Dette arbejde blev støttet af en Wellcome Trust Klinisk ph.d.-stipendium (ECAT).

1.. Fabrikation af parylen Mønstre på SiO 2: Process Flow (Se figur 1) <ol><li> Design den ønskede parylen-C-konfiguration med et layout editor software-pakke, der kan læse / skrive CIF (Caltech Intermediate formular) eller GDS-II (Graphic Database System-II) filer. CIF og GDS-II er industri standard filformater til integrerede kredsløb artwork layout. </li><li> Kommissionens foto maske fremstilling til en passende mikroelektronik facilitet, eller gøre in-house hvis der er faciliteter. </li><li> Oxidere en silicium wafer i en atmosfærisk vandret ovn (H2 1,88 SLM og O 2 1.25 SLM) ved 950 ° C i 40 min for at fremstille en 200 nm SiO2 lag (bekræfte tykkelse med en lille plet spektroskopisk reflektometer). </li><li> Prime oxiderede wafer med en silanadhæsionspromotor. Nu deponere parylen-C ved 22 ° C med en hastighed på 1.298 nm / mg dimer ved hjælp af et vakuum deposition system specielt designet til at deponere parylen. A 100nm tyk parylen-C belægning blev anvendt til alle eksempler vist nedenfor. </li><li> Næste indbetaling hexamethyldisilazan (HMDS) adhæsionspromotor på parylen-belagt wafer anvendelse af et egnet fotoresist coating system. </li><li> Nu dreje waferen ved 4.000 rpm i 30 sek samtidig påtrykning af positivt fotoresist (hvilket resulterer i en teoretisk tykkelse på 1 um) under anvendelse af samme fotoresistbelægning som nævnt ovenfor. </li><li> Soft bage wafer i 60 sek ved 90 ° C. </li><li> Indsæt både wafer og præfabrikeret foto maske ind i en maske aligner. </li><li> Eksponere fotoresisten-belagt wafer med en UV negativ repræsentation af den ønskede parylen-C-konfiguration. </li><li> Bages udsat wafer i 60 sekunder ved 110 ° C. </li><li> Fjern alle udsatte foto-modstå fra wafer ved at udvikle i et passende developer løsning. </li><li> Etch fra den ubeskyttede parylen. Brug en ilt plasma etch-system (ved en 50 mTorr kammer pres, 49 SCCM O 2, 100 W RF-effekt ved 13,56 MHz, ogen ætsehastighed 100 nm / min) for at afsløre den underliggende SiO2. </li><li> Skær wafer brug af en passende udskæringssav (spindelhastighed 30.000 rpm, foder hastighed 7 mm / sek.) </li><li> Skyl chips i deioniseret H2O og blæs tør med nitrogen. </li><li> Store chips (på ubestemt tid) i støv fri kasser indtil påkrævet. </li></ol> 2. Chip Rengøring og Aktivering: Protokol <ol><li> Fjerne resterende fotoresist fra chips ved vask i acetone i 10 sek. </li><li> Skyl i deioniseret destilleret H2O 3x. </li><li> Der fyldes op frisk Piranha syre (en 05:03-forhold af 30% hydrogenperoxid og 98% svovlsyre). ADVARSEL: Forbered piranha syre med stor omhu. Det er en ekstremt kraftfuld iltningsmiddel, er stærkt sur, og blande hydrogenperoxid med svovlsyre er en exoterm reaktion. Udfør dette trin i surt emhætte. Tillade 2 minutter at passere efter blanding af Piranha syre men brug inden for 20 min. </li><li> Ren og etch chips ved nedsænkning i piranha syre i 10 min. </li><li> Skyl chips 3x i deioniseret H2O og overføres til en steril kultur fad. </li><li> Nu aktivere chips til celle mønster. For eksempel tilføje to chips per brønd til en 6-brønds plade, og derefter tilsættes 2 ml føtalt bovint serum, således at fuldt ud at fordybe alle chips. Udfør denne og alle efterfølgende stadier cellekultur, under sterile forhold i en laminar strømning vævskultur hætte. </li><li> Inkuber chips i serum i 3-12 timer ved 37 ° C. BEMÆRK: Trin 2,4-2,7 bør udføres sekventielt og uden forsinkelse mellem trin. Hvis serum aktivering er forsinket med ≥ 24 timer efter Piranha-behandling, er celle mønster forringet på grund af reduceret celle frastødning fra SiO 2-regioner. Kan anvendes alternative aktivering opløsninger indeholdende specifikke celleadhæsion-proteiner i stedet for kalvefosterserum. Sådanne løsninger ændrer celle-vedhæftningsegenskaber for de to modsatrettede