Dette arbeidet ble støttet av en Wellcome Trust Klinisk PhD-stipendiat (ECAT).

En. Fabrikasjon av Parylene Mønstre på SiO 2: Process Flow (Se figur 1) <ol><li> Design ønsket parylene-C-konfigurasjon ved hjelp av en layout editor programvarepakke, i stand til lesing / skriving CIF (Caltech Intermediate skjema) eller GDS-II (Graphic Database System-II)-filer. CIF og GDS-II er industristandard filformater for integrert krets kunstverk layout. </li><li> Kommisjonen bilde maske produksjon til en passende mikroelektronikk anlegget, eller gjøre i huset hvis det finnes anlegg. </li><li> Oksidere en silisiumskive i en atmosfærisk ovn horisontal (H 2 1,88 SLM og O 2 1,25 SLM) ved 950 ° C i 40 min for å produsere et 200 nm SiO to lag (bekreft tykkelse med en liten flekk spektroskopisk reflektometer). </li><li> Prime oksidert wafer med en silane heftformidler. Nå setter parylene-C ved 22 ° C med en hastighet på 1,298 nm / mg dimer ved hjelp av en vakumdeponering system spesielt designet for å sette parylene. A 100nm tykt parylene-C-belegg ble brukt for alle eksemplene som er vist nedenfor. </li><li> Neste innskudd heksametyldisilazan (HMDS) heftformidler på parylene-belagt skive med et egnet foto motstå belegg system. </li><li> Nå spinne wafer ved 4000 rpm i 30 sekunder, mens påføring av positive fotoresist (som resulterer i en teoretisk tykkelse på 1 mm), ved hjelp av den samme fotoresistente belegg system som ovenfor. </li><li> Myk bake skiven i 60 sek ved 90 ° C. </li><li> Sett både wafer og premanufactured foto maske i en maske aligner. </li><li> Eksponer fotoresistente-belagt skive med en UV negative representasjon av den ønskede parylene-C-konfigurasjon. </li><li> Bake utsatt wafer for 60 sek ved 110 ° C. </li><li> Fjern alle utsatt Fotoresistmaterialet fra wafer ved å utvikle en hensiktsmessig fremkallerløsning. </li><li> Etse av ubeskyttet parylene. Bruk en oksygen plasma etch system (på en 50 mTorr kammertrykk, 49 SCCM O 2, 100 W RF power på 13,56 MHz, ogen etch hastighet på 100 nm / min) for å avsløre den underliggende SiO 2. </li><li> Terninger wafer med en passende dicing sag (spindelhastighet 30000 rpm, matehastighet 7 mm / sek). </li><li> Skyll chips i avionisert H 2 O og føn med nitrogen. </li><li> Lagre chips (på ubestemt tid) i støvfrie bokser inntil nødvendig. </li></ol> 2. Chip Rengjøring og Aktivering: Protokoll <ol><li> Fjern gjenværende fotoresist fra chips ved vasking i aceton i 10 sek. </li><li> Skyll i avionisert destillert H 2 O 3x. </li><li> Make up frisk piranha syre (a 05:03-forhold av 30% hydrogenperoksyd og 98% svovelsyre). FORSIKTIG: Forbered piraja syre med stor forsiktighet. Det er et ekstremt kraftig oksydasjonsmiddel, er sterkt sure, og blande hydrogenperoksyd med svovelsyre er en eksoterm reaksjon. Utfør dette stadiet i en syre avtrekkshette. Tillat to minutter til å passere etter å blande piraja syre men bruk innen 20 min. </li><li> Rene og etse chips ved nedsenkning i piranha syre i 10 min. </li><li> Skyll chips 3x i avionisert H 2 O og overføre til en steril kultur parabolen. </li><li> Nå aktivere sjetonger for celle mønster. For eksempel legge to brikker per brønn til en 6-brønns plate og deretter legge 2 ml føtalt bovint serum, slik som å fordype alle chips. Utføres denne og alle etterfølgende cellekultur-fase, under sterile betingelser i en laminær strømningshette vevskultur. </li><li> Inkuber chips i serum i 3-12 timer ved 37 ° C. MERK: Steps 02.04 til 02.07 skal utføres sekvensielt og uten forsinkelse mellom trinnene. Hvis serum aktivering er forsinket med ≥ 24 timer etter piraja-behandling, er celle mønster svekket på grunn av redusert celle frastøting fra SiO 2 regioner. Alternativt aktiveringsløsninger inneholdende spesifikke celle adhesjon proteiner kan brukes i stedet for føtalt bovint serum. Slike løsninger forandre celle-adhesjons-egenskapene til de