Name: mouse genome engineering using designer nucleases
Uploaded: 2014-04-02T15:45:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, og Ewa Skoczylas for utmerket teknisk assistanse. Denne studien ble finansiert av SNF Sinergia stipend CRSI33-125073 til PP.

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).</li><li>Johansson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+zoo+of+mice+for+genetic+analyses:+a+comprehensive+protocol+for+the+rapid+generation+of+BAC+transgenic+mice.">Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice.</a> Genesis. 48, 264-280 (2010).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li><li>Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases.">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+integration+in+rat+and+mouse+embryos+with+zinc-finger+nucleases.">Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).</li><li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting.">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li><li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+production+of+mouse+disease+models+by+embryo+microinjection+of+TALENs+and+oligodeoxynucleotides.">Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases.">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).</li><li>ZFN, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li><li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).</li><li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting.">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39, (2011).</li><li>Reyon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLASH+assembly+of+TALENs+for+high-throughput+genome+editing.">FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering.">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+library+of+TAL+effector+nucleases+spanning+the+human+genome.">A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.</a> Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).</li><li>Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ligation-independent+cloning+technique+for+high-throughput+assembly+of+transcription+activator-like+effector+genes.">A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes.</a> Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells.">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).</li><li>Hermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+OPEN+zinc+finger+nucleases+for+direct+gene+targeting+of+the+ROSA26+locus+in+mouse+embryos.">Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+disease+mutations+by+gene+targeting+in+one-cell+mouse+embryos.">Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).</li><li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+(TALE-NT)+2.0:+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction.">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li><li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing.">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).</li><li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases.">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li><li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+zinc-finger-nuclease+activity+with+improved+obligate+heterodimeric+architectures.">Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures.</a> Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).</li><li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Mouse Biology. , (2011).</li><li>Wefers, B., Wurst, W., K&#252;hn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Mouse Biology. , (2011).</li><li>Haueter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+vasectomy-overexpression+of+Prm1-EGFP+fusion+protein+in+elongating+spermatids+causes+dominant+male+sterility+in+mice.">Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice.</a> Genesis. 48, 151-160 (2010).</li><li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+to+the+ROSA26+locus+directed+by+engineered+zinc+finger+nucleases.">Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).</li><li>Bultmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+transcriptional+activation+of+silent+oct4+pluripotency+gene+by+combining+designer+TALEs+and+inhibition+of+epigenetic+modifiers.">Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).</li><li>Valton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+TALE+DNA+binding+domain+sensitivity+to+cytosine+methylation.">Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation.</a> J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).</li><li>Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN-Site+searches+genomes+for+zinc+finger+nuclease+target+sites+and+off-target+sites.">ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites.</a> BMC Bioinform. 12, (2011).</li><li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+(TALE-NT)+2.0:+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction.">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li><li>Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+ten+inbred+mouse+strains+following+assisted+reproductive+technologies+(ARTs).">Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs).</a> Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).</li><li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulation+strategies+for+6+commonly+used+mouse+strains.">Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains.</a> J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual. , (2011).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-Guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Designer nukleasefritt drevet genom redigering tilnærminger har betydelig utvidet spekter av arter mottakelig for målrettede endringer for sine respektive genomer 10,12. Hos mus, har genet målretting i ES-celler vært en standard teknikk i over to tiår; har det imidlertid vist seg vanskelig å tilpasse seg ES celler fra andre enn musen arter, selv om det har vært noen nylige suksess i rotte ES-celler. Selv med tilgjengeligheten av &quot;off-the-sokkel&quot; gen-målrettet mus ES cell kloner levert av konsortier som EUCOMM, KOMP, eller NorCOMM tre genomet redigering av ZFN og TALEN gir høyere presisjon og fleksibilitet med hensyn til spekteret av endringer som kan være innføres i musegenomet. Grunnlegger dyr som bærer nukleasefritt mediert mutasjoner synes å være svært bakterie-linjen kompetent 4-6,20,21, noe som ikke alltid er tilfelle for chimeras stammer fra blastocyst injeksjoner av ES-celler. Derfor, i visse tilfeller mikroinjeksjon av designer nukleaser kan resultere i betydelig raskere generasjon av nye mus linjer med målrettede genom modifikasjoner. Den vellykkede generasjonen av knockout mus ved injeksjon av ZFN og TALEN avhenger i stor grad på aktiviteten av den injiserte nuclease pair. Talens har vist seg å ha en høy suksessrate på målrettet mot et bredt spekter av gener i en rekke organismer; men nylige studier antyder at TALEN binding er følsom for cytosin metylering 30,31. således nylig genererte nuklease par, for eksempel Talens klonet inn pCAG-T7 vektorer, kan bli transfektert inn i en forbigående musecellelinje slik som NIH-3T3 eller Neuro -2a, som etterligner kromatin tilstanden i mus embryo i en viss grad. Her kan nukleaseaktivitet beregnes ved hjelp av T7 endonuclease analysen eller en begrensning sammendrag av PCR produktet som beskrevet i kapittel 5 før mRNA syntese og mikroinjeksjon. Vi anbefaler sekvensering av genomet regionen av interesse i respektive cellelinje og musen stamme brukt for mikroinjeksjon eksperimenter. I muse zygotes, vil ulike Talen eller ZFN parene fungere optimalt på forskjellige mRNA konsentrasjoner og dermed den optimale arbeids konsentrasjonen av microinjected nuclease mRNA kan måtte bestemmes eksperimentelt. Avhengig av nuklease-par, vil en for lav konsentrasjon resulterer i ingen spaltning, mens for høyt kan resultere i embryoletalitet. Avhengig av nuklease paret, vi har hatt suksess ved hjelp totale mRNA-konsentrasjoner så lave som 2 ng / mL, og så høy som 200 ug / ul. Disse effekter er vanskelige å forutsi fra eksperimenter i cellekultur, og den nuklease konsentrasjon optimal for begge embryo overlevelse og modifisering hastighet av målet locus må bestemmes empirisk. Meget aktiv ZFN eller TALEN kan holde seg sine mål sekvens utover ett-celle stadium av microinjected embryo og dermed føre til komplekse mønstre av mutagenesis end mosaicism i grunnleggere. Vi og andre 4 har observert tre eller flere distinkte muterte alleler i en enkelt grunnlegger (figur 5C). Således, ved etablering av en ny mus linje fra disse erne, avkom bør nøye vist ved sekvensering for nærvær av den gunstige mutasjon siden fordøyelse assays gi bevis på at bare en udefinert mutasjon er tilstede. En av kritikk ofte uttrykt mot ZFN og Talen systemer er muligheten for at disse nukleaser er også i stand til å spalte sekvenser tilstede et annet sted i genomet som er lik mål-områder. Slike off-target effekter har blitt observert med tidlig generasjon reagenser bruker homodimeric FoKI domene, og heterodimer konstruerer ble utformet for å lindre off-target effekter 25. Potensielle off-målnettsteder kan bli spådd til en viss grad i silico 32,33 og skjermet av PCR og sekvensering. En åpenbar fordel of ved hjelp av ZFNs og Talens for generering av musene i stedet for cellelinjer er muligheten for fjerning av target mutasjoner ukoblet til ønsket genomet modifikasjon ved å utføre flere backcrosses til en vill-type stamme av valget. For analyse av et stort antall stifter mus, neste generasjons dyp sekvensering av PCR-produkter generert fra nuklease-målrettede locus og in silico predikerte off-target loci kan tilby en alternativ kvalitativ og kvantitativ avlesning til råtneanalyser av PCR-produkter. De assistert befruktning som er beskrevet i denne protokollen er optimalisert for standard musestammer som brukes til mikroinjeksjon eksperimenter som C57BL/6J eller B6D2F1. Mus av forskjellig opprinnelse, slik som utav belastninger, kan i prinsippet benyttes til genom redigering metoder, og kan tilveiebringe en mer egnet genetisk bakgrunn for spesielle problemstillinger. Ytelsen til assistert reproduksjon som for eksempel superovulering kan være predicted for en rekke stammer 34-36, men kan kreve ytterligere optimalisering for ikke-standardiserte stammer for å få et tilstrekkelig antall embryoer for nuclease mikroinjeksjon. Foruten ZFN og TALEN, har nye designer nukleaser som RNA-guidet CRISPR/Cas9 system 9,37,38 nå blitt introdusert for genom redigeringsprogrammer. Alle metoder for mikroinjeksjon og analyse av grunnlegger dyr som er beskrevet her er også gjeldende for CRISPR/Cas9 og fremtidige moduser av genomet redigering.

