Detta arbete stöddes av en Wellcome Trust Klinisk PhD stipendium (ECAT).

1. Tillverkning av Parylene Mönster på SiO 2: Processflöde (se figur 1) <ol><li> Design önskad parylen-C-konfigurationen med en layout editor programpaket, som kan läsa / skriva CIF (Caltech mellanform) eller GDS-II (Graphic databassystem-II)-filer. CIF och GDS-II är branschstandard filformat för integrerad krets konstverk layout. </li><li> Kommissionens fotomask tillverkning till en lämplig mikroelektronik anläggning, eller göra in-house om utrustning finns. </li><li> Oxidera en kiselskiva i en atmosfärisk horisontell ugn (H 2 1,88 SLM och O 2 1,25 SLM) vid 950 ° C under 40 min för att ge en 200 nm SiO 2 skikt (bekräfta tjocklek med en liten fläck spektroskopisk reflektometer). </li><li> Prime den oxiderade wafer med en silanvidhäftningspromotor. Nu deponera parylen-C vid 22 ° C med en hastighet av 1,298 nm / mg dimer med hjälp av en vakuumavsättningssystem särskilt utformade för att deponera parylen. En 100nm tjock parylen-C-beläggning användes för alla exempel som visas nedan. </li><li> Nästa insättning hexametyldisilazan (HMDS) adhesionspromotor på parylen belagda wafer med hjälp av en lämplig fotoresist beläggningssystem. </li><li> Nu snurra skivan vid 4000 rpm under 30 sek samtidigt som man tillämpar positiv fotoresist (vilket resulterar i en teoretisk tjocklek av 1 | im) med användning av samma fotoresist beläggningssystem som ovan. </li><li> Mjuk baka rånet för 60 sek vid 90 ° C. </li><li> Sätt både skivan och förtillverkad fotomask i en mask Aligner. </li><li> Exponera fotoresisten drage wafer med en UV-negativ representation av den önskade parylen-C-konfiguration. </li><li> Bake exponerade wafer för 60 sekunder vid 110 ° C. </li><li> Ta bort all exponerad fotoresist från skivan genom att utveckla i en lämplig utvecklare lösning. </li><li> Etsa bort oskyddade parylen. Använd en syrgasplasma etch-system (vid en 50 mTorr kammartryck, 49 sccm O 2, 100 W RF-effekt på 13,56 MHz, ochen etsningshastighet av 100 nm / min) för att avslöja den underliggande SiO 2. </li><li> Tärna rånet med hjälp av en lämplig tärnings såg (spindelhastighet 30,000 rpm, matningshastighet 7 mm / sek). </li><li> Skölj marker i avjoniserat H2O och blås torrt med kvävgas. </li><li> Förvara chips (på obestämd tid) i dammfria lådor tills de behövs. </li></ol> 2. Chip Rengöring och aktivering: Protokoll <ol><li> Ta bort kvarvarande fotoresist från marker genom att tvätta i aceton i 10 sek. </li><li> Skölj i avjoniserat destillerat H2O 3x. </li><li> Späd färsk Piranha syra (en 05:03-förhållande av 30% väteperoxid och 98% svavelsyra). VARNING: Förbered piraya syra med stor omsorg. Det är ett extremt kraftfullt oxidationsmedel, är starkt surt, och mixning av väteperoxid med svavelsyra är en exotermisk reaktion. Utför detta steg i en syra dragskåp. Låt 2 minuter att passera efter blandning av piraya yran men använd inom 20 min. </li><li> Ren och etch marker genom nedsänkning i piranha syra under 10 min. </li><li> Skölj chips 3x i avjoniserat H2O och överför till en steril odlingsskål. </li><li> Nu aktiverar marker för cell mönstring. Till exempel lägga till två marker per brunn till en 6-brunnar och tillsätt sedan 2 ml fetalt bovint serum för att helt fördjupa alla marker. Utför detta, och alla efterföljande cellodling steg, under sterila förhållanden i ett laminärt flöde vävnadskultur huva. </li><li> Inkubera chips i serum under 3-12 h vid 37 ° C. OBS: Steg 2,4-2,7 bör utföras i följd och utan dröjsmål mellan stegen. Om serum aktivering fördröjs med ≥ 24 timmar efter piraya-behandling, är cell mönstring nedsatt på grund av minskad cell repulsion från SiO 2 regioner. Alternativa aktiveringslösningar innehållande specifika cellvidhäftningsproteiner kan användas i stället för fetalt bovint serum. Sådana lösningar förändra cellvidhäftningsegenskaperna hos de två kontrasterande substrat (se representativa resultat för ett exempel). </li&gt; </ol> 3. Bordläggningen cellinjer On-chip: Protokoll <ol><li> Ta bort spån från deras aktivering lösningen och tvätta en gång i 10 sek i Hanks balanserade saltlösning. </li><li> Placera chip i en odlingsbrunn och plattan vald celltyp som en suspension i sitt vanliga tillväxtmediet. Optimal cell plätering tätheten beror både på celltyp och geometriska mönster av parylen-C on-chip. En densitet av 5 x 10 4 celler / ml är en vettig utgångspunkt. </li><li> Imaging är anpassad till den underliggande motivationen för cell mönstring men levande cell beteende lätt kan bedömas med hjälp av en dissekera mikroskop och en digitalkamera med en lämplig relälins. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Gold+Surface+Approach+for+Fabrication+and+Interrogation+of+Glycoarrays.">A Versatile Gold Surface Approach for Fabrication and Interrogation of Glycoarrays.</a> ChemBioChem. 9, 1568-1575 (2009).</li><li>Michelini, E., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staying+alive:+new+perspectives+on+cell+immobilization+for+biosensing+purposes.">Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes.</a> Anal. Bioanal. Chem. 402 (5), 1785-1797 (2012).</li><li>Franks, W., Tosatti, S., Heer, F., Seif, P., Textor, M., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cell+adhesion+by+self-assembled+structures+for+use+with+a+CMOS+cell-based+biosensor.">Patterned cell adhesion by self-assembled structures for use with a CMOS cell-based biosensor.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (7), 1426-1433 (2007).</li><li>Bacakova, L., Filova, E., Parizek, M., Ruml, T., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cell+adhesion,+proliferation+and+differentiation+on+materials+designed+for+body+implants.">Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants.</a> Biotechnol. Adv. 29 (6), 739-767 (2011).</li><li>Bacakova, L., Svorcik, V., Kimura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell colonization control by physical and chemical modification of materials. In: Cell growth process: new research. , 5-56 (2008).</li><li>Sanjana, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+flexible+ink-jet+printing+method+for+patterning+dissociated+neurons+in+culture.">A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 151-163 (2004).</li><li>Brittain, S., Paul, K., Zhao, X. -. M., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+and+micro-+fabrication.">Soft lithography and micro- fabrication.</a> Phys. World. 11, 31-36 (1998).</li><li>Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurochip:+a+new+multielectrode+device+for+stimulating+and+recording+from+cultured+neurons.">The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 45-56 (1999).</li><li>Martinoia, S., Bove, M., Tedesco, M., Margesin, B., Grattarola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micro-+fluidic+system+for+patterning+populations+of+neurons+on+silicon+micro-+machined+substrates.">A simple micro- fluidic system for patterning populations of neurons on silicon micro- machined substrates.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 35-44 (1999).</li><li>Zeck, G., Fromherz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuroelectronic+interfacing+with+synaptically+connected+snail+neurons+immobilized+on+a+semiconductor+chip.">Noninvasive neuroelectronic interfacing with synaptically connected snail neurons immobilized on a semiconductor chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (18), 10457-10462 (2001).</li><li>Michel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+molecular+assembly+patterning:+a+new+approach+to+micro-+and+nanochemical+patterning+of+surfaces+for+biological+applications.">Selective molecular assembly patterning: a new approach to micro- and nanochemical patterning of surfaces for biological applications.</a> Langmuir. 18 (8), 3281-3287 (2002).</li><li>Rajalingam, B., Selvarasah, S., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+static+and+dynamic+patterned+cocultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils.">Generation of static and dynamic patterned cocultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7, 1272-1279 (2007).</li><li>Wright, D., Rajalingam, B., Karp, J., Selvarah, S., Ling, Y., Yeh, J., Langer, R., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reusable,+reversibly+sealable+parylene+membranes+for+cell+and+protein+patterning.">Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background.">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning.">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C.">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+patterned+adhesion+and+repulsion+of+HEK+293+cells+on+micro-engineered+parylene-C/SiO2+substrates.">Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates.</a> J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).</li><li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C/silicon+dioxide+substrates:+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain.">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li></ol>