substrater (se repræsentative resultater for et eksempel). </li&gt; </ol> 3. Plating cellelinjer on-chip: Protokol <ol><li> Fjern chips fra deres aktivering opløsning og vaskes én gang i 10 sekunder i Hanks Balanced Salt Solution. </li><li> Placer chip i en kultur godt og pladen valgt celletype som en suspension i sin sædvanlige vækstmedium. Optimal celle udpladningsdensitet afhænger både af celletype og geometrisk mønster af parylen-C on-chip. En tæthed på 5 x 10 4 celler / ml er en fornuftig udgangspunkt. </li><li> Imaging er skræddersyet til den underliggende motivation for celle mønster, men levende celle adfærd kan let vurderes ved hjælp af et dissektionsmikroskop og et digitalt kamera med et passende relæ linse. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Gold+Surface+Approach+for+Fabrication+and+Interrogation+of+Glycoarrays.">A Versatile Gold Surface Approach for Fabrication and Interrogation of Glycoarrays.</a> ChemBioChem. 9, 1568-1575 (2009).</li><li>Michelini, E., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staying+alive:+new+perspectives+on+cell+immobilization+for+biosensing+purposes.">Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes.</a> Anal. Bioanal. Chem. 402 (5), 1785-1797 (2012).</li><li>Franks, W., Tosatti, S., Heer, F., Seif, P., Textor, M., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cell+adhesion+by+self-assembled+structures+for+use+with+a+CMOS+cell-based+biosensor.">Patterned cell adhesion by self-assembled structures for use with a CMOS cell-based biosensor.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (7), 1426-1433 (2007).</li><li>Bacakova, L., Filova, E., Parizek, M., Ruml, T., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cell+adhesion,+proliferation+and+differentiation+on+materials+designed+for+body+implants.">Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants.</a> Biotechnol. Adv. 29 (6), 739-767 (2011).</li><li>Bacakova, L., Svorcik, V., Kimura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell colonization control by physical and chemical modification of materials. In: Cell growth process: new research. , 5-56 (2008).</li><li>Sanjana, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+flexible+ink-jet+printing+method+for+patterning+dissociated+neurons+in+culture.">A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 151-163 (2004).</li><li>Brittain, S., Paul, K., Zhao, X. -. M., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+and+micro-+fabrication.">Soft lithography and micro- fabrication.</a> Phys. World. 11, 31-36 (1998).</li><li>Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurochip:+a+new+multielectrode+device+for+stimulating+and+recording+from+cultured+neurons.">The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 45-56 (1999).</li><li>Martinoia, S., Bove, M., Tedesco, M., Margesin, B., Grattarola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micro-+fluidic+system+for+patterning+populations+of+neurons+on+silicon+micro-+machined+substrates.">A simple micro- fluidic system for patterning populations of neurons on silicon micro- machined substrates.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 35-44 (1999).</li><li>Zeck, G., Fromherz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuroelectronic+interfacing+with+synaptically+connected+snail+neurons+immobilized+on+a+semiconductor+chip.">Noninvasive neuroelectronic interfacing with synaptically connected snail neurons immobilized on a semiconductor chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (18), 10457-10462 (2001).</li><li>Michel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+molecular+assembly+patterning:+a+new+approach+to+micro-+and+nanochemical+patterning+of+surfaces+for+biological+applications.">Selective molecular assembly patterning: a new approach to micro- and nanochemical patterning of surfaces for biological applications.