to kontrasterende substrater (se representative resultater for et eksempel). </li&gt; </ol> Tre. Plating Cell Lines On-chip: Protocol <ol><li> Fjern chips fra sin aktiveringsløsningen og vask en gang i 10 sekunder i Hanks Balanced Salt Solution. </li><li> Plasser chip i en kultur godt og plate utvalgt celletype som en suspensjon i sin vanlige vekstmedier. Optimal celle plating tetthet avhenger både av celletype og geometrisk mønster av parylene-C on-chip. En tetthet på 5 x 10 4 celler / ml er en fornuftig utgangspunkt. </li><li> Imaging er skreddersydd til den underliggende motivasjon for celle mønster, men levende celle atferd kan lett bli vurdert ved hjelp av en dissekere mikroskop og et digitalt kamera med en egnet relé objektiv. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Gold+Surface+Approach+for+Fabrication+and+Interrogation+of+Glycoarrays.">A Versatile Gold Surface Approach for Fabrication and Interrogation of Glycoarrays.</a> ChemBioChem. 9, 1568-1575 (2009).</li><li>Michelini, E., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staying+alive:+new+perspectives+on+cell+immobilization+for+biosensing+purposes.">Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes.</a> Anal. Bioanal. Chem. 402 (5), 1785-1797 (2012).</li><li>Franks, W., Tosatti, S., Heer, F., Seif, P., Textor, M., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cell+adhesion+by+self-assembled+structures+for+use+with+a+CMOS+cell-based+biosensor.">Patterned cell adhesion by self-assembled structures for use with a CMOS cell-based biosensor.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (7), 1426-1433 (2007).</li><li>Bacakova, L., Filova, E., Parizek, M., Ruml, T., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cell+adhesion,+proliferation+and+differentiation+on+materials+designed+for+body+implants.">Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants.</a> Biotechnol. Adv. 29 (6), 739-767 (2011).</li><li>Bacakova, L., Svorcik, V., Kimura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell colonization control by physical and chemical modification of materials. In: Cell growth process: new research. , 5-56 (2008).</li><li>Sanjana, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+flexible+ink-jet+printing+method+for+patterning+dissociated+neurons+in+culture.">A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 151-163 (2004).</li><li>Brittain, S., Paul, K., Zhao, X. -. M., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+and+micro-+fabrication.">Soft lithography and micro- fabrication.</a> Phys. World. 11, 31-36 (1998).</li><li>Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurochip:+a+new+multielectrode+device+for+stimulating+and+recording+from+cultured+neurons.">The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 45-56 (1999).</li><li>Martinoia, S., Bove, M., Tedesco, M., Margesin, B., Grattarola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micro-+fluidic+system+for+patterning+populations+of+neurons+on+silicon+micro-+machined+substrates.">A simple micro- fluidic system for patterning populations of neurons on silicon micro- machined substrates.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 35-44 (1999).</li><li>Zeck, G., Fromherz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuroelectronic+interfacing+with+synaptically+connected+snail+neurons+immobilized+on+a+semiconductor+chip.">Noninvasive neuroelectronic interfacing with synaptically connected snail neurons immobilized on a semiconductor chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (18), 10457-10462 (2001).</li><li>Michel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+molecular+assembly+patterning:+a+new+approach+to+micro-+and+nanochemical+patterning+of+surfaces+for+biological+applications.">Selective molecular assembly patterning: a new approach to micro- and nanochemical patterning of surfaces for biological applications.