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Nedsänkning av flis i Piranha syra tjänar inte bara för att ta bort eventuellt kvarvarande organiskt material utan även etsar substratytorna. Detta är nyckeln till att möjliggöra en effektiv aktivering med fetalt bovint serum. Underlåtenhet att göra detta förhindrar cell-mönstring och djupt förändrar cellens beteende on-chip. Det finns inget krav att sterilisera chips efter rengöring med Piranha syra. Faktum sterilisering med UV-exponering har visat sig underminera cell mönstring på ett dosberoende sätt 13. Man måste vara försiktig för att tvätta bort all resterande fotoresist efter fotolitografiska processen. Bestående fotoresist kan fungera som en oönskad cyto-klisterskikt som åsidosätter mönstring dikterad av parylene-C/SiO 2 geometri. Aceton är effektiv vid användning av fotolitografisk process som beskrivs ovan och med de reagenser anges. Emellertid kan andra typer av fotoresist kräva ett annat lösningsmedel. För att bedöma effekten och framgång different tillverkningssteg, kan kontaktvinkeln för de två kontrasterande substrat skall mätas. Figur 2 åskådliggör de förändringar som inträffar under den spånaktiveringsprocessen. Det är dock troligt att specifika lim och motbjudande proteinkomponenter i serum i slutändan möjliggöra för parylen mönstrade chip för att utöva sina respektive cyto-lim eller cyto-frånstötande egenskaper. Alla representativa resultat som används marker med en parylen tjocklek på 100 nm, även om vi har lyckats mönstrade med både tjockare och tunnare Parylene lager. Viktigt här fotolitografisk etsning teknik gör mycket större tredimensionell kontroll av parylen konfiguration än den som visas här. Till exempel, genom att använda en kombination av fotomasker, är det möjligt att skapa Parylene regioner i blandad tjocklek. Detta öppnar vägen för att skapa cellkulturer med definierad tredimensionell topografi, som går utöver att bara diktera regioner celladhesion / repulsionen, med potentiellt ett sätt att integrera mikrofluidikkanaler in i konstruktionen. Som framgår är dock denna mönstring plattform inte universellt effektiva över celltyper. Olika cellinjer, med sina varierande celladhesionsmolekyl profiler, föga förvånande beter sig annorlunda när de odlas på denna plattform. Vi har ännu inte identifierat de viktigaste komponenterna i serum, eller de gratis cellmembranreceptorer, som ligger till grund för denna cell-mönstring plattform. Om du gör det i framtiden lovar att bredda dess användbarhet och specificitet. Till exempel kan en &quot;icke-mönstring &#39;cellinjen modifieras genetiskt för att uttrycka den nödvändiga vidhäftningsmolekyl och så främja mönstring.

