Name: stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier
Uploaded: 2013-10-26T23:00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier at JoVE.com

Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкое научно-исследовательское) в рамках гранта число FO 315/4- и Европейского Союза Седьмая рамочная программа (FP7/2007-2013) по гранту соглашения № ЗДОРОВЬЕ-F2-2009-241778 для CF.

1. Посев эндотелиальных клеток в луночные планшеты <ol><li> Культивируйте мышиный мозг эндотелиальные клетки микрососудов (CEND) в культуральной колбы Т75, изменяя среду (DMEM, содержащей 10% FCS, 50 Е / мл пенициллина / стрептомицина, 1% L-глутамина) два раза в неделю до слияния не будет достигнута. (Для генерации и увековечение мозга эндотелиальные клетки микрососудов см. Burek и др., 2012;. Ферстер и др., 2005 21,19.). </li><li> Промыть клетки забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS). Удалить PBS и Trypsinize клеток с 2 мл теплой трипсин-ЭДТА. </li><li> Клетки инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин или до тех пор слой клеток не диспергируется. </li><li> Добавить 8 мл культуральной среды в клетки. Нажмите на колбу несколько раз, чтобы отделить клетки. </li><li> Просмотр клеток под микроскопом, чтобы обеспечить полное отделение от колбы. </li><li> Внесите среде с отдельной клетки вверх и вниз. Вихревой колбу смешать клетки suspensiдалее. </li><li> Возьмем 20 мкл клеточной суспензии, положить в гемоцитомер и подсчета количества клеток. </li><li> Определение плотности клеток и семян 20000 клеток / см 2 в скважину. </li><li> Передача клеточной суспензии в collagen1 предварительно покрытый 6-луночные гибким дном культуральных планшетах (57,75 см 2) в общем объеме 3 мл / лунку. Каждая лунка имеет площадь 9,62 см 2. </li><li> Расти клетки при 37 ° С в течение одной недели до сплошности. Изменение в культуральную среду дважды в неделю. </li></ol> 2. Дифференцировки клеток До Stretch-индуцированной травмой <ol><li> Изменение культуральной среды клеток с дифференциацией среде (DMEM, содержащей 1% сыворотки упрощенной фетальной телячьей сыворотки (ssFCS), 50 Ед / мл пенициллина / стрептомицина). </li><li> Клетки инкубируют при 37 ° С в течение 24 час. </li></ol> 3. Стретч-индуцированной травмы эндотелиальных клеток <ol><li> Включите контроллер устройства повреждения клеток. </li><li> Установить задержку в 50 мс. </li><li> Установите регулятор давления до 15 фунтов на квадратный дюйм и нажать на спусковой крючок пару раз, пока зарегистрированный пиковое давление не станет стабильным. </li><li> Установить регулятор давления до желаемого значения. Используйте таблицу 1 в качестве руководства для создания различной степени растяжения травмы. </li><li> Поместите 6-и гибким дном культуры пластины (57,75 см 2) в лоток держатель. Убедитесь, что также установлен в положение правильного размера скважины (т.е. большие хорошо). </li><li> Положите вилку адаптера над колодцем. Держа вилку на место одной рукой, а с другой стороны толкает на курок. </li><li> Запишите пик давления, создаваемого. </li><li> Сразу поставил тарелку обратно в 37 ° C инкубаторе в течение желаемого промежутка времени или немедленно использовать для последующих экспериментов или оценки. </li></ol> 4. Оценка Stretch Травма красителем анализа поглощения <ol><li> Сразу после клетки ултравления (шаг 3,7), добавляют 30 мкл 1 мг / мл раствора жизнеспособность пятно, что действует в качестве маркера цитотоксичности (смотрите таблицу дополнительных материалов и оборудования) к клеточной культуральной среде (Примечание: 10 мкл раствора красителя должен быть использован для каждого мл клеточной культуральной среды). </li><li> При добавлении красителя в клетки, сразу смотреть под флуоресцентным микроскопом. </li></ol> 5. Оценка Stretch травмы лактатдегидрогеназы (ЛДГ) релиз <ol><li> Сразу после растяжения клеток (шаг 3.7), удалить от 200 мкл клеточной культуральной среды из скважины. Сделайте то же самое для каждого момента времени после травмы вы хотели бы включить в свое исследование ЛДГ версия (например, 30 мин, 1 час, 2 часа и т.д.). </li><li> Центрифуга клеточной культуральной среде на самом высоком настройки микроцентрифужные в течение 5 мин, чтобы удалить остатки клеток. Удалить супернатант и использовать его для последующих шагов. </li><li> После того как вы чAve закончил шаг 5.1 и приняли необходимые образцы, которые вы хотели бы иметь с различных точек раз, когда вы хотели бы исследовать, лизис клеток с использованием лизирующем растворе включены в ЛДГ набор для анализа (см. таблицу дополнительных материалов и оборудования). </li><li> Поместите 100 мкл среды для анализа включены в анализ Китто каждую лунку в 96-луночный планшет, входящую в комплект. </li><li> Поместите 100 мкл бесклеточной среде для культивирования клеток на две параллельные лунки 96-луночный планшет, включенных в набор для анализа. </li><li> Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 30 мин. </li><li> Считайте абсорбцию при 492 нм. </li></ol>

