Diese Arbeit wurde durch ein Wellcome Trust Klinische Promotionsstipendium (ECAT) unterstützt.

1. Herstellung von Parylene Muster auf SiO 2: Ablauf (siehe Abbildung 1) <ol><li> Design-Wunsch Parylene-C-Konfiguration mit einem Layout-Editor-Software-Paket, der fähig ist Lesen / Schreiben CIF (Caltech Zwischenform) oder GDS-II (Grafik Datenbanksystem-II)-Dateien. CIF und GDS-II sind Industriestandard-Dateiformate für die integrierte Schaltung Grafik-Layout. </li><li> Kommission Photomaske herzustellen, um eine geeignete Anlage Mikroelektronik, oder machen Sie im Haus, wenn Einrichtungen vorhanden sind. </li><li> Oxidieren einen Silizium-Wafer in einem atmosphärischen Horizontalofen (H 2 1.88 SLM und O 2 1,25 SLM) bei 950 ° C für 40 min, um eine 200 nm SiO 2-Schicht (Dicke bestätigen mit einer kleinen Spot-spektroskopische Reflektometer) zu produzieren. </li><li> Prime das oxidierte Wafer mit einem Silan-Haftvermittlers. Jetzt einzahlen Parylen-C auf 22 ° C bei einer Rate von 1,298 nm / mg Dimer unter Verwendung einer Vakuumabscheidungssystem speziell für Parylen abzulagern. A 100nm dicke Parylene-C-Beschichtung wurde für alle unten gezeigten Beispiele verwendet. </li><li> Nächste Einzahlung Hexamethyldisilazan (HMDS) Haftvermittler auf der Parylen-beschichtete Wafer mit einem geeigneten Photoresist-Beschichtungssystem. </li><li> Jetzt dreht den Wafer bei 4000 Upm für 30 sec, während die Anwendung positiven Photoresist (was zu einer theoretischen Dicke von 1 &amp;mgr; m) unter Verwendung der gleichen Fotolackbeschichtungssystem, wie oben beschrieben. </li><li> Softbake der Wafer für 60 Sekunden bei 90 ° C. </li><li> Legen Sie sowohl die Wafer-und Foto vorgefertigte Maske in einem Mask Aligner. </li><li> Belichten den Photoresist-beschichtete Wafer mit einer UV-negativen Darstellung des gewünschten Parylen-C-Konfiguration. </li><li> Backen belichteten Wafer 60 Sekunden lang bei 110 ° C. </li><li> Entfernen Sie alle belichtete Fotolack von dem Wafer durch die Entwicklung in einer geeigneten Entwicklerlösung. </li><li> Ätzen von der ungeschützten Parylene. Verwenden Sie ein Sauerstoffplasma Etch-System (bei ​​einem Kammerdruck 50 Torr, 49 sccm O 2, 100 W HF-Leistung bei 13,56 MHz undeine Ätzrate von 100 nm / min), um die darunter liegende SiO 2 offenbaren. </li><li> Würfeln Wafer unter Verwendung eines geeigneten Schneidsäge (Spindeldrehzahl 30.000 min, Vorschubgeschwindigkeit 7 mm / s). </li><li> Spülen Chips in deionisiertem H 2 O und trocken blasen mit Stickstoff. </li><li> Shop-Chips (unbegrenzt) in staubfreien Schachteln, bis sie benötigt. </li></ol> 2. Chip Reinigung und Aktivierung: Protokoll <ol><li> Rückstände von Photoresist von Chips durch Waschen in Aceton für 10 Sekunden. </li><li> Spülen in entionisiertem destilliertem H 2 O 3x. </li><li> Make-up frisch Piranha-Säure (a 05.03 Quote von 30% Wasserstoffperoxid und 98% Schwefelsäure). ACHTUNG: Bereiten Piranha-Säure mit großer Sorgfalt. Es ist ein extrem starkes Oxidationsmittel, stark sauer ist, und Mischen von Wasserstoffperoxid mit Schwefelsäure eine exotherme Reaktion ist. Führen Sie diesen Schritt in einem sauren Abzug. Lassen Sie 2 min nach dem Mischen der Piranha-Säure passieren aber verwenden Sie innerhalb von 20 min. </li><li> Reinigen und Ätzen Chips durch Eintauchen in piranha Säure für 10 min. </li><li> Spülen Chips 3x in VE-H 2 O und übertragen in eine sterile Kulturschale. </li><li> Aktivieren Sie nun Chips für Mobil Musterung. Fügen Sie beispielsweise zwei Chips pro Vertiefung einer 6-Well-Platte und dann 2 ml fetales Rinderserum, um alle Chips voll einzutauchen. Führen Sie das, und alle nachfolgenden Stufen der Zellkultur, unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Gewebekultur