Att förstå mekanismerna som styr cell adhesion och mönstring på syntetiska material är viktigt för applikationer såsom vävnadsteknik, läkemedelsutveckling, och tillverkningen av biosensorer 1-3. Många tekniker är tillgängliga och utvecklas, var och en att dra nytta av de otaliga biologiska, kemiska och fysikaliska faktorer som påverkar cell adhesion. Här beskriver vi en cell-mönstring teknik som använder processer som ursprungligen utvecklats för mikrofabrikationsändamål. Som sådan är den plattform goda förutsättningar att göra det möjligt för nedströms integrera mikroelektronik teknik, såsom MEA, till mönstring plattform. Gränssnittet mellan en cellmembran och en intilliggande material är dubbelriktad och komplex. In vivo, extracellulära matrixproteiner ger struktur och styrka och inverkan på cellens beteende via interaktioner med celladhesionsreceptorer. På samma sätt celler i vITRO interagera med syntetiska substrat via absorberade lager av proteiner 4 medan fysikalisk-kemisk påverkan modulera också vidhäftning. Till exempel kan en polymer yta göras mer &quot;vätbara&quot; (hydrofil) genom joner eller bestrålning med ultraviolett ljus, eller etsning genom behandling med syra eller hydroxid 5. Etablerade metoder för cell mönstring utnyttja dessa och andra cellvidhäftningsförmedlare. Exempel är bläckstråleutskrifter 6, microcontact stämpling 7, fysisk immobilisering 8, mikrofluidik 9, realtid manipulation 10, och selektiv molekylär monterings mönstring (SMAP) 11. Var och en har specifika fördelar och begränsningar. En viktig drivkraft i vårt arbete, dock, är att integrera cell mönstring med mikroelektromekaniska system (MEMS). MEMS hänvisar till extremt små mekaniska anordningar som drivs av el. Detta överlappar med nanonivå motsvarande, nanoelectromechanical system. Konceptet blev praktiskt bara när halvledar strategier aktiverat tillverkning att ske i mikroskala. Mikrotillverkningstekniker utvecklades ursprungligen för halvledarelektronik har av misstag visat sig användbara för andra ändamål såsom cellulär elektrofysiologi, till exempel. En viktig nedströms mål är att kombinera sådana mikroelektroniska teknik med en hifi-cell mönstring process (som bildar en BioMEMS enhet). Flera befintliga och annars pålitliga och praktiska cell-mönstring tekniker är oförenliga med denna idé. Exempelvis är noggrann inriktning av några inbäddade mikroelektronik eller biosensorer grundläggande för deras effektivitet men är ytterst svårt att uppnå med användning av en teknik såsom microcontact stämpling. För att kringgå detta problem, arbetar vi på en SiO 2-baserade mönstrings plattform som använder fotolitografiskt tryckta parylen-C. Fotolitografi innebär överföring av geometriska egenskaper frånen mask på ett substrat via UV-belysning. En mask är konstruerad med hjälp av en lämplig datorstödd design program. Vid en glasplatta, ett tunt lager av icke-transparent krom representerar den önskade geometriska mönster (en funktion upplösning på 1-2 mm är möjligt). Substratet som skall mönstras är belagd med ett tunt skikt av fotoresist (en UV-känslig polymer). Den belagda polymeren inriktas sedan och bringas i nära kontakt med masken. En UV-källa tillämpas så att oskyddade områden bestrålas och därmed blir lösliga och avtagbar i nästa utvecklingssteg, som lämnar en parylen-C-representation av maskmönstret bakom. Denna process har sitt ursprung under utvecklingen av halvledarkomponenter. Som sådana är kiselskivor används ofta som ett substrat. Fotolitografisk deposition av parylen-C på SiO 2 är därför en enkel och tillförlitlig process som rutinmässigt sker i mikroelektroniska renrumsanläggningar. Medan parylen harflera önskvärda bioteknik egenskaper (kemiskt inert, icke biologiskt nedbrytbara), är en faktor som begränsar dess direkt användning i cell mönstring dess medfött dåliga cellvidhäftningsförmåga, delvis tillskrivas dess extrema hydrofobicitet. Icke desto mindre har parylen-C tidigare använts indirekt för cell mönstring, till exempel som en avskalningsbar cellulär mall 12,13. Detta tillvägagångssätt begränsas av dålig upplösning och kräver flera steg. Processen som beskrivs här utnyttjar istället en syraetsning steg, följt av serum inkubation, för att säkerställa att parylen-C-regionerna blir cell-lim, genom en kombination av minskad hydrofobicitet och serumproteinbindning. Slutresultatet är en konstruktion som består av två olika substrat som, efter biologisk aktivering, manifesterar respektive cyto-adhesiva eller cyto-repellerande egenskaper och därför är ett effektivt cell smattrande plattform. Viktigt, det finns inget behov av att införa biologisk agföräldrar i renrumsanläggningen som de mönstrade substrat kan lagras på obestämd tid före användning (varefter de aktiveras med fetalt bovint serum eller annan aktiveringslösning). Denna parylene-C/SiO 2 mönstring plattform är därför en bra kandidat för en koalition med MEMS-komponenter, eftersom de tillverkningsprocesser så nära spegla de som används för mikrotillverkning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Layout editor software package&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:615px;">Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bespoke photo mask</td>
			<td colspan="2">e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com</td>
			<td>Either fabricate in-house of facilities exist or commision</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">3&#34; Silicon wafers</td>
			<td>e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atmospheric horizontal furnace</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>For oxidising silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Small spot spectroscopic reflectometer</td>
			<td>e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>To measure depth of silicon dioxide layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silane adhesion promoter</td>
			<td>e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/</td>
			<td style="width:215px;">1076730050</td>
			<td>Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parylene-C&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010</td>
			<td style="width:572px;">SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/</td>
			<td style="width:215px;">Model PDS2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter</td>
			<td style="width:572px;">e.g. SpiChem, www.2spi.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Automated track system for dispensing photoresist on wafers.</td>
			<td>e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.&#160; Pre-bake oven cures the resist.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Photo-resist: Rohm &#38; Haas</td>
			<td style="width:572px;">Rohm &#38; Haas, www.rohmhaas.com/</td>
			<td style="width:215px;">&#160;SPR350-1.2 positive photo-resist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Phot-mask aligner</td>
			<td>e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microchem MF-26A developer</td>
			<td>Microchem MF-26A developer, www.microchem.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed reogions of photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Plasma etch system</td>
			<td>e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed regions of parylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Wafer dicing saw</td>
			<td>e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/</td>
			<td style="width:215px;">A929-4&#160;</td>
			<td>To wash off residual photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">98% Sulphuric Acid</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">435589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">10437</td>
			<td>Standard chip activation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">14170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell patterning on photolithographically defined 
parylene-c: sio2 substrates

