.">A cell culturemodel of the blood-brain barrier.</a> J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).</li><li>Burek, N. M., Salvador, E., F&#246;rster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immortalized+murine+brain+microvascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+blood+brain+barrier+model.">Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model.</a> J. Vis. Exp. (66), (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury.">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li><li>Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proteasomal+glucocorticoid+receptor+degradation+restores+dexamethasone-mediated+stabilization+of+the+blood-brain+barrier+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury.</a> Crit. Care Med. , (2013).</li><li>Werner, C., Engelhard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+traumatic+brain+injury.">Pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).</li><li>Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+after+fluid+percussion+brain+injury+in+the+rat:+Part+2:+Effect+of+hypoxia+on+permeability+to+plasma+proteins.">Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins.</a> J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Virkningerne af mekanisk skade in vitro er blevet undersøgt og metoder er blevet fastsat for astrocytter, neuroner, gliaceller og aortaendotelceller 8, 9, 22. Der er imidlertid til dato stadig ingen kendt in vitro-model af stræk skade i dyrkede hjerne endotelceller. Cellulære modeller af traumer giver værdifulde fordele i forhold dyremodeller siden mekaniske miljø af cellerne kan styres præcist 6. Derfor, en in vitro model for traumer gennem stretch skade anvendelse af dyrkede endotelceller hjerneceller, der fungerer som model af blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​såsom hvad vores protokol gaver kan vise sig at være nyttig. Denne protokol gør brug af cEND celler, en etableret BBB model i vores laboratorium. Siden BBB-nedbrydning ofte er dokumenteret i TBI patienter og TBI er ofte knyttet til afbrydelse af BBB, som kan føre til ødemdannelse 23, 24, metoden presterede her, kan specifikt anvendes i gennemførelsen BBB studier i forhold til TBI. I denne model er det vigtigt at tage sig af, hvor meget grad af stræk skade påføres cellerne. For så vidt som cellerne bliver skadet under alle omstændigheder, og med hvad mængden af ​​tryk påføres, adskiller den grad af skade, der kan påvirke endothelceller meget stærkt fra andre celletyper. Aortaendotelceller er mere modstandsdygtige over strække skade end astrocytter eller blandede gliaceller 9. Desuden reparere de mere hurtigt efter skade sammenlignet med de andre celletyper. Derfor er for hjernens endotelceller, navnlig cEND celler, større mængde af stræk skade nødvendig for at producere en høj grad af skade. Man kunne opnå den ønskede grad af skade ved at anvende den tilsvarende tryk angivet i tabel 1.. For cEND celler, der imidlertid alvorlig skade foretrækkes på grund af deres modstand mod stamme. LDH gennemførte assays visteat som graden af ​​stræk stiger, mere LDH udskilles i supernatanten. I modsætning hertil producerede de celler, der fik en lav mængde af stræk skade LDH i en mængde svarende til kontrolceller. Som nævnt i protokollen, skal man passe på, at den passende mængde medium anvendes, da en stigning eller et fald i mængden af ​​mediet kan føre til forskelle i peak tryk, til brøndene. For eksempel registrerer en brønd indeholdende 5 ml væske et trykstød i gennemsnit på 4,0 psi, mens en tom brønd registrerer et gennemsnit på 3,8 psi når 45 psi påføres. Derfor er det bedst at skubbe udløser flere gange over en kontrol samt at sikre, at den maksimale tryk, som vil blive frembragt, svarer til den ønskede mængde. I vores eksperimenter har vi brugt en levedygtighed plet for at bestemme virkningen af ​​stræk til permeabiliteten af ​​cellemembranen. Optikken i fleksible bund dyrkningsplader brugte vi gør os at b.ew de farvede celler direkte under lup. Men når man ønsker at gennemføre immunolabelling studier direkte efter stræk-skade, kan der opstår vanskeligheder. Først, kan størrelsen og tykkelsen af ​​pladen udgør et problem med nogle mikroskop udsigtsplatforme. For det andet, kan optikken i fleksible membran af brønden være en hindring for at rydde visning. Trods de ovennævnte begrænsninger, dog kan den beskrevne fremgangsmåde anvendes som en model for in vitro mekanisk skade af BBB. Traumatisk hjerneskade (TBI) omfatter to komponenter, nemlig iskæmi og traumer. Iskæmi kan forekomme som en sekundær skade efter TBI i tilfælde, hvor der er alvorlig blodtab resulterer i lavt blodtryk eller som et resultat af hjerne hævelse begrænse iltforsyning til hjernen. Det betragtes som en forsinket, nonmechanical skader repræsenterer træk patologiske processer igangsat på tidspunktet for skaden 25.. Forekomsten af ​​iltsvind after svær traumatisk hjerneskade er almindeligt 26. Oxygen glucosemangel (OGD) er den metode i øjeblikket anvendes til model iskæmi in vitro. Således kan udsætte celler til OGD som en sekundær fornærmelse til cellerne efter strækning efterligne forekomsten af ​​TBI efterfulgt af iskæmi. Derfor, for at forbedre vores nuværende in vitro model for TBI og mønsteret er det så tæt som muligt til en faktisk TBI som det forekommer in vivo, at vi i fremtiden også vil beskæftige OGD i kombination med stretch skade.