</a> Langmuir. 18 (8), 3281-3287 (2002).</li><li>Rajalingam, B., Selvarasah, S., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+static+and+dynamic+patterned+cocultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils.">Generation of static and dynamic patterned cocultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7, 1272-1279 (2007).</li><li>Wright, D., Rajalingam, B., Karp, J., Selvarah, S., Ling, Y., Yeh, J., Langer, R., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reusable,+reversibly+sealable+parylene+membranes+for+cell+and+protein+patterning.">Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background.">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning.">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C.">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+patterned+adhesion+and+repulsion+of+HEK+293+cells+on+micro-engineered+parylene-C/SiO2+substrates.">Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates.</a> J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).</li><li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C/silicon+dioxide+substrates:+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain.">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Nedsænkning af chips i piranha syre tjener ikke kun for at fjerne eventuelle organisk materiale, men også ætser underlaget overflader. Dette er nøglen til at muliggøre effektiv aktivering med føtalt bovint serum. Undladelse heraf forhindrer celle-mønster og dybt ændrer celle adfærd on-chip. Der er ingen krav til at sterilisere chips efter rengøring med piratfisk syre. Faktisk har vist sterilisation ved UV-eksponering til at underminere celle mønster på en dosis-afhængig måde 13. Pleje skal tages for at vaske al resterende fotoresist efter fotolitografisk proces. Vedvarende fotoresist kan fungere som en uønsket cyto-klæbende lag, der tilsidesætter mønster dikteret af parylene-C/SiO 2 geometri. Acetone er effektiv, når anvendelse af fotolitografisk proces, der er beskrevet ovenfor, og de reagenser, der er specificeret. Andre typer af fotoresist kan imidlertid kræve en anden solvent. At vurdere virkningen og succes Forskelnt fremstillingstrin, kan måles kontaktvinklen af de to modsatrettede substrater. Figur 2 illustrerer de ændringer, der opstår under chippen aktiveringsprocessen. Det er dog sandsynligt, at særlig lim og frastødende proteinkomponenter i serum i sidste ende gøre det muligt for parylen-mønstrede chip til at udøve deres respektive cyto-klæbende eller cyto-frastødende egenskaber. Alle repræsentative resultater anvendte chips med en parylen tykkelse på 100 nm, selvom vi med succes har mønstrede ved hjælp af både tykkere og tyndere parylen lag. Vigtigere er det, denne fotolitografisk ætsning teknik tillader meget større tredimensionale styring af parylen konfiguration end den, der er illustreret her. For eksempel ved hjælp af en kombination af fotomasker, er det muligt at skabe parylen regioner blandet tykkelse. Dette baner vejen til at skabe cellekulturer med defineret tre-dimensionelle topografi, der går videre end blot at diktere regioner celle adhæsion / repulsionen potentielt giver et middel til at integrere mikrofluidkanaler i konstruktionen. Som vist, men dette mønster platformen ikke er universelt effektive i hele celletyper. Forskellige cellelinjer, med deres varierede celleadhæsionsmolekyle profiler, ikke overraskende opfører sig anderledes, når de dyrkes på denne platform. Vi har endnu ikke identificeret de vigtigste komponenter i serum, eller de gratis celle-membran receptorer, der ligger til grund denne celle-mønster platform. At gøre det i fremtiden lover at udvide dens anvendelighed og specificitet. For eksempel kunne en »ikke-mønster &#39;cellelinje være genetisk modificeret til at udtrykke den fornødne adhæsionsmolekyle og derved fremme mønster.