Cell mönstring plattformar stödjer breda mål forskning, till exempel byggandet av fördefinierade in vitro neuronala nätverk och utforskandet av vissa centrala aspekter av cellulär fysiologi. För att enkelt kombinera cell mönstring med multielektrod Arrays (MEA) och kiselbaserade &quot;labb på ett chip&quot;-teknik, är en mikro-kompatibla protokoll krävs. Vi beskriver en metod som utnyttjar avsättningen av polymer parylen-C på SiO 2 wafers. Fotolitografi möjliggör korrekt och tillförlitlig mönstring av parylen-C på micron-nivå upplösning. Efterföljande aktivering genom nedsänkning i fetalt bovint serum (eller en annan specifik aktiveringslösning) resulterar i ett substrat där odlade celler ansluter sig till, eller tillbaka av, parylen eller SiO 2 regioner respektive. Denna teknik har gjort det möjligt mönstring av ett brett spektrum av celltyper (inklusive primära murina hippocampala celler, HEK 293-cellinje, mänsklig neuronliknande teratokarcinomcellercellinje, primära murina cerebellär granulat celler, och primära humana gliom-härledde stem-liknande celler). Intressant är dock att plattformen inte är universell, vilket visar vikten av cellspecifika adhesionsmolekyler. Denna cell mönstring process är kostnadseffektivt, tillförlitligt och viktigast kan införlivas i standardmikrofabrikation (chip tillverkning) protokoll, som banar väg för integration av mikroteknik.