Traumatisk hjerneskade (TBI) er en af ​​de førende dødsårsager på verdensplan. Omkring 10 millioner mennesker er ramt årligt af TBI gør det til en stor sundheds-og medicinsk problem 1.. På grund af dette, har forskellige in vivo og in vitro modeller af TBI blevet etableret og udviklet til at studere dens mekanismer 2,3,4. En bedre forståelse af TBI kan hjælpe med at forbedre patientbehandlingen og mindske den dermed forbundne dødelighed, sygelighed og omkostninger. Mange modeller for hjerneskade som udnytter både in vivo og in vitro metoder eksisterer. In vivo modeller kunne efterligne den faktiske tilfælde af hovedlæsion. Men på grund af kompleksiteten af in vivo-situationen, adgang til vævet af interesse bliver begrænset 2. For at forstå den fysiologiske reaktion af individuelle celler som følge af den påførte skade, er det vigtigt, at cellerne er isoleret fra de systemiske virkninger, somkan hæmme eller ændre deres individuelle respons 5.. Af denne grund giver cellulære modeller af traumer værdifulde fordele i forhold dyremodeller siden mekaniske miljø af cellerne kan styres præcist 6. In vitro-systemer, som anvender brugen af mekanisk belastning til celler eller væv for at bestemme ændringer induceret ved en sådan fremgangsmåde skade er blevet udviklet. For eksempel har en metode til at studere virkningen af mekanisk skade på celler blevet etableret for astrocytter, neuroner, gliaceller og aorta endotelceller 7,8,9. In vitro traume model etableret for studiet af gnaver og menneskelige astrocyt reaktivitet 10 ansat en trykreguleringsanordning identisk med, hvad vi bruger til vores model. Samme metode blev anvendt til at fremkalde skade gennem stræk i mus hjerne mikrokar endothelceller (bEnd3) 11 og kortikale neuroner 12,13 samt, cerebral endothelial celler fra nyfødte grise 14.. Enheden deformerer bunden af kulturen godt derved frembringer mekanisk stretch skade 10.. Det påfører skade ved dyrkede celler ved anvendelse af lufttryk over cellerne. Dette pres kan afbøje membranen, hvorpå cellerne vokser og derved strække cellerne. Forskellige grader af stretch (dvs. &quot;lav,&quot; moderat &quot;eller&quot; alvorlig &quot;) kan opnås ved at indstille lufttrykket puls varighed og intensitet i overensstemmelse hermed. Denne metode til stretch-induceret skade er blevet korreleret med traumatisk skade in vivo 7.. Desuden denne form for skade giver mulighed for præcis styring af den ekstracellulære miljø og kan let reproduceres. Selv om en lignende fremgangsmåde er blevet anvendt til mange andre hjerne celletyper, herunder bEnd3, vores model er en fordel i, at det gør brug af de murine hjerne mikrovaskulære endotelceller (cEND) generereti vores laboratorium. Denne cellelinie er en velegnet model af blod-hjerne barrieren (BBB). In vitro cellekulturer anvendes som BBB-modeller bør besidde egenskaber, der gør dem i stand til at tjene som permeabilitet skærm. Et vigtigt kriterium for en in vitro-celle model kan være en indikator for BBB permeabilitet er at det skal besidde fysiologisk realistisk celle arkitektur 15.. Selvom bEnd3 celler vise karakteristiske spindel-lignende skvamøs morfologi i kultur 16 udviser de uregelmæssige morfogenetiske adfærd in vitro, hvorved de danner cyste-lignende hulrum snarere end de regelmæssige rørformede strukturer i fibrin geler 17.. Desuden, når cellerne blev injiceret i embryoner og nyfødte mus, de inducerede hurtigt voksende tumorer dødelige til embryonale mus, men ikke hos nyfødte og unge mus. Det er således foreslået, at en eller flere processer, der styrer den normale endotel vækst, migration og differentiering er blevet ændret eller elied i denne cellelinie 18. På den anden side, viser morfologiske, immuncytokemiske evaluering af endotel-og BBB markør udtryk, bioelektrisk og paracellulær flux målinger, at vores BBB model cEND er faktisk en egnet model af BBB 19.. Brain endotel in vivo er kendetegnet ved en yderst stram permeabilitet med trans-endotel elektrisk modstand (TEER) rækkende fra 2000-5000 Qcm 2. Til undersøgelser af hjernen mikrovaskulaturen barriereegenskaber til lægemidler, bør paracellulær restrictiveness og tæthed af cellerne overvejes. I de fleste hjernen kapillærendotelceller (BCEC), er dette ikke bevaret som cellerne udviser TEER spænder fra 50 til 100 Wcm 2 20. Den udødeliggjort hjerne endotelceller linje bEnd3 genererer TEER værdier ikke er større end 60 Wcm 2 15. I modsætning differentiering af cEND celler med medium indeholdende reducerede serum displayTEER værdier i området 300-500 Wcm 2 19,21. Til dato er in vitro-modeller af stretch skade i dyrkede hjerne endotelceller knappe. Derfor kan en in vitro model for traumer gennem stretch skade anvendelse af dyrkede hjerne endotelceller, der fungerer som model for BBB vise sig at være nyttig. I denne protokol, præsenterer vi en in vitro model, der kunne efterligne den faktiske virkning, at hjerneceller, specielt hjernen mikrovaskulære endotelceller fra BBB, modtaget i løbet af TBI. Den vigtigste fordel ved denne model er, at omfanget af den skade påføres celler samt det ekstracellulære miljø kan let kontrolleres på en præcis måde giver nem reproducerbarhed forsøgsopstilling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cell Injury Controller II</td>
			<td style="width:351px;">Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:431px;"></td>
			<td style="width:435px;">http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Remarks</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td>
			<td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td>
			<td>BF - 3001C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5796</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">A15110-1333</td>
			<td style="width:431px;">final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &#176;C)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0282</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MEM Vitamin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0373</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Na-pyruvate</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">L0473</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Nonessential amino acids (NEA)</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0293</td>
			<td style="width:431px;">Storage at 4 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">A2212</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>12676-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td>L11-004</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image-iT DEAD Green</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>I10291</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C, protected from light</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4744926001</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