<ol>
	<li>Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+traumatic+brain+injuries:+a+global+perspective.">The impact of traumatic brain injuries: a global perspective.</a> NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).</li><li>Morrison, B., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+centralnervoussystemmodels+of+mechanicallyinducedtrauma:+a+review.">In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).</li><li>Albert-Weissenberger, C., Sir&#233;n, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+traumatic+brain+injury.">Experimental traumatic brain injury.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).</li><li>Morrison, B., Elkin, B., Doll&#233;, J. P., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+traumatic+brain+injury.">In vitro models of traumatic brain injury.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).</li><li>Cargill, R. S., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+alterations+in+[Ca2+]i+in+NG108-15+cells+subjected+to+high+strain+rate+deformation+and+chemical+hypoxia:+an+in+vitro+model+for+neural+trauma.">Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma.</a> J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).</li><li>Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+neuronal+stretch+injury+in+vitro+differ+with+the+model+of+trauma.">Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma.</a> J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).</li><li>Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+for+rapid+stretch-induced+injury+of+cells+in+culture:+characterization+of+the+model+using+astrocytes.">A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes.</a> J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).</li><li>McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+of+cultured+neuronal,+glial+and+endothelia+cells+(Effect+of+polyethylene+glycol-conjugated+superoxide+dismutase.">Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase.</a> Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).</li><li>Wanner, I. B., Deik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+of+the+glialscarinhibitsaxongrowth.">A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth.</a> Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).</li><li>Wanner, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vitro+Trauma+Model+to+Study+Rodent+and+Human+Astrocyte+Reactivity.">An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity.</a> Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).</li><li>Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+TRPP2+and+TRPC1+channels+in+stretch-induced+injury+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells.</a> Brain Res. 1436, 1-12 (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+brain+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+voltage-dependent+Mg2++blockade+of+NMDA+current+in+mechanically+injured+neurons.">Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons.</a> Science. 274, 1921-1923 (1996).</li><li>Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+glutathione+protects+cerebral+endothelial+cells+from+traumatic+brain+injury.">Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).</li><li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier.">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li><li>Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line,+b.End3,+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies.">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).</li><li>Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icreased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behaviour+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435-445 (1990).</li><li>RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normal+and+tumorigenic+endothelial+cells:+differences+in+thrombospondin+production+and+responses+to+transforming+growth+factor-beta.">Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta.</a> J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).</li><li>F&#246;rster, C., Silwedel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).</li><li>Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culturemodel+of+the+blood-brain+barrier.">A cell culturemodel of the blood-brain barrier.</a> J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).</li><li>Burek, N. M., Salvador, E., F&#246;rster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immortalized+murine+brain+microvascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+blood+brain+barrier+model.">Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model.</a> J. Vis. Exp. (66), (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury.">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li><li>Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proteasomal+glucocorticoid+receptor+degradation+restores+dexamethasone-mediated+stabilization+of+the+blood-brain+barrier+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury.</a> Crit. Care Med. , (2013).</li><li>Werner, C., Engelhard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+traumatic+brain+injury.">Pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).</li><li>Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+after+fluid+percussion+brain+injury+in+the+rat:+Part+2:+Effect+of+hypoxia+on+permeability+to+plasma+proteins.">Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins.</a> J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Эффекты механических повреждений в пробирке были изучены и методы были разработаны для астроциты, нейроны, глиальные клетки и клетки эндотелия аорты 8, 9, 22. Существует, однако, до настоящего времени еще не известно в пробирке модель стрейч травмы в культивируемых эндотелиальных клетках головного мозга. Моделей мобильных телефонов травмы ценную преимущества по сравнению с животных моделей с механической средой клетки можно точно контролировать 6. Следовательно, в пробирке модель для травмы через стрейч травмы с использованием культивируемых эндотелиальных клеток головного мозга, которые действуют как модель гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), такие как то, что наши подарки протокол может оказаться полезной. Этот протокол использует CEND клетки, установленные BBB модель в нашей лаборатории. С BBB пробоя часто документально у пациентов с ЧМТ и ЧМТ часто связано с нарушением BBB, которые могут привести к образованию отека 23, 24, метод Преподарил здесь может конкретно быть использованы при проведении исследований BBB по отношению к TBI. В этой модели, важно позаботиться о том, сколько степень растяжения травмы применяется к клеткам. В той мере, клетки повреждены в любом случае, и с тем, что количество давления применяется, степень вреда, который может повлиять на эндотелиальные клетки значительно отличаются от других типов клеток. Эндотелиальные клетки аорты более устойчивы к растягиваться травмы, чем астроциты или смешанных глиальные клетки 9. Кроме того, они более быстро восстанавливать после травмы, по сравнению с другими типами клеток. Таким образом, для эндотелиальных клеток головного мозга, особенно CEND клетки, большее количество участке травмы необходимо производить высокую степень травмы. Можно достичь желаемой степени повреждение путем применения соответствующего давления, указанного в таблице 1. Для CEND клетки, однако, серьезные травмы является предпочтительным из-за их устойчивость к деформации. ЛДГ анализы проводятся показалчто степень вытяжки увеличивается, более ЛДГ секретируется в супернатант. В противоположность этому, клетки, которые были даны низкое количество участке травмы производится ЛДГ в количестве, подобном с контрольными клетками. Как указано в протоколе, следует заботиться о том, что соответствующее количество среда используется с увеличением или уменьшением количества среды может привести к различиям в пиковое давление, прикладываемое к скважинам. Например, хорошо содержащую 5 мл жидкости регистрирует максимальное давление в среднем 4,0 фунтов на квадратный дюйм в то время как пустой и регистрирует в среднем 3,8 фунтов на квадратный дюйм при 45 фунтов на квадратный дюйм давления. Таким образом, лучше всего нажать курок несколько раз в течение контроля, чтобы гарантировать, что максимальное давление, которое будет сгенерировано соответствует требуемой суммы. В наших экспериментах мы использовали жизнеспособность пятно, чтобы определить влияние растяжения на проницаемость клеточной мембраны. Оптика гибким дном культуры мы использовали пластины позволяет VIEW окрашенных клеток непосредственно под микроскопом. Тем не менее, когда хочется провести immunolabelling исследования непосредственно после стретч-травмы могут возникнуть трудности. Во-первых, размер и толщина пластины может создать проблемы с некоторыми платформами микроскопом просмотра. Во-вторых, оптика гибкой мембраны из скважины может быть помехой для очистки просмотра. Несмотря на указанные недостатки, однако, описанная процедура может быть использована в качестве модели в пробирке механического повреждения BBB. Черепно-мозговая травма (ЧМТ) включает в себя два компонента, а именно, ишемия и травмы. Ишемия может происходить как вторичное повреждение после TBI в тех случаях, когда есть серьезные потери крови в результате низкого давления или в результате отека мозга ограничения подачи кислорода в мозг. Он рассматривается как задержки, повреждения немеханическим представляющих последовательных патологических процессов начинается в момент получения травмы 25. Возникновения гипоксииосле тяжелой черепно-мозговой травмы является общим 26. Кислород глюкозы депривации (ОГД) представляет собой метод в настоящее время используется в модели ишемии в пробирке. Таким образом, подвергая клетки OGD как вторичное оскорбление клеток после натяжкой можно имитировать заболеваемости TBI последующей ишемией. Таким образом, чтобы улучшить наши текущие в пробирке модель TBI и рисунок его как можно ближе к фактической TBI, как это происходит в естественных условиях, в будущем мы будем также использовать OGD в сочетании с стрейч травмы.