Den fotolitografisk process för mönstring av SiO 2 med parylen-C illustreras i Figur 1. Efter beredning aktivering av chips i fetalt bovinserum möjliggör ett brett spektrum av celltyper som skall mönstras i kultur. Vår grupp har framgångsrikt mönstrade primära murina hippocampus celler 14-16, HEK 293 cellinje 17, den mänskliga neuronliknande teratokarcinom (hNT) cellinje 18 primära murina cerebellär granulat celler, och primära humana gliom-härledde stem-liknande celler. Figur 3 illustrerar robust mönstring av HEK 293 celler på en parylen mönster bestående av cirkulära noder med &quot;cross-hår-extensions. Chip-aktivering i detta exempel var med fetalt bovint serum. Däremot illustrerar figur 4 potential att öka den mönstring plattform med hjälp av alternativa aktiveringslösningar. Med användning av en lösning av bovint serumalbumin (3 mg / ml) och<html> fibronektin (1 | ig / ml) i HBSS, har den tidigare mönstring precepten vänts. Figur 5 illustrerar en annan cell-typ (en primär stam-liknande cellinje från människa härledd härledd från en höggradigt gliom). Här, geometrin hos det underliggande mönstereffekter cellbeteende, med det mönster som visas i figur 4A främja cellprocess tillväxt längs tunn parylen-C-spår såsom visas i figurerna 4B och 4C. Vissa celltyper inte mönster vid användning av etablerade fetalbovinserum aktiveringsprotokoll. Figur 6 illustrerar 3T3 L1 celler som växer till sammanflytning med någon urskiljbar cyto-frånstötande eller cyto-klister skillnaden mellan parylen-C och SiO 2-regioner. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Flödesschema som illustrerar förfarandet för tillverkning av parylen-C-mönster på SiO 2. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> Figur 2. Flödesdiagram som illustrerar förändringar i kontaktvinkel för mönstrade parylen-C och SiO 2 domäner under chipaktiveringssteg. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> Figur 3. Levande cell imaging av HEK 293-celler odlade på parylene-C/SiO 2 efter tre dagar in vitro. Chips inkuberades under 3 h i fetalt bovinserum varefter cellerna varpläterade i suspension vid en koncentration av 5 x 10 4 celler / ml. Parylen-C främjar celladhesion medan bare SiO 2 stöter bort celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> Figur 4. Levande cell imaging av HEK 293-celler odlades på parylene-C/SiO 2 efter tre dagar in vitro Chips aktiverade under 3 timmar i olika rationellare aktiveringslösningar:. A: fetalt bovint serum, B: vitronektin (1 pg / ml) i HBSS, C: Bovint serumalbumin (3 mg / ml) + vitronektin (1 pg / ml) i HBSS, D: Bovint serumalbumin (3 mg / ml) + fibronektin (en56, g / ml) i HBSS. Celler pläterade var i suspension vid en densitet av 5 x 10 4 celler / ml. Notera hur olika behandling av chip har resulterat i återföring av föregående mönstring dogm, med SiO 2 nu fix och parylen-C motbjudande. Parylen-C-nod diameter 250 um, anpassat från Hughes et al. 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> Figur 5. Immun bilder av primära humana gliom-härledde stem-liknande celler odlas på olika mönster av parylen-C på SiO 2 A:. Schema illustrerar retikulära parylen utformning som visas i B och C </strong&gt; S:.. Fluorescensmikrofoto av fixerade celler (efter 4 dagar in vitro) färgades för gliafibrillärt surt protein (GFAP) C:. Ijusmikrofoto av levande celler på samma chip D: Fluorescens bild illustrerande GFAP-färgade celler på en annan parylen . konstruktion E:. Reflectance bild av noden och talade parylene konstruktion avbildas i D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> Figur 6. Levande cell imaging av 3T3 L1 celler odlade på parylene-C/SiO 2 efter fyra dagar in vitro. Chips aktiveras under 3 timmar i fetalt bovint serum efter which celler ströks i suspension (3 x 10 4 celler / ml). I detta fall vill plattformen inte möjligt för mönstring, med celler blir lika sammanflytande på parylen-C och SiO 2-regioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates at JoVE.com

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Detta protokoll beskriver en mikro-kompatibel metod för cell mönstring på SiO 2. En fördefinierad parylen-C design fotolitografiskt tryckt på SiO 2 wafers. Efter inkubation med serum (eller annan aktiveringslösning) celler hålla sig specifikt till (och växa beroende på överensstämmelse) underliggande parylen-C, samtidigt som tillbaka av SiO 2-regioner.

Cell Mönstring på fotolitografiskt Defined Parylen-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrat

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Litografi Surface Mönstring för att skapa Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Att skapa två-dimensionell Mönstrad substrat för Protein och Cell inneslutning

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisation och Dynamics i mikroorganismer, med total inre Mikroskopi fluorescens

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell Co-kultur mönstring med användning av vattenhaltiga tvåfassystem

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Använda Lim Mönstring att konstruera 3D Paper Mikrofluidikanordningar

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Snabb Subtraktiv Mönstring av levande cellskikt med en mikroflödessystem Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Ljus medierad Bildning och mönstring av Hydrogeler för cellodling Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

En mångsidig metod för mönstring proteiner och celler

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mönstring bioaktiva proteiner eller peptider på Hydrogel med fotokemi för biologiska tillämpningar

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Utvärdering av keratinocyter spridning på två - och tredimensionella typ I kollagen substrat

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...