Grund af den høje dødelighed hændelse som følge af traumatisk hjerneskade (TBI), metoder, der vil gøre det muligt at bedre at forstå de underliggende mekanismer involveret i det er nyttige til behandling. Der er både in vivo og in vitro metoder til rådighed til dette formål. In vivo modeller kan efterligne selve hovedet skade, da det sker under TBI. Dog kan in vivo teknikker ikke udnyttes for studier på cellens fysiologi-niveau. Derfor, in vitro-metoder er mere fordelagtige til dette formål, da de giver lettere adgang til cellerne og det ekstracellulære miljø for manipulation. Vores protokol viser en in vitro model af TBI hjælp stræk skade i hjernen mikrovaskulære endotelceller. Det udnytter tryk påføres celler dyrket i fleksible-bund. Trykket påføres let kan styres og kan producere skade, der spænder fra lav til svær. Det murinehjerne mikrovaskulære endotelceller (cEND) genereret i vores laboratorium er en velegnet model for blod-hjerne barrieren (BBB), hvilket giver en fordel til andre systemer, der anvender en lignende teknik. Desuden, på grund af enkelheden af ​​fremgangsmåden er eksperimentelle opsætninger let duplikeres. Således kan denne model anvendes til at studere cellulære og molekylære mekanismer involveret i TBI på BBB.