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) является одной из ведущих причин смерти во всем мире. Около 10 миллионов человек страдают ежегодно ЧМТ и в этом крупном здоровья и медицинская проблема 1. В связи с этим, различные в естественных условиях и в пробирке моделей TBI были созданы и разработаны для изучения ее механизмов 2,3,4. Лучшего понимания TBI может помочь улучшить амбулаторное лечение и уменьшение связанной с ними смертности, заболеваемости и стоимости. Многие модели для черепно-мозговой травмы, которые используют как в естественных условиях и в пробирке методы существуют. В естественных условиях модели могут имитировать реальное событие травмы головы. Однако из-за сложности в ситуации живом организме, доступ к интересующей ткани становится ограниченным 2. В понимании физиологической реакции отдельных клеток в результате травмы нанесенные важно, что клетки выделяют из системных эффектов, которыеможет подавлять или изменять их индивидуальной реакции 5. По этой причине, сотовые модели травмы ценную преимущества по сравнению с животных моделей с механической средой клетки можно точно контролировать 6. В пробирке систем, которые используют использования механической нагрузки на клетки или ткани для определения изменения индуцированного такой способ травмы были разработаны. Например, метод исследования влияния механических повреждений клетки была создана астроциты, нейроны, глиальные клетки и клетки эндотелия аорты 7,8,9. В пробирке травмы модель создана для изучения грызунов и человека астроцитов химическая активность 10 используется устройство регулирования давления идентичны тому, что мы используем для нашей модели. Тот же метод был применен, чтобы вызвать травмы в результате растяжения в мозг мыши эндотелиальные клетки микрососудов (bEnd3) 11 и 12,13 корковых нейронов, а также, церебральный endothelial клетки от новорожденных поросят 14. Устройство деформируется в нижней части лунки с культурой с получением таким образом механическое повреждение участка 10. Это наносит вред от культивируемых клеток путем применения давление воздуха выше клеток. Это давление может отвлечь мембрана, на которой выращивают клетки, тем самым растяжение клеток. Различные степени растяжения (например, &quot;низкая&quot; умеренное &quot;или&quot; тяжелым &quot;) может быть достигнуто путем установки воздушного импульса длительностью давление и интенсивность соответственно. Этот метод растяжения индуцированной травмы коррелирует с травматическим повреждением в естественных условиях 7. Кроме того , этот метод травмы позволяет точно контролировать внеклеточной среде и может быть легко воспроизведен. Хотя подобный подход был использован для многих других типов клеток мозга в том числе bEnd3, наша модель имеет то преимущество, что она использует мышиного мозга эндотелиальные клетки микрососудов (CEND), порожденнаяв нашей лаборатории. Эта клеточная линия является хорошо подходит модель через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Экстракорпоральное клеточных культурах использованы в качестве моделей BBB должен обладать характеристиками, которые позволили бы им служить проницаемость экрана. Один важный критерий в модельных клеточных пробирке является предиктором проницаемость ГЭБ, что она должна обладать физиологически реалистичной архитектуре клетки 15. Хотя bEnd3 клетки обнаруживать характерные веретеновидной плоскоклеточный морфологии в культуре 16, они обладают нерегулярным поведением морфогенетическую в пробирке которой они образуют цистоподобных полостей, а не регулярные трубчатых структур в фибрин гели 17. Более того, когда клетки вводили в эмбриональные и новорожденных мышей, индуцированного они быстро растущие опухоли, летальной для эмбриональных мышей, но не у новорожденных и молодых мышей. Таким образом, предлагается, что один или более процессов, определяющих нормальных эндотелиальных рост, миграцию и дифференциацию были изменены или устраняяЭд в этой клеточной линии 18. С другой стороны, морфологические, иммуноцитохимическое оценки эндотелиальных и BBB экспрессии маркера, биоэлектрических и парацеллюлярный измерения потока показывают, что наши BBB модель CEND действительно является подходящей модели BBB 19. Мозг эндотелия в естественных условиях характеризуется крайне сжатые проницаемости с транс-эндотелиальной электрического сопротивления (TEER) в диапазоне от 2000-5000 Ом · см 2. Для изучения свойств микрососудов мозга барьер для фармацевтики, парацеллюлярная ограничений и герметичность клетки должны быть рассмотрены. В большинстве эндотелия капилляров головного мозга клеток (BCEC), это не сохраняется в качестве экспоната TEER клетки в пределах от 50-100 Ом · см 2 20. Увековечен мозга эндотелиальной клеточной линии bEnd3 генерирует TEER значения не более 60 Ом · см 2 15. В отличие от дифференциации клеток с CEND среде, содержащей сыворотку уменьшена дисплейTEER значения в диапазоне от 300-500 Ом · см 2 19,21. На сегодняшний день в пробирке моделей натяжных травмы в культивируемых эндотелиальных клетках головного мозга не хватает. Следовательно, в пробирке модель для травмы через стрейч травмы с использованием культуры эндотелиальных клеток головного мозга, которые действуют как модель BBB может оказаться полезной. В этом протоколе, мы представляем в пробирке модель, которая может имитировать реальное воздействие, что клетки мозга, в частности мозга микрососудистых эндотелиальных клетках BBB, получать в течение ЧМТ. Основным преимуществом данной модели является то, что количество травм к клеткам, а также во внеклеточную среду можно легко управлять точным образом позволяя легко воспроизводимость экспериментальной установки.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cell Injury Controller II</td>
			<td style="width:351px;">Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:431px;"></td>
			<td style="width:435px;">http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Remarks</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td>
			<td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td>
			<td>BF - 3001C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5796</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">A15110-1333</td>
			<td style="width:431px;">final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &#176;C)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0282</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MEM Vitamin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0373</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Na-pyruvate</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">L0473</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Nonessential amino acids (NEA)</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0293</td>
			<td style="width:431px;">Storage at 4 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">A2212</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>12676-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td>L11-004</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image-iT DEAD Green</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>I10291</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C, protected from light</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4744926001</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