</a> Langmuir. 18 (8), 3281-3287 (2002).</li><li>Rajalingam, B., Selvarasah, S., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+static+and+dynamic+patterned+cocultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils.">Generation of static and dynamic patterned cocultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7, 1272-1279 (2007).</li><li>Wright, D., Rajalingam, B., Karp, J., Selvarah, S., Ling, Y., Yeh, J., Langer, R., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reusable,+reversibly+sealable+parylene+membranes+for+cell+and+protein+patterning.">Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background.">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning.">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C.">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+patterned+adhesion+and+repulsion+of+HEK+293+cells+on+micro-engineered+parylene-C/SiO2+substrates.">Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates.</a> J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).</li><li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C/silicon+dioxide+substrates:+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain.">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Nedsenking av chips i piranha syre tjener ikke bare til å fjerne eventuelle rester av organisk materiale, men også etser de substratoverflater. Dette er nøkkelen til å muliggjør effektiv aktivering med fetal bovine serum. Unnlatelse av å gjøre dette hindrer celle-mønster og dypt endrer celle atferd på brikken. Det er ingen krav til å sterilisere chips etter rengjøring med piraja syre. Faktisk sterilisering etter UV-eksponering har vist seg å svekke celle mønster på en doseavhengig måte 13. Hensyn må tas for å vaske av all gjenværende fotoresist etter fotolitografisk prosessen. Vedvarende fotoresist kan fungere som en uønsket cyto-klebende lag som overstyrer mønster diktert av parylene-C/SiO to geometri. Aceton er effektive ved bruk av den fotolitografiske prosess som er beskrevet ovenfor, og med de angitte reagenser. Imidlertid kan andre typer av fotoresist krever en annen oppløsningsmiddel. For å vurdere effekten og suksess for f.nt fremstillingstrinn, kan kontaktvinkelen av de to kontrast substrater måles. Figur 2 illustrerer de endringer som inntreffer i løpet av brikken aktiveringsprosessen. Det er sannsynlig, men det bestemte lim og frastøtende proteinkomponenter i serum slutt aktivere parylene-mønstrede chip å utøve sine respektive cyto-lim eller cyto-frastøtende egenskaper. Alle representative resultatene brukes chips med en parylene tykkelse på 100 nm, selv om vi har lykkes mønstret med både tykkere og tynnere Parylene lag. Viktigere, tillater denne fotolitografisk etsing teknikken mye større tredimensjonal styring av parylene konfigurasjon enn den som er illustrert her. For eksempel, ved bruk av en kombinasjon av fotomasker, er det mulig å lage Parylene regioner av blandet tykkelse. Dette åpner veien for å skape cellekulturer med definert tredimensjonale topografi, går utover bare dikterer regioner av celle adhesjon / repulSion, potensielt tilby et middel til å integrere microfluidic kanaler inn i konstruksjonen. Som vist, er imidlertid dette mønster plattformen ikke universelt effektive over celletyper. Ulike cellelinjer, med sine varierte celleadhesjonsmolekylet profiler, ikke overrask oppføre seg annerledes når kultivert på denne plattformen. Vi har ennå ikke identifisert de viktigste komponentene i serum, og heller ikke gratis celle-membran reseptorer, som danner grunnlag for denne celle-mønster plattform. Gjør du det i fremtiden lover å utvide sin nytte og spesifisitet. For eksempel kan en &quot;ikke-mønster-cellelinje bli genetisk modifisert for å uttrykke den nødvendige adhesjonsmolekyl, og slik fremme mønster.