Forståelse mekanismer, der dikterer celle vedhæftning og mønster på syntetiske materialer er vigtigt for applikationer såsom tissue engineering, lægemiddelforskning, og fremstillingen af biosensorer 1-3. Mange teknikker er til rådighed og under udvikling, hver drage fordel af de utallige biologiske, kemiske og fysiske faktorer, der påvirker celle adhæsion. Her beskriver vi en celle-mønster teknik, der udnytter processer oprindeligt blev udviklet til mikroelektroniske fabrikation formål. Som sådan platform er godt rustet til at muliggøre downstream integration af mikroelektroniske teknologier, såsom multilaterale miljøaftaler, i mønstret platform. Grænsefladen mellem en cellemembran og en tilstødende materiale er tovejs og kompleks. In vivo ekstracellulære matrixproteiner giver struktur og styrke og indflydelse på celle adfærd via interaktioner med celleadhæsionsreceptorer. Tilsvarende celler i vitro interagere med syntetiske substrater via absorberede lag af proteiner 4 mens fysisk-kemiske påvirkninger også modulere vedhæftning. For eksempel kan en polymer overflade gøres mere &quot;befugtelig&quot; (hydrofil) af ioner eller bestråling med ultraviolet lys eller ætsning ved behandling med syre eller hydroxid 5. Etablerede metoder til celle mønster drage fordel af disse og andre celleadhæsionsprocesser mediatorer. Eksempler inkluderer inkjet trykning 6, microcontact stempling 7, fysisk immobilisering 8, MicroFluidics 9, real-time manipulation 10 og selektiv molekylær samling mønster (SMAP) 11.. De har hver deres fordele og begrænsninger. En vigtig drivkraft i vores arbejde, er imidlertid at integrere celle mønster med microelectromechanical systemer (MEMS). MEMS henvise til ekstremt små mekaniske anordninger drevet af elektricitet. Det overlapper med nanoskala tilsvarende nanoelectromechnisk systemer. Dette koncept blev praktisk, når halvleder strategier aktiveret fabrikation at finde sted på mikroskala. Microfabrication teknikker udviklet oprindeligt for halvleder elektronik uforvarende har fundet nyttige for andre anvendelser, såsom cellulær elektrofysiologi, for eksempel. Et centralt nedstrøms mål er at kombinere sådanne mikroelektroniske teknologier med en high fidelity celle mønster proces (danner en BioMEMS enhed). Adskillige eksisterende og ellers pålidelige og praktiske celle-mønster teknikker er uforenelige med denne idé. For eksempel nøjagtig justering af eventuelle indbyggede mikroelektronik eller biosensorer er grundlæggende for deres effektivitet, men er yderst vanskeligt at opnå ved hjælp af en teknik, såsom microcontact stempling. For at omgå dette problem, arbejder vi på en SiO 2-baserede mønster platform, der bruger fotolitografisk trykte parylen-C. Fotolitografi omfatter overførsel af geometriske træk fraen maske på et substrat via UV-belysning. En maske er designet ved hjælp af en passende computerstøttet design program. Ved en glasplade, et tyndt lag af uigennemsigtig chrom repræsenterer ønsket geometrisk mønster (en funktion opløsning på 1-2 mm er mulig). Det substrat, der skal mønstret er belagt med et tyndt lag af fotoresist (en UV-følsom polymer). Den overtrukne polymer derefter afstemt og bringes i tæt kontakt med masken. En UV-kilde er anvendt sådan, at ubeskyttede områder bestråles, og derfor bliver opløselige og aftagelig i næste udviklingstrin, hvilket efterlader et parylen-C repræsentation af masken mønster bag. Denne proces opstod under udviklingen af ​​halvlederkomponenter. Som sådan er siliciumskiver ofte anvendes som substrat. Fotolitografisk aflejring af parylen-C på SiO 2 er derfor en enkel og pålidelig proces, der rutinemæssigt finder sted i mikroelektroniske renrumsfaciliteter. Mens parylen harflere ønskelige bioteknik egenskaber (kemisk inert, ikke bio-nedbrydeligt), en faktor, der begrænser dens direkte brug i celle mønster er dens medfødt dårlig celle klæbeevne, dels tilskrives sin ekstreme hydrofobicitet. Alligevel har parylen-C tidligere blevet anvendt indirekte celle mønster, for eksempel som en afrivelig cellulære skabelon 12,13. Denne fremgangsmåde er begrænset af dårlig opløsning og kræver flere trin. Den her beskrevne fremgangsmåde i stedet anvender en syre etch trin, efterfulgt af serum inkubering at sikre, at parylen-C regioner bliver celle-klæbemiddel, gennem en kombination af reduktion i hydrofobicitet og serumproteiner. Slutresultatet er en konstruktion, der består af to forskellige substrater, som efter biologisk aktivering, manifestere respektive cyto-klæbende eller cyto-frastødende egenskaber og så repræsenterer en effektiv celle pattering platform. Vigtigere er det, der er behov for at indføre den biologiske agforældre i Renrumsfaciliteterne som mønstrede substrater kan gemmes på ubestemt tid før brug (hvorefter de er aktiveret ved hjælp af føtalt bovint serum eller anden aktivering opløsning). Denne parylene-C/SiO 2 mønster platform er derfor en god kandidat til en koalition med MEMS-komponenter, som fremstillingsprocesser så tæt afspejler dem, der anvendes til mikroelektroniske fabrikation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Layout editor software package&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:615px;">Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bespoke photo mask</td>
			<td colspan="2">e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com</td>
			<td>Either fabricate in-house of facilities exist or commision</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">3&#34; Silicon wafers</td>
			<td>e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atmospheric horizontal furnace</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>For oxidising silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Small spot spectroscopic reflectometer</td>
			<td>e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>To measure depth of silicon dioxide layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silane adhesion promoter</td>
			<td>e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/</td>
			<td style="width:215px;">1076730050</td>
			<td>Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parylene-C&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010</td>
			<td style="width:572px;">SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/</td>
			<td style="width:215px;">Model PDS2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter</td>
			<td style="width:572px;">e.g. SpiChem, www.2spi.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Automated track system for dispensing photoresist on wafers.</td>
			<td>e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.&#160; Pre-bake oven cures the resist.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Photo-resist: Rohm &#38; Haas</td>
			<td style="width:572px;">Rohm &#38; Haas, www.rohmhaas.com/</td>
			<td style="width:215px;">&#160;SPR350-1.2 positive photo-resist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Phot-mask aligner</td>
			<td>e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microchem MF-26A developer</td>
			<td>Microchem MF-26A developer, www.microchem.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed reogions of photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Plasma etch system</td>
			<td>e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed regions of parylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Wafer dicing saw</td>
			<td>e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/</td>
			<td style="width:215px;">A929-4&#160;</td>
			<td>To wash off residual photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">98% Sulphuric Acid</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">435589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">10437</td>
			<td>Standard chip activation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">14170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell patterning on photolithographically defined 
parylene-c: sio2 substrates