В связи с высокой смертностью инцидента вызванные черепно-мозговой травмы (ЧМТ), методы, которые позволяют лучше понять основные механизмы, участвующие в ней, применимы для лечения. Есть и в естественных условиях и в пробирке методы, доступные для этой цели. В естественных условиях модели могут имитировать фактической травмы головы, как это происходит во время TBI. Однако в естественных условиях методы не могут быть использованы для проведения исследований на уровне физиологии клетки. Таким образом, в пробирке методы более выгодным для этой цели, поскольку они обеспечивают более легкий доступ к клеткам и внеклеточную среду для манипулирования. Наш протокол представляет в пробирке модель TBI использованием стрейч травмы мозга в эндотелиальные клетки микрососудов. Он использует давление, прикладываемое к клетки, культивированные в гибкий дном скважины. Давление, может быть легко контролируется и может привести к травме, которая колеблется от низкого до тяжелой. Мышиныемозг эндотелиальные клетки микрососудов (CEND), полученных в нашей лаборатории является хорошо подходит модель через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), таким образом обеспечивая преимущество к другим системам, которые используют аналогичную технику. Кроме того, благодаря простоте метода, экспериментальные установки, легко дублировать. Таким образом, эта модель может быть использована при изучении клеточных и молекулярных механизмов, вовлеченных в TBI на BBB.