Forstå mekanismene som styrer celle adhesjon og mønster på syntetiske materialer er viktig for applikasjoner som tissue engineering, medisiner, og fabrikasjon av biosensorer 1-3. Mange teknikker er tilgjengelige og utvikling, hver tar nytte av de utallige biologiske, kjemiske og fysiske faktorer som påvirker celle adhesjon. Her beskriver vi en celle-mønster teknikk som utnytter prosessene opprinnelig utviklet for mikrofabrikasjonsformål. Som sådan, er plattformen godt plassert for å muliggjøre nedstrøms integrasjon av mikroelektroniske teknologi, for eksempel MEAs, inn i mønster plattformen. Grensesnittet mellom en cellemembran og et tilstøtende materiale som er toveis og kompleks. In vivo, ekstracellulære matriksproteiner gi struktur og styrke og innvirkning på celle atferd via interaksjon med celle adhesjonsreseptorer. Tilsvarende celler i vitro samhandle med syntetiske substrater via absorbert lag av proteiner fire mens fysisk-kjemiske påvirkninger også modulere vedheft. For eksempel kan en polymer overflate gjøres mer &quot;fuktbare&quot; (hydrofile) med ioner eller ultrafiolett lys-bestråling, eller etsing ved behandling med syre eller hydroksyd 5. Etablerte metoder for celle mønster dra nytte av disse og andre celle adhesjon meklere. Eksempler inkluderer inkjet utskrift 6, microcontact stempling 7, fysisk immobilisering 8, MicroFluidics 9, sanntidsmanipulering 10, og selektiv molekylær montering mønster (SMAP) 11. Alle har spesifikke fordeler og begrensninger. En viktig pådriver i arbeidet vårt, derimot, er å integrere celle mønster med mikroelektromekaniske systemer (MEMS). MEMS referere til ekstremt små mekaniske innretninger drevet av elektrisitet. Dette overlapper med nanoskala tilsvarende, nanoelectromechanical systemer. Dette konseptet ble praktisk bare når halvlederstrategier aktivert fabrikasjon å finne sted på mikroskala. Microfabrication teknikker utviklet opprinnelig for halvleder-elektronikk uforvarende blitt funnet nyttig for andre formål som for eksempel celleelektrofysiologi, f.eks. En sentral nedstrøms Målet er å kombinere slike mikroelektroniske teknologi med en high fidelity celle mønster prosessen (danner en BioMEMS enhet). Flere eksisterende og ellers pålitelige og praktiske celle-mønster teknikker er uforenlig med denne ideen. For eksempel er nøyaktig innretting av eventuelle innebygde mikroelektronikk eller biosensorer grunnleggende for deres effekt, men er ekstremt vanskelig å oppnå ved hjelp av en teknikk slik som microcontact stempling. For å omgå dette problemet, jobber vi med en SiO 2-basert mønster plattform som bruker photolithographically trykt parylene-C. Fotolitografi innebærer overføring av geometriske funksjoner fraen maske til et substrat via UV-belysning. En maske er laget ved hjelp av en passende dataassistert design program. Når en glassplate, et tynt lag av ikke-transparent krom representerer den ønskede geometriske mønster (en funksjon oppløsning på 1-2 mm er mulig). Substratet som skal mønstret er belagt med et tynt lag av fotoresist (en UV-følsom polymer). Den belagte polymer blir deretter justert og bringes i nær kontakt med masken. En UV-kilde brukes slik at ubeskyttede områder er bestrålt og derfor blir oppløselige og kan fjernes, i det neste utviklingstrinn, og etterlater en parylene-C representasjon av maskemønsteret bak. Denne prosessen oppsto under utvikling av halvlederkomponenter. Som sådan, er silisiumskiver ofte brukt som et substrat. Fotolitografisk deponering av parylene-C på SiO 2 er dermed en enkel og pålitelig prosess som rutinemessig foregår i mikroelektroniske renrom fasiliteter. Mens parylene harflere ønske bioteknologi egenskaper (kjemisk inert, ikke bio-nedbrytbare), er en faktor som begrenser sin direkte bruk i celle mønster sin medfødt dårlig celle klebrighet, skyldes det delvis sin ekstreme hydrofobitet. Likevel har parylene-C tidligere blitt brukt indirekte for celle mønster, for eksempel som en peel-away cellular mal 12,13. Denne fremgangsmåten er begrenset av dårlig oppløsning og krever flere trinn. Den prosess som er beskrevet her utnytter i stedet en syreetsetrinn, etterfulgt av inkubasjon i serum, for å sikre at parylene-C-regionene blir celle-klebemiddel, gjennom en kombinasjon av reduksjon av hydrofobisitet og serumproteinbinding. Sluttresultatet er en konstruksjon sammensatt av to forskjellige substrater, som, etter å ha biologisk aktivering, manifesterer respektive cyto-klebende eller cyto-frastøtende egenskaper og så representerer et effektivt celle pattering plattform. Viktigere, er det ikke nødvendig å innføre biologiske agents inn i renrommet anlegget som mønstrede underlag kan lagres på ubestemt tid før bruk (hvorpå de er aktivert ved hjelp av kalvefosterserum eller annen aktiveringsoppløsning). Dette parylene-C/SiO to mønster plattformen er derfor en god kandidat for en koalisjon med MEMS-komponenter, som fabrikasjon prosesser så tett speile de som brukes for mikroelektroniske fabrikasjon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Layout editor software package&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:615px;">Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bespoke photo mask</td>
			<td colspan="2">e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com</td>
			<td>Either fabricate in-house of facilities exist or commision</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">3&#34; Silicon wafers</td>
			<td>e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atmospheric horizontal furnace</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>For oxidising silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Small spot spectroscopic reflectometer</td>
			<td>e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>To measure depth of silicon dioxide layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silane adhesion promoter</td>
			<td>e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/</td>
			<td style="width:215px;">1076730050</td>
			<td>Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parylene-C&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010</td>
			<td style="width:572px;">SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/</td>
			<td style="width:215px;">Model PDS2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter</td>
			<td style="width:572px;">e.g. SpiChem, www.2spi.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Automated track system for dispensing photoresist on wafers.</td>
			<td>e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.&#160; Pre-bake oven cures the resist.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Photo-resist: Rohm &#38; Haas</td>
			<td style="width:572px;">Rohm &#38; Haas, www.rohmhaas.com/</td>
			<td style="width:215px;">&#160;SPR350-1.2 positive photo-resist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Phot-mask aligner</td>
			<td>e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microchem MF-26A developer</td>
			<td>Microchem MF-26A developer, www.microchem.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed reogions of photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Plasma etch system</td>
			<td>e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed regions of parylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Wafer dicing saw</td>
			<td>e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/</td>
			<td style="width:215px;">A929-4&#160;</td>
			<td>To wash off residual photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">98% Sulphuric Acid</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">435589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">10437</td>
			<td>Standard chip activation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">14170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell patterning on photolithographically defined 
parylene-c: sio2 substrates