Mus er langt den mest populære plattformen for generering av transgene dyremodeller. Den allsidige verktøykasse for genteknologi av musen embryo 1-3 har nylig blitt utvidet ved genom redigering tilnærminger basert på designer nukleaser som sink finger nukleaser (ZFN) 4-6, transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talen) 7,8, og gruppert regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CRISPR-forbundet (Cas) 9 system ni. ZFN og TALEN funksjon som par med to spesialdesignede protein-baserte DNA-bindende domener (arrays av sink finger proteiner og gjenta-variabel di-rester (rvds), henholdsvis) som hver er koblet til Foki endonuclease 10-12. Omvendt, er det spesielle ved Cas9-mediert DNA-spalting leveres av transactivating CRISPR RNA (crRNA og tracrRNA, som også kan bli kombinert i en enkelt chimerisk RNA molekyl betegnet guide RNA) 11 som opptrer i et kompleks med denCRISPR protein. Talens med en definert sekvens av rvds kan raskt konstruert av individuelle forskere med et mangfold av monterings strategier for å velge 13-17. CRISPR/Cas9 lover enda mindre arbeidskrevende generasjon av designer nukleaser, men spesifisiteten av guiden RNA-DNA-binding er fortsatt ikke helt løst 18,19. Generering av tilpassede ZFNs har så langt vært begrenset til spesialiserte akademiske laboratorier og til kommersielle leverandører som Sangamo biovitenskap og Sigma CompoZr tjenesten. Generelt genom redigering med designer nukleaser tar sikte på å innføre doble trådbrudd (DSB) på definerte genomisk loci, som senere tiltrekke ikkehomologe ende bli (NHEJ) eller homolog rekombinasjon (HR) DNA-reparasjons machineries 10,12. NHEJ-mediert reparasjon av et DSB ofte resulterer i innføring av innsettinger og delesjoner i nær tilknytning til området for reparasjon. Dermed NHEJ reparasjon cen utnyttes for å slå ut funksjonen av et mål-genet ved å innføre en ramme-skiftmutasjon innenfor genene protein-kodende sekvens 4,7,9. Alternativt kan defineres tillegg eller utskifting av genetisk informasjon kan oppnås ved å gi en DNA-donor sammen med designer nukleaser. En DNA-donor består etterforsker-designet DNA-sekvenser flankert av regioner av homologi med målet locus, og dermed tjene som en mal for DSB reparasjon av HR. Begge plasmidene 5,6,20 og single-strandet oligonukleotider 8,9,21 har blitt brukt som donorer. Hverken NHEJ-nor HR-mediert genom redigering krever innføring av en selekterbar markør inn i genomet av mus embryo, noe som gjør disse strategiene spesielt godt egnet for å lage små endringer i nukleotidsekvensen uten å forstyrre den totale genetiske arkitektur. I denne protokollen beskriver vi alle nødvendige prosedyrer for genom redigering imus embryo ved hjelp Talens. Disse omfatter 1) identifikasjon av en TALEN målområde 22, 2) konstruksjon av Talens med Golden Gate klon 13, 3) in vitro syntese av TALEN mRNA, 4) mikroinjeksjon av TALEN mRNA inn i befruktede oocytter mus, 5) kirurgiske prosedyrer for embryo og 6) analyse av TALEN-indusert mutagenese in stifter dyr. Vi fokuserer på TALEN mRNA mikroinjeksjon og screening av grunnleggerne for NHEJ-indusert innsett / slettinger. For dette formål har vi generert bifunksjonelle Talen konstruksjoner som tillater både ekspresjon i pattedyrceller når transfektert som plasmider og in vitro syntese av TALEN mRNA for mikroinjeksjon i mus embryo. Disse konstruksjoner omfatter en avkortet TALE ryggrad 23 smeltet til heterodimert foki domener 24,25 for optimal genomet redigering i pattedyrceller. Denne protokollen kan også tas i bruk for mikroinjeksjon av andre designer nukleaser eller for kombinerte injeksjoner av designer nukleaserog donor-konstruksjoner (utforming av DNA-givere er blitt beskrevet i gode tekniske publikasjoner fra Wefers et al. 26,27). Etisk Erklæring Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med de retningslinjer og regler i Cantonal Veterinary Office of Canton Zürich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="524">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">BsaI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0535S or L</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Esp3I</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0451</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">T4 Ligase</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S or L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Spectinomycin</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0692-1ML</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">X-Gal</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B4252</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">IPTG</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Plasmid-Safe nuclease</td>
			<td style="width:111px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">E3101K</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27106</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">QIAGEN Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12143</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM1345</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">NucAway Spin Columns</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM10070</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">RNaseZAP</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R2020-250ML</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">NorthernMax Formaldyde Load Dye</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM8552</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">RNA Millennium Markers</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM7150</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">10x TBE buffer</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B52</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">T7 endonuclease</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302S or L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">pGEM-T EasyVector System I</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A3600</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S-7563</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">pregnant mare&#39;s serum gonadotrophin (PMSG)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G4877</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">human chorionic gonadotropin (hCG)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">M2 embryo culture medium</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7167</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">M16 embryo culture medium</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7292</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Mineral oil, embryo tested</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Ketamine</td>