Kapuze. </li><li> Chips in Serum für 3-12 h bei 37 ° C. HINWEIS: Schritte 2,4-2,7 sollten nacheinander und ohne Verzögerung zwischen den Schritten durchgeführt werden. Wenn Serum Aktivierung wird durch ≥ 24 h verzögert, nachdem Piranha-Behandlung, Zell Strukturierung aufgrund der reduzierten Zell Abstoßung von SiO 2-Regionen beeinträchtigt. Alternative Lösungen Aktivierung spezifischer Zellhaftproteine ​​enthält, kann anstelle des fötalen Rinderserum verwendet werden. Solche Lösungen verändern die Zellhaftungseigenschaften der zwei kontras Substraten (siehe repräsentative Ergebnisse für ein Beispiel). </li&gt; </ol> 3. Plating Zelllinien On-Chip: Protokoll <ol><li> Chips entfernen von ihren Aktivierungslösung und einmal waschen für 10 Sekunden in Hanks Balanced Salt Solution. </li><li> Zeigen Chip in einer Kultur gut und Platte gewählt Zelltyp als Suspension in seiner üblichen Wachstumsmedien. Optimale Zell Beschichtungs-Dichte hängt sowohl vom Zelltyp und geometrische Muster der Parylene-C auf dem Chip. Einer Dichte von 5 x 10 4 Zellen / ml ist ein vernünftiger Ausgangspunkt. </li><li> Imaging ist auf die zugrunde liegende Motivation für die Zell Musterung aber Lebendzellverhalten kann leicht mit einem Binokular und eine Digitalkamera mit einem geeigneten Relais-Linse beurteilt werden zugeschnitten. </li></ol>

<ol>
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Biomed. Mater. Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background.">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning.">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C.">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+patterned+adhesion+and+repulsion+of+HEK+293+cells+on+micro-engineered+parylene-C/SiO2+substrates.">Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates.</a> J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).</li><li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C/silicon+dioxide+substrates:+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain.">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Immersion von Chips in Piranha-Säure dient nicht nur, um restliche organische Material zu entfernen, sondern auch ätzt der Substratoberflächen. Dies ist der Schlüssel, um eine effektive Aktivierung mit fetales Rinderserum. Andernfalls verhindert Zell-Strukturierung und verändert das Verhalten der Zelle auf dem Chip zutiefst. Es ist nicht erforderlich, um Chips nach der Reinigung mit Piranha-Säure zu sterilisieren. Tatsächlich Sterilisation durch UV-Exposition wurde gezeigt, dass Zell Strukturierung in einer Dosis-abhängigen Weise 13 zu untergraben. Es ist darauf zu nach der Photolithographieprozess abwaschen gesamte restliche Photolack werden. Die anhaltenden Photoresist als unerwünschte Zyto-Klebeschicht, die Strukturierung durch parylene-C/SiO 2 Geometrie diktiert schreibt handeln. Aceton ist wirksam, wenn sie unter Verwendung der oben und mit den angegebenen Reagenzien beschrieben Photolithographieprozess. Jedoch können andere Arten von Photoresist erfordern eine andere Lösungsmittel. Um die Wirkung und den Erfolg der differe bewertennt Herstellungsschritte kann der Kontaktwinkel der zwei kontras Substraten gemessen werden. Fig. 2 zeigt die Veränderungen, die während des Chipaktivierungsprozess auftreten. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass spezifische Haft und abstoßenden Proteinkomponenten im Serum schließlich ermöglichen die Parylene-Chip strukturiert, um in das Zyto-Klebstoff oder Zyto-abstoßenden Eigenschaften ausüben. Alle repräsentative Ergebnisse verwendeten Chips mit einer Parylene Dicke von 100 nm, allerdings haben wir erfolgreich sowohl mit dickeren und dünneren Parylenschichten gemustert. Wichtig ist, ermöglicht diese photolithographischen Ätztechnik viel größere dreidimensionale Steuerung von Parylen als hier die Konfiguration veranschaulicht. Beispielsweise unter Verwendung einer Kombination von Photomasken, ist es möglich, Parylen Regionen Misch Dicke zu schaffen. Dies öffnet den Weg zur Schaffung Zellkulturen mit definierten dreidimensionalen Topographie, über die einfache Diktieren Regionen der Zelladhäsion / Abstoßung gehension, die möglicherweise eine Mittel zur Integration von mikrofluidischen Kanälen in das Konstrukt. Wie gezeigt, ist dies jedoch nicht Strukturierungs Plattform universell wirksam für Zelltypen. Verschiedene Zelllinien, mit ihren vielfältigen cell adhesion molecule-Profile, wenig überraschend anders verhalten, wenn auf dieser Plattform kultiviert. Wir haben noch nicht identifiziert die wichtigsten Komponenten im Serum, noch die kostenlose Zellmembran-Rezeptoren, die diese Zelle Strukturierungsplattform zu untermauern. Dies in Zukunft verspricht, seinen Nutzen und Spezifität zu erweitern. Zum Beispiel könnte ein &quot;Nicht-Muster&quot; Zelllinie genetisch modifiziert werden, um die erforderliche Adhäsionsmolekül zu exprimieren und so die Förderung Strukturierung.

Mechanismen zu verstehen, die die Zelladhäsion und Strukturieren diktieren synthetischer Materialien ist für Anwendungen wie beispielsweise Gewebe-Engineering, Arzneimittelforschung und die Herstellung von Biosensoren 1-3. Viele Techniken sind verfügbar und weiterentwickelt, die jeweils unter Ausnutzung der unzähligen biologischen, chemischen und physikalischen Faktoren, die Zelladhäsion zu beeinflussen. Hier beschreiben wir eine zellStrukturierungsTechnik, die ursprünglich für die Mikroelektronik-Fertigung Zwecke entwickelte Verfahren nutzt. Als solches ist die Plattform gut positioniert, um stromabwärts Integration von mikroelektronischen Technologien wie MEAs zu ermöglichen, in die Muster Plattform. Die Schnittstelle zwischen einer Zelle und einer benachbarten Membranmaterial ist bidirektional und komplex. In vivo extrazellulären Matrixproteinen bereitzustellen Struktur und Festigkeit und Auswirkungen auf das Verhalten der Zelle über Wechselwirkungen mit Zelladhäsionsrezeptoren. Ebenso Zellen in vITRO mit synthetischen Substraten zu interagieren über absorbiert Schichten von Proteinen 4, während die physikalisch-chemischen Einflüssen modulieren auch die Haftung. Zum Beispiel kann ein Polymeroberfläche kann mehr &quot;benetzbar&quot; (hydrophil) mit Ionen oder UV-Lichtbestrahlung, Ätzen oder durch Behandlung mit Säure oder Hydroxid 5 wiedergegeben werden. Etablierte Methoden zur Zell Strukturierung profitieren Sie von diesen und anderen Zell-Adhäsion Mediatoren. Beispiele sind Tintenstrahldruck 6, Mikropräge 7, physikalische Immobilisierung 8, 9 Mikrofluidik, Echtzeit-Manipulation 10 und selektive molekulare Anordnung Strukturierung (SMAP) 11. Jeder hat spezifische Vorteile und Grenzen. Ein wesentlicher Treiber in unserer Arbeit, ist aber zu Zelle Strukturierung mit mikroelektromechanische Systeme (MEMS) zu integrieren. MEMS beziehen sich auf extrem kleine mechanische Geräte mit Strom angetrieben. Diese überschneidet sich mit der Nanoskala äquivalent, nanoelectromechanischer Systemen. Dieses Konzept wurde praktisch nur bei Halbleiterfertigungsstrategien aktiviert, um Platz auf der Mikro nehmen. Mikrofertigungstechniken, die ursprünglich für Halbleiterelektronik entwickelt versehentlich nützlich für andere Anwendungen, wie Mobilelektro gefunden worden, zum Beispiel. Ein Schlüsselabwärts Ziel ist es, wie mikroelektronischen Technologien mit einem High-Fidelity-Zelle Strukturierungsprozess (Bildung einer bioMEMS Gerät) zu kombinieren. Mehrere