Cell mønster plattformer støtter brede forsknings mål, som for eksempel bygging av forhåndsdefinerte in vitro nevrale nettverk og utforskningen av visse sentrale aspekter av cellulær fysiologi. For enkelt å kombinere celle mønster med Multi-elektrode Arrays (Meås) og silisium-basert &#39;lab on a chip &quot;teknologier, kreves en microfabrication-kompatibel protokoll. Vi beskriver en metode som benytter utfelling av polymeren parylene-C på SiO to skiver. Fotolitografi muliggjør nøyaktig og pålitelig fordelingen av parylene-C ved micron-nivå oppløsning. Påfølgende aktivering ved nedsenkning i føtalt bovint serum (eller en annen spesifikk aktiveringsløsning) resulterer i et substrat hvor dyrkede celler holder seg til, eller blir forhindret av, parylene eller SiO to regioner respektivt. Denne teknikken har tillatt fordelingen av et bredt spekter av celletyper (inkludert primær murine hippocampus celler, HEK 293 cellelinje, menneskelig nevron lignende teratocarcinomacellelinje, primære murine cerebellare granule-celler og primære humane glioma-avledede stamceller lignende celler). Interessant nok er imidlertid plattformen ikke universell; reflekterer betydningen av celle-spesifikke adhesjonsmolekyler. Denne cellen mønster prosessen er kostnadseffektivt, pålitelig, og viktigere kan bli innlemmet i standard microfabrication (chip produksjon) protokoller, som banet veien for integrering av mikroelektroniske teknologi.