Клетки культивировали на коллаген I предварительно покрытый 6-луночных планшетах гибкий культуры (57,75 см 2) подвергали различной степенью растяжения травмы с помощью устройства клетки носилках. После воздействия на клетки раны, они были исследованы под микроскопом на последствия стретч-индуцированного повреждения клеточной морфологии. Было отмечено, что, как большая степень растяжения наносили на клетки в большей степени искажения клетка может быть также наблюдалось (Рис. 1). Как показано на рисунке 1А, контрольными клетками, которые не подвергаются травмам появляются как правильной формы цереброваскулярной эндотелиальные клетки (CEND) без указания набухание клетки или искажения. Когда стрейч травмы был применен (рис. 1В-D), деформации можно было наблюдать под световым микроскопом. После натягивания клетки строго с пиком давления между 3,5-4,5 PSI, CEND клетки появились заметно втянут, опухшие и деформированных с не<html> состоянии межклеточных пространствах. Кроме того, поглощение жизнеспособность пятна (конечной концентрации 100 нМ) также увеличилось как степень вытяжки травма была увеличена (рис. 2). Жизнеспособность пятно используется краситель impermeant здоровых клеток, которая становится проникающего когда целостность плазматическую мембрану клеток под угрозу. Краситель был исключен из наиболее контрольных клеток, следовательно, лишь немногие из клетки окрашивали (2А) по сравнению с растянутой клетки (фиг. 2B-D). Более зеленые флуоресцирующие клетки с повышенной степенью растяжения травмы. В качестве биохимического маркера травмы, секрецию лактатдегидрогеназы (ЛДГ) Фермент также рассматриваются в соответствии с инструкциями производителя. 3 видно, что увеличение повреждения клеток стрейч вызвало увеличение ЛДГ релизе. 928/50928fig1.jpg &quot;ширина =&quot; 500px &quot;/&gt; Рисунок 1. Свет микроскопия нормальных против поврежденных клеток. (A) Нормальный нерастянутое монослоя клетки istightly упакованы и удлиненная. Когда клетки были растянуты путем применения пик импульса давления 1,8-2,0 фунтов на квадратный дюйм (то есть малое растяжение), они являются менее компактным, пробелы показано стрелками (В). Когда клетки умеренно пострадавших в 2,5-3,0 импульса пиковое давление, некоторые из них появились опухшие и деформированы (C). Клетки становятся втянутом с тяжелой участок 3,5-4,5 фунтов на квадратный дюйм, как указано стрелкой (D). 100-кратном увеличении. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение</a> . <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> Рисунок 2. Фторценции микроскопическое исследование нормальных против поврежденных клеток Клетки, обработанные с жизнеспособностью пятно 2ч после травмы: контроль нерастянутое клетки BD: растянутые клетки (B - низкий, С - умеренный, D - тяжелые).... 100-кратном увеличении. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение</a> . <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> Рисунок 3. Лактатдегидрогеназы (ЛДГ) фермент высвобождение в надосадочной жидкости после растяжения травмы. ЛДГ в культуральной среды измеряют в различные интервалы времени после растяжения индуцированной травмы. ЛДГ выражали в виде процента от общего разъемного ЛДГ (ЛДГ в средствах массовой информации, а также клетки). Значения ± SEM. N за каждый раз выпадает 5, за исключением 0 ч VAlue подвергались жестоким участку, где N = 3. ЛДГ релиз из клеток, которые подвергались низкого и умеренного растяжения не отличались существенно от показателей нерастянутое управления и друг от друга. Клетки, которые были сильно растягивается выпущен значительно большего количества LDH по сравнению со всеми другими образцами, за исключением умеренно растянуты образца на 1 час. (Р &lt;0,05, ANOVA Одним из факторов, Холм-Сидаке метод). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение</a> . Таблица 1. Руководство для создания различной степени растяжения травмы. <table border="1"><tbody><tr><th> Регулятор давления </th><th> Пиковое давление </th><th> Степень повреждения </th></tr><tr><td> 15 фунтов на квадратный дюйм </td><td> 1,2-1,5 PSI </td><td> &lt;Низкие </td></tr><tr><td> 20-25 фунтов на квадратный дюйм </td><td> 1,8-2,0 PSI </td><td> Низкий </td></tr><tr><td> 30-35 фунтов на квадратный дюйм </td><td> 2,5-3,0 PSI </td><td> Умеренный </tD&gt; </tr><tr><td> 40-50 фунтов на квадратный дюйм </td><td> 3,5-4,5 PSI </td><td> Тяжелый </td></tr><tr><td> 60 фунтов на квадратный дюйм </td><td> 4.8-6.0 PSI </td><td> &gt; Тяжелые </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier at JoVE.com