bestehende und ansonsten zuverlässig und praktisch zellStrukturierungsTechniken sind mit dieser Idee nicht vereinbar. Zum Beispiel ist eine genaue Ausrichtung der eingebettete Mikroelektronik oder Biosensoren Grund ihre Wirksamkeit ist jedoch extrem schwierig mit einer Technik wie Mikroprägung zu erreichen. Um dieses Problem zu umgehen, sind wir auf einem SiO 2-Basis-Plattform, die Strukturierung fotolithographisch gedruckt Parylene-C verwendet tätig. Die Photolithographie beinhaltet Transfer von geometrischen Merkmalen voneine Maske auf ein Substrat mittels UV-Beleuchtung. Eine Maske wird unter Verwendung einer geeigneten Computer-Aided Design-Programm. Auf einer Glasplatte, eine dünne Schicht von nicht-transparenten Chrom stellt das gewünschte geometrische Muster (eine Funktion Auflösung von 1-2 mm ist möglich). Das Substrat, das strukturiert werden soll, mit einer dünnen Schicht aus Photoresist (ein UV-empfindliches Polymer) beschichtet. Das beschichtete Polymer wird dann ausgerichtet und in engem Kontakt mit der Maske gebracht. Ein UV-Quelle ist so aufgebracht, dass ungeschützte Bereiche bestrahlt werden und somit löslich und Wechsel werden in der nächsten Entwicklungsschritt, so dass eine Parylene-C Darstellung der Maske Muster hinter. Dieser Prozess während der Entwicklung von Halbleitervorrichtungen entstanden. Als solche sind Siliziumscheiben häufig als Substrat verwendet. Photolithographische Ablagerung von Parylene-C auf SiO 2 ist daher eine einfache und sichere Verfahren, die routinemäßig in der Mikroelektronik Reinraum stattfindet. Während Parylene hatmehrere wünschenswerte Eigenschaften Bioengineering (chemisch inert, nicht biologisch abbaubar), ist ein Faktor, jedoch in ihrem direkten Einsatz in der Zell Strukturierung seiner Natur aus schlechte Haftzelle, zum Teil auf seine extreme Hydrophobie zugeschrieben. Dennoch Parylen-C zuvor indirekt für Zellmusterungs als Ablöse zellulären Vorlage 12,13 verwendet, zum Beispiel. Dieser Ansatz wird durch schlechte Auflösung beschränkt und erfordert mehrere Schritte. Das hier beschriebene Verfahren nutzt stattdessen eine Säure Ätzschritt, gefolgt von Serum inkubiert, um sicherzustellen, dass die Parylen-C-Regionen werden zelladhäsive, durch eine Kombination von Verminderung der Hydrophobie und Serumproteinbindung. Das Endergebnis ist ein Konstrukt aus zwei verschiedenen Substraten, die nach der biologischen Aktivierung, manifestieren jeweiligen Cyto-Klebstoff oder Cyto-abstoßende Eigenschaften und damit für eine wirksame Zellmusterungs Plattform besteht. Wichtig ist, gibt es keine Notwendigkeit, die biologische ag einführenEltern in den Reinraum-Anlage, wie die gemusterte Substrate unbegrenzt vor der Verwendung gelagert werden (worauf sie mit fötalem Kälberserum oder eine andere Aktivierungslösung aktiviert sind). Diese parylene-C/SiO 2 Muster Plattform ist daher ein guter Kandidat für eine Koalition mit MEMS-Komponenten, da die Herstellungsprozesse so eng spiegeln die für die Mikroelektronik-Fertigung eingesetzt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Layout editor software package&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:615px;">Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bespoke photo mask</td>
			<td colspan="2">e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com</td>
			<td>Either fabricate in-house of facilities exist or commision</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">3&#34; Silicon wafers</td>
			<td>e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atmospheric horizontal furnace</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>For oxidising silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Small spot spectroscopic reflectometer</td>