Celler dyrket på kollagen I forbestryges 6-brønds fleksible bund dyrkningsplader (57,75 cm2) blev udsat for forskellige grader af strækning skade ved hjælp af cellen båre enhed. Efter at underkaste cellerne til skade, blev de undersøgt under mikroskop for effekten af ​​stræk-induceret skade på celle morfologi. Det blev observeret, at som større grad af strækning blev påført til cellerne en større grad af celle forvrængning kunne også observeret (figur 1). Som vist i figur 1A, kontrol celler, som ikke er udsat for skade fremstå som regelmæssigt formede cerebrovaskulære endotelceller (cEND) uden angivelse af celle ekspandering eller forvrængning. Når stretch skade blev påført (fig. 1B-D), kan deformering iagttages under lysmikroskop. Efter strækning af cellerne alvorligt med en peak tryk mellem 3,5-4,5 psi, dukkede de cEND celler markant tilbagetrukket, hævede og deformeret med ikke<html> stand intercellulære rum. Desuden optagelse af levedygtighed pletten (100 nM slutkoncentration) steg som graden af stræk skade blev forøget (figur 2). Levedygtighed plet anvendes, er et farvestof impermeabel for raske celler, der bliver gennemtrængende når plasmamembranen integritet af celler er kompromitteret. Farvestoffet blev udelukket fra de fleste af de kontrol celler, og derfor var der kun et par af de cellerne farvet (figur 2A) sammenlignet med strakte celler (figur 2B-D). Flere celler fluoresced grøn med en øget grad af stræk skade. Som en biokemisk markør for personskade, frigivelse af laktat dehydrogenase (LDH) enzym blev også undersøgt i henhold til producentens anvisninger. Figur 3 viser, at en stigende celle stretch skade forårsaget stigende LDH frigivelse. 928/50928fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Figur 1. Lysmikroskopi undersøgelse af normale vs sårede celler. (A) normal strakte sammenflydende cellemonolag istightly pakket og langstrakt. Når celler blev strakt ved at anvende et højdepunkt trykpuls af 1,8-2,0 psi (dvs. lavt stræk) de optræder mindre kompakt, rum angivet ved pile (B). Når cellerne var moderat såret med en 2,5-3,0 spidstryk puls, nogle af dem viste hævede og deforme (C). Cellerne bliver tilbagetrukket med svær strækning af 3,5-4,5 psi, som angivet med pilen (D). 100X forstørrelse. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> Figur 2. Fluorescence mikroskopisk undersøgelse af normale vs tilskadekomne celler Celler behandlet med levedygtighed pletten 2hr efter skaden A: kontrol ustrakte celler BD: strakte celler (B - lav, C - moderat D - alvorlig).... 100X forstørrelse. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> Figur 3. Lactatdehydrogenase (LDH) enzymfrigivelse i supernatanten efter strækning skade. LDH frigivet i dyrkningsmediet blev målt ved forskellige tidsintervaller efter strækning induceret skade. LDH blev udtrykt som en procent af den samlede frigøres LDH (LDH i medier plus celler). Værdier er ± SEM. N for hver tidspunkt er 5, bortset fra 0 hr value udsat for alvorlig strækning, hvor n = 3. LDH frigivelse fra celler, der blev udsat for lav og moderat stræk ikke adskiller sig væsentligt fra den, strakte kontroller, og fra hinanden. Celler, som blev hårdt strakt udgivet en betydeligt større mængde LDH forhold til alle andre prøver med undtagelse af moderat strakt prøve efter 1 time. (P &lt;0,05, En faktor ANOVA, Holm-Sidak metoden). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a> . Tabel 1. Guide til generering forskellige grader af strækning skade. <table border="1"><tbody><tr><th> Regulator Pressure </th><th> Peak Pressure </th><th> Méngraden </th></tr><tr><td> 15 psi </td><td> 1,2-1,5 psi </td><td> &lt;Lav </td></tr><tr><td> 20-25 psi </td><td> 1,8-2,0 psi </td><td> Low </td></tr><tr><td> 30-35 psi </td><td> 2,5-3,0 psi </td><td> Moderat </td&gt; </tr><tr><td> 40-50 psi </td><td> 3,5-4,5 psi </td><td> Svær </td></tr><tr><td> 60 psi </td><td> 4,8-6,0 psi </td><td> &gt; Svær </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier at JoVE.com

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatisk hjerneskade modeller er under udvikling til at gengive in vivo hjerne deformation. Stretch-induceret skade har været ansat i astrocytter, neuroner, gliaceller, aorta og hjerne endotelceller. Men vores system anvender en blod-hjerne barrieren (BBB) ​​model, der besidder egenskaber, der udgør en legitim model af BBB til at etablere en in vitro TBI model.

Stræk i Brain mikrovaskulære endotelceller (cEND) som et<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisk Hjerneskade Model af blod-hjerne barrieren

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

MR-guided Forstyrrelse af blod-hjerne barrieren ved hjælp af Transcranial fokuseret ultralyd i en rottemodel

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Rottemodel af blod-hjerne barrieren Disruption at muliggøre målrettede neurovaskulær Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Etablering af en<em&gt; In Vitro</em&gt; Model of Rat blod-hjerne barrieren (BBB): Fokus på BBB Uigennemtrængelighed og receptor-medieret transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoksiske Stimulering af Brain Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Kontrolleret Cortical Impact Model for Traumatisk Hjerneskade

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

A Novel Model af Mild traumatisk hjerneskade for unge rotter

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ilt-Glucose afsavn og reoxygenering som en<em&gt; In vitro</em&gt; Iskæmireperfusion Skade Model for studere blod-hjerne barrieren dysfunktion

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

En vævsforskydningsbaseret kontusiv rygmarvsskadesmodel i mus

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

En musemodel af enkelt og gentagen mild traumatisk hjerneskade

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

I Vitro Assays at vurdere blod-hjerne barriere mesh-lignende fartøj dannelse og afbrydelse

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...