Cell patterning platforme understøtter brede forsknings-mål, såsom byggeri af foruddefinerede in vitro neuronale netværk og udforskning af visse centrale aspekter af cellulær fysiologi. For nemt at kombinere celle mønster med Multi-elektrode Arrays (MEA) og silicium-baserede »lab på en chip &#39;teknologier, er der en microfabrication-kompatibel protokol kræves. Vi beskriver en fremgangsmåde, der udnytter afsætning af den polymere parylen-C på SiO 2 wafers. Fotolitografi muliggør nøjagtig og pålidelig mønstret af parylen-C på micron-niveau opløsning. Efterfølgende aktivering ved nedsænkning i oksefosterserum (eller en anden specifik aktivering opløsning) resulterer i et substrat, hvor dyrkede celler overholde, eller frastødt af, parylen eller SiO 2-regioner hhv. Denne teknik har muliggjort mønstret af en bred vifte af celletyper (herunder primære murine hippocampus celler, HEK 293 cellelinje, human neuron-lignende teratocarcinomcellercellelinie, primære murine cerebellumgranulaceller og primære humane gliom-afledte stamceller-lignende celler). Men interessant platformen ikke er universel; afspejler vigtigheden af ​​cellespecifikke adhæsionsmolekyler. Denne celle mønster proces er omkostningseffektiv, pålidelig og vigtigere kan indarbejdes i standard microfabrication (chipproduktion) protokoller, der baner vejen for integration af mikroelektronik.