			<td>e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>To measure depth of silicon dioxide layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silane adhesion promoter</td>
			<td>e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/</td>
			<td style="width:215px;">1076730050</td>
			<td>Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parylene-C&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010</td>
			<td style="width:572px;">SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/</td>
			<td style="width:215px;">Model PDS2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter</td>
			<td style="width:572px;">e.g. SpiChem, www.2spi.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Automated track system for dispensing photoresist on wafers.</td>
			<td>e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.&#160; Pre-bake oven cures the resist.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Photo-resist: Rohm &#38; Haas</td>
			<td style="width:572px;">Rohm &#38; Haas, www.rohmhaas.com/</td>
			<td style="width:215px;">&#160;SPR350-1.2 positive photo-resist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Phot-mask aligner</td>
			<td>e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microchem MF-26A developer</td>
			<td>Microchem MF-26A developer, www.microchem.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed reogions of photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Plasma etch system</td>
			<td>e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed regions of parylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Wafer dicing saw</td>
			<td>e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/</td>
			<td style="width:215px;">A929-4&#160;</td>
			<td>To wash off residual photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">98% Sulphuric Acid</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">435589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">10437</td>
			<td>Standard chip activation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">14170</td>
			<td></td>
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cell patterning on photolithographically defined 
parylene-c: sio2 substrates

Handy Strukturierung Plattformen unterstützen breiten Forschungsziele, wie den Bau von vordefinierten in vitro neuronale Netze und die Erforschung bestimmter zentrale Aspekte der Zellphysiologie. Um einfach kombinieren Zelle Strukturierung mit Multi-Elektroden-Arrays (MEAs) und Silizium-basierte &quot;Lab on a Chip&quot;-Technologien, wird ein Mikro-kompatible Protokoll erforderlich. Wir beschreiben eine Methode, die Abscheidung der Polymer Parylene-C auf SiO 2-Wafer verwendet. Fotolithografie ermöglicht eine genaue und zuverlässige Strukturierung Parylene C bei Mikrometerauflösung. Anschließender Aktivierung durch Eintauchen in fötalem Rinderserum (oder ein anderes spezielles Aktivierungslösung) zu einem Substrat, in dem kultivierten Zellen haften, oder von Parylen oder SiO 2-Regionen bzw. abgestoßen. Diese Technik wurde Strukturierung von einem breiten Spektrum von Zelltypen (einschließlich primären murinen Hippocampus-Zellen, HEK 293-Zelllinie, menschliche Neuronen-wie Teratokarzinom erlaubtZelllinie, primären murinen Kleinhirnkörnerzellen und primären humanen Gliom-Stammzellen aus-ähnliche Zellen). Interessanterweise ist die Plattform nicht universell, was die Bedeutung der Zell-spezifische Adhäsionsmoleküle. Diese Zelle Strukturierungsprozess ist kostengünstig, zuverlässig, und vor allem kann in Standard-Mikrofabrikation (Chip-Herstellung)-Protokolle integriert werden, die den Weg für die Integration von mikroelektronischen Technologie.