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

В пробирке моделей травматических мозговой травмы в настоящее время разрабатываются воспроизвести в естественных условиях деформации мозга. Стретч-индуцированной травмой был использован для астроциты, нейроны, глиальные клетки, аорты и эндотелиальных клетках головного мозга. Однако наша система использует гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) модель, которая обладает свойствами составляющих законную модель BBB создать в пробирке TBI модели.

Растянуть в мозге эндотелиальные клетки микрососудов (CEND) в качестве<em&gt; In Vitro</em&gt; Травматические повреждения мозга Модель из гематоэнцефалического барьера

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

МРТ наведением Нарушение гематоэнцефалический барьер использованием транскраниальной сфокусированным ультразвуком в крысиной модели

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Крыса Модель гематоэнцефалический барьер Нарушение чтобы позволить Целевые нейрососудистой терапии

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Наладка<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Модель крысы гематоэнцефалического барьера (ГЭБ): Фокус на BBB Герметичность и рецептор-опосредованного транспорта

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Экзайтотоксическим Стимуляция мозга Microslices как<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель инсульта

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Контролируемая Кортикальная Модель воздействия для черепно-мозговой травмой

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Роман Модель легкой черепно-мозговой травмой для несовершеннолетних крыс

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Кислород-Глюкоза Лишение и реоксигенации в<em&gt; In Vitro</em&gt; Ишемии Травмы моделью для изучения гематоэнцефалического барьера дисфункции

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

Модель травматической травмы спинного мозга на мышах на мышах

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Модель мыши одиночной и повторяющейся легкой травматической травмы головного мозга

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

В анализах in vitro для оценки образования и разрушения сосудов типа мозгового барьера

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...