Fotolitografisk proces mønstring SiO2 med parylen-C er vist i figur 1. Når forberedt, aktivering af chips i kalvefosterserum muliggør en bred vifte af celletyper, der skal mønstrede i kultur. Vores gruppe har med succes mønstret primære murine hippocampusceller 14-16, HEK 293-cellelinje 17 human neuron-lignende teratocarcinom (hNT cellelinie) 18 primære murine cerebellumgranulaceller og primære humane gliom-afledte stamceller-lignende celler. Figur 3 viser robust mønstret af HEK 293 celler på en parylen mønster bestående af cirkulære noder med &#39;cross-hår&#39; extensions. Chip aktivering i dette eksempel var med føtalt bovint serum. Derimod Figur 4 illustrerer potentialet til at forøge mønstret platform ved anvendelse af alternative aktivering løsninger. Ved hjælp af en opløsning af bovint serumalbumin (3 mg / ml) og<html> fibronectin (1 ug / ml) i HBSS, har den tidligere mønster forskrift er inverteret. Figur 5 illustrerer en anden celletype (en primær human-afledte stamceller-lignende cellelinie afledt fra en høj gliom). Her geometri underliggende virkninger mønster celle adfærd, med det mønster, der er vist i figur 4A fremme celle vækstproces langs tynde parylen-C spor som vist i figur 4B og 4C. Nogle celletyper ikke mønster, når du bruger den etablerede oksefosterserum aktivering protokol. Figur 6 viser 3T3 L1 celler vokser til sammenflydning uden mærkbare cyto-frastødende eller cyto-klæbende forskel mellem parylen-C og SiO 2-regioner. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Flow diagram, der illustrerer fremgangsmåden til fremstilling af parylen-C mønstre på SiO2. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> Figur 2. Flow diagram, der illustrerer ændringerne i kontakt vinkel mønstrede parylen-C og SiO 2 domæner under chip aktivering trin. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> Figur 3. Levende celler af HEK 293-celler dyrket på parylene-C/SiO 2 efter tre dage in vitro. Chips inkuberet i 3 timer i kalvefosterserum, hvorefter cellerne blevudpladet i suspension ved en koncentration på 5 x 10 4 celler / ml. Parylen-C fremmer celle adhæsion mens nøgne SiO2 frastøder celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> Figur 4.. Levende celler af HEK 293-celler dyrket på parylene-C/SiO 2 efter tre dage in vitro Chips aktiveret i 3 timer i forskellige rationel aktivering løsninger. A: kalvefosterserum B: vitronectin (1 ug / ml) i HBSS C: Bovint serumalbumin (3 mg / ml) + vitronectin (1 ug / ml) i HBSS, D: Bovint serumalbumin (3 mg / ml) + fibronectin (156 g / ml) i HBSS. Udpladede celler var i suspension ved en densitet på 5 x 10 4 celler / ml. Bemærk hvordan forskellige behandling af chip har resulteret i tilbageførsel af det tidligere mønster dogme, med SiO2 nu lim og parylen-C frastødende. Parylen-C node diameter 250 um, tilpasset fra Hughes et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> Figur 5. Immunfluorescens billeder af primære humane gliom-afledt stamceller-lignende celler dyrket på forskellige mønstre af parylen-C på SiO 2 A:. Skematisk illustrerer reticular parylen design vist i B og C </strong&gt; B:.. Fluorescens mikrograf af fikserede celler (efter 4 dage in vitro) farvet for gliafibrillært surt protein (GFAP) C:. Lysmikroskopi af levende celler på samme chip D: Fluorescens billede, der viser GFAP-farvede celler på en anden parylen . design E:. Reflektans billede af node og talte parylen design filmede i D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> Figur 6. Levende celler af 3T3-L1 celler dyrket på parylene-C/SiO 2 efter fire dage in vitro. Chips aktiveret i 3 timer i kalvefosterserum efter vægthich celler blev udpladet i suspension (3 x 10 4 celler / ml). I dette tilfælde, er platformen ikke aktivere mønster, med celler at blive lige så sammenflydende på parylen-C og SiO 2-regioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates at JoVE.com

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Denne protokol beskriver en microfabrication-kompatibel metode til celle mønster på SiO2. En foruddefineret parylen-C design fotolitografisk trykt på SiO 2 wafers. Efter inkubation med serum (eller anden aktivering løsning) celler overholder specifikt til (og vokse i henhold til overensstemmelse) underliggende parylen-C, mens bliver frastødt af SiO 2-regioner.

Cell Patterning på fotolitografisk Defineret Parylene-C: SiO<sub&gt; 2.</sub&gt; Underlag

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering af Cortex Organisation og Dynamics i mikroorganismer, ved hjælp af total indre refleksion Fluorescens Mikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Celle co-kultur Patterning hjælp Vandige tofasesystemer

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Brug Adhesive mønstret Konstruér 3D Paper mikrofluidenheder

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Hurtig Subtraktiv mønster af levende cellelag med et Mikrofluid Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Light-medieret dannelse og mønsterdannelse af hydrogeler til celledyrkningsapplikationer

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Et alsidigt Metode til mønstring Proteiner og celler

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mønster bioaktive proteiner eller peptider på Hydrogel ved hjælp af fotokemi for biologiske applikationer

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Evaluering af keratinocytter spredning på to - og tre - dimensionelle Type I kollagen substrater

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...