Das photolithographische Verfahren zur Strukturierung SiO 2 mit Parylen-C ist in Fig. 1 dargestellt. Einmal hergestellt, die Aktivierung von Chips in fötalem Rinderserum ermöglicht eine Vielzahl von Zelltypen in Kultur strukturiert werden. Unsere Gruppe hat erfolgreich primären murinen Hippocampus-Zellen 14-16, die HEK 293-Zelllinie 17, die menschliche Neuronen-wie Teratokarzinom (hNT) Zelllinie 18, primären murinen Kleinhirnkörnerzellen und primären humanen Gliom-Stammzellen aus-ähnlichen Zellen strukturiert. Abbildung 3 zeigt robuste Strukturierung von HEK 293 Zellen auf einer Parylene Muster aus kreisförmigen Knoten mit &quot;Fadenkreuz&quot;-Erweiterungen. Chip-Aktivierung in diesem Beispiel war mit fötalem Rinderserum. Im Gegensatz dazu zeigt Fig. 4 die Möglichkeit, die Musterung Plattform durch alternative Aktivierungslösungen erhöhen. Verwendung einer Lösung von Rinderserumalbumin (3 mg / ml) und<html> Fibronectin (1 ug / ml) in HBSS, das vorherige Strukturierung Vorschrift invertiert wurde. Abbildung 5 zeigt einen anderen Zelltyp (ein Haupt Menschen stammenden Stammzelllinie aus einem hochgradigen Gliom). Hier ist die Geometrie des zugrundeliegenden Musters Auswirkungen Zellverhalten, mit dem in Fig. 4A gezeigten Muster Förderung des Zellwachstumsprozesses entlang dünne Parylen-C verfolgt, wie in Fig. 4B und 4C gezeigt. Einige Zelltypen nicht Muster bei Verwendung der etablierten fetales Rinderserum Aktivierung Protokoll. Abbildung 6 zeigt 3T3-L1-Zellen, die zu ohne erkennbaren Zyto-abstoßend oder Zyto-Klebstoff Unterschied zwischen Parylene-C und SiO 2-Regionen Konfluenz. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Fig. 1 ist. Flussdiagramm, welches das Verfahren zur Herstellung von Parylen C-Muster auf SiO 2. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> 2. Flussdiagramm, das die Änderungen des Kontaktwinkels für strukturierte Parylen C und SiO 2-Domänen bei der Chipaktivierungsschritte. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> 3. Lebenden Zellen von HEK 293-Zellen nach drei Tagen in vitro auf parylene-C/SiO 2 kultiviert. Chips für 3 h in fötalem Rinderserum inkubiert, danach wurden die Zellenin Suspension bei einer Konzentration von 5 x 10 4 Zellen / ml plattiert. Parylene-C fördert die Zellhaftung, während nackten SiO 2-Zellen abstößt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> 4. Lebenden Zellen von HEK 293-Zellen auf parylene-C/SiO 2 kultiviert nach drei Tagen in vitro-Chips 3 h in verschiedenen rationalisierten Aktivierungslösungen aktiviert:. A: fötales Rinderserum, B: Vitronectin (1 ug / ml) in HBSS, C: Rinderserumalbumin (3 mg / ml) + Vitronectin (1 ug / ml) in HBSS, D: Rinderserumalbumin (3 mg / ml) + Fibronectin (156, g / ml) in HBSS. Zellen ausplattiert wurden in Suspension bei einer Dichte von 5 x 10 4 Zellen / ml. Beachten Sie, wie die unterschiedliche Behandlung des Chips ist in Umkehrung der bisherigen Strukturierung Dogma, mit SiO 2 nun klebrig und Parylene-C abstoßend geführt. Parylene-C Knotendurchmesser 250 um, von Hughes et al. Angepasst 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">​​Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> 5. . Immunfluoreszenz-Bilder von primären humanen Gliom-Stammzellen aus-ähnlichen Zellen auf verschiedene Muster von Parylene-C auf SiO 2 A gewachsen: schematische Darstellung der in B und C gezeigt retikulären Parylene Design </strong&gt; B:.. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von fixierten Zellen (nach 4 Tagen in vitro) für gliale fibrilläre saure Protein (GFAP) gefärbt C:. Lichtmikroskopische Aufnahme von lebenden Zellen auf demselben Chip D: Fluoreszenzbild darstellt, GFAP-gefärbten Zellen auf einem anderen Parylen . Design E:. Reflexions Bild des Knotens und sprach Parylene Design in D abgebildet <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> 6. Live-Cell-Imaging von 3T3 L1-Zellen nach vier Tagen in vitro an parylene-C/SiO 2 kultiviert. Chips für 3 Stunden in fetales Rinderserum nach w aktiviertelche Zellen wurden in Suspension (3 x 10 4 Zellen / ml) ausplattiert. In diesem Fall ist die Plattform nicht aktivieren Musterung, mit Zellen konfluent immer gleich auf Parylene-C und SiO 2-Regionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Parylene-C: SiO2 Substrates at JoVE.com

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikro-kompatible Methode zur Zellstrukturierung auf SiO 2. Eine vordefinierte Parylene-C Design ist fotolithographisch auf SiO 2-Wafer gedruckt. Nach der Inkubation mit Serum (oder andere Aktivierungslösung) Zellen anhaften speziell auf (und wachsen nach der Konformität) zugrunde liegenden Parylene-C, und dabei von SiO 2-Regionen zurückgeschlagen.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

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Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

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