Den fotolitografisk prosess med mønster SiO2 med parylene-C er vist i figur 1.. Etter tilberedning aktivering av brikker i føtalt bovint serum muliggjør et stort utvalg av celletyper som skal mønstrede i kultur. Vår gruppe har lykkes mønstret primære murine hippocampus celler 14-16, den HEK 293 cellelinje 17, den menneskelige nervecellen lignende teratocarcinoma (HNT) cellelinje 18, primær murine lillehjernen granule celler, og primære humane glioma-avledet stilk-lignende celler. Figur 3 illustrerer robust fordelingen av HEK 293 celler på en parylene mønster bestående av sirkulære noder med &#39;cross-hair&#39; extensions. Chip aktivering i dette eksempel var med fetal bovine serum. I motsetning til dette viser figur 4 potensiale til å forsterke mønster plattformen ved hjelp av alternative aktiveringsløsninger. Ved hjelp av en løsning av okseserum albumin (3 mg / ml) og<html> fibronektin (1 pg / ml) i HBSS, har den tidligere mønster bud blitt invertert. Fig. 5 illustrerer en annen celletype (en primær human-avledet stem-lignende cellelinje avledet fra et høyverdig glioma). Her, geometrien av det underliggende mønster, påvirker cellers oppførsel, med mønsteret vist i figur 4A fremme cellevekst prosessen langs tynne parylene-C-spor som vist i figurene 4B og 4C. Noen celletyper ikke mønster ved bruk av etablerte føtalt bovint serum aktivering protokoll. Figur 6 illustrerer 3T3-L1 celler som vokser til konfluens uten merkes cyto-frastøtende eller cyto-klebende forskjellen mellom parylene-C-og SiO to regioner. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Flytdiagram som illustrerer prosessen for fremstilling av parylene-C mønstre på SiO2. <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> Figur 2. Flow diagram som illustrerer endringene i kontaktvinkel for mønstrede parylene-C og SiO 2 domener under chip aktiverings trinn. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> Figur 3. Live-cell imaging av HEK 293 celler dyrket på parylene-C/SiO 2 etter tre dager i vitro. Chips inkubert i 3 timer i foster bovinserum etter hvilke celler som varbelagt i suspensjon ved en konsentrasjon på 5 x 10 4 celler / ml. Parylene-C fremmer celle adhesjon mens nakne SiO 2 frastøter celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> Figur 4. Levende celle avbildning av HEK 293-celler dyrket på parylene-C/SiO 2 etter tre dager in vitro Chips aktivert i 3 timer i forskjellige rasjonelt aktiveringsløsninger:. A: føtalt bovint serum, B: vitronectin (1 pg / ml) i HBSS, C: Bovint serum-albumin (3 mg / ml) + vitronectin (1 pg / ml) i HBSS, D: Bovint serum-albumin (3 mg / ml) + fibronectin (156 g / ml) i HBSS. Celler ble plettert i suspensjon med en tetthet på 5 x 10 4 celler / ml. Legg merke til hvordan ulik behandling av chip har resultert i reversering av forrige mønster dogmer, med SiO 2 nå Lim og parylene-C frastøtende. Parylene-C node diameter 250 mikrometer, tilpasset fra Hughes et al. 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> Figur 5. Immunofluorescence bilder av primære humane glioma-avledet stilk-lignende celler dyrket på ulike mønstre av parylene-C på SiO 2 A:. Skjematisk illustrerer retikulære parylene utforming vist i B og C </strong&gt; B:.. Fluorescens micrograph av faste celler (etter 4 dager i vitro) farget for glial fibrillary surt protein (GFAP) C:. Lett micrograph av levende celler på samme chip D: fluorescens bilde illustrerer GFAP-fargede celler på en annen parylene . utforming E:. Refleksjon bilde av noden og snakket parylene utforming avbildes i D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> Figur 6. Live-cell imaging av 3T3 L1 celler dyrket på parylene-C/SiO 2 etter fire dager i vitro. Chips aktivert for 3 timer i foster bovin serum etter wjør celler ble sådd ut i suspensjonen (3 x 10 4 celler / ml). I dette tilfellet, betyr plattformen gjør det mulig ikke mønster, med celler blir like konfluent på parylene-C og SiO 2 regioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates at JoVE.com

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Denne protokollen beskriver en microfabrication-kompatibel metode for celle mønster på SiO 2. En forhåndsdefinert parylene-C design er photolithographically trykt på SiO 2 wafere. Etter inkubasjon med serum (eller annen aktivisering løsning) celler holder seg spesifikt til (og vokse i henhold til konformitet) underliggende parylene-C, mens blir frastøtt av SiO 2 regioner.

Cell Mønster på Photolithographically Definert Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Underlag

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisasjon og Dynamics i Mikroorganismer, bruke Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell Co-kultur Mønster med vandig tofasesystemer

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Ved hjelp av lim Mønstring å konstruere 3D Paper microfluidic enheter

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Subtraktiv Mønstring av levende cellelag med en mikrofluid Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Lys-mediert Dannelse og fordelingen av Hydrogeler for cellekultur Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

En allsidig Måte mønster Proteiner og celler

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mønstre bioaktive proteiner eller peptider på Hydrogel bruker fotokjemi for biologiske programmer

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Evaluering av Keratinocyte spredning på to - og tre - dimensjonale Type I kollagen underlag

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...