			<td style="width:111px;">CentraVet</td>
			<td style="width:119px;">Ket 201</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Xylazine</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">46995</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Equipment/Tools</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200)</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF)</td>
			<td style="width:111px;">&#160;Narishige</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Embryo holding capillaries</td>
			<td style="width:111px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:119px;">B100-75-10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Embryo injection capillaries</td>
			<td style="width:111px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">GD-1</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Capillary puller (for example Sutter P97)</td>
			<td style="width:111px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Microforge (for example Narishige MF-900)</td>
			<td style="width:111px;">Narishige&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Walton skin scissors</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">14077-10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">14041-10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Surgical probe</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">10140-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Reflex wound clip system (9mm)</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">12031-09</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Reflex wound clips (9mm)</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">12032-09</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Dumont fine forceps 5</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Moria curvrd forceps</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11370-31</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Moria fine forceps</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11399-80</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Dietrich bulldog clamp</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">18038-45</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animals</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:111px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;">strain code 000664</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">CD-1 mice</td>
			<td style="width:111px;">Charles river</td>
			<td style="width:119px;">strain code 000664</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse genome engineering using designer nucleases

Transgene mus som bærer stedsspesifikke genom modifikasjoner (knockout, knock-in) er av avgjørende betydning for å dissekere komplekse biologiske systemer, så vel som for å modellere menneskelige sykdommer og teste terapeutiske strategier. Nylige fremskritt i bruk av designer nukleaser som sink finger nukleaser (ZFNs), transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens), og de gruppert regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CRISPR-forbundet (Cas) 9 system for område- spesifikke genom ingeniør åpne muligheten til å utføre raske målrettede genomet modifisering i praktisk talt alle laboratorie arter uten å måtte stole på embryonale stamceller (ES) celleteknologi. Et genom redigering eksperiment starter vanligvis med identifisering av designer nuklease målnettsteder innenfor et gen av interesse etterfulgt av bygging av tilpassede DNA-bindende domener til direkte nukleaseaktivitet til etterforsker definerte genomisk locus. Designer nuklease plasmider er in vitro &lt;/ Em&gt; transkribert for å generere mRNA for mikroinjeksjon av befruktede mus eggceller. Her gir vi en protokoll for å oppnå målrettet genomet modifisering ved direkte injeksjon av TALEN mRNA inn befruktede mus eggceller.

Vi konstruerte plasmidene destinasjon kompatible med Golden GateTALEN montering publisert av Cermak et al. 13. som tillater ekspresjon av Talens i pattedyrceller, så vel som in vitro mRNA syntese fra fagen T7-promoteren (figur 1C). Disse plasmider bære heterodimere FoKI domener (ELD eller KKR mutasjoner) som har vist seg å redusere off-target effekter i forhold til Foki homodimers og å forbedre cleavage aktivitet i forhold til første generasjon Foki heterodimerer 25,29. Golden gate montering reaksjoner # 1 og # 2 er vanligvis svært effektiv og hver hvit koloni, når analysert av koloni PCR, viser forventede mønsteret for den aktuelle antall rvds klonet (Tall 1B og 1D). Gel analyse av in vitro syntetisert mRNA (figur 2) bringer med seg et enkelt skilles bånd med liten eller ingen smear for hver analyserte prøve. Det bør være et klart størrelse skift mellom prøvene L1/R1 og L2/R2, L3/R3, noe som indikerer vellykket polyadenylering. Stifter-dyr kan bli screenet for NHEJ-induserte muterte alleler ved hjelp genotyping PCR fulgt av enten T7 endonukleasefordøyelse (figur 3) eller en restriksjon digest ved hjelp av et enzym som spalter villtypesekvensen innenfor den spacer regionen av nuklease abel (figur 4). Den T7-endonuklease-analysen kan anvendes på en hvilken som helst form for mutasjon uten hensyn til den bestemte genomiske sekvens innenfor avstands regionen av nuklease paret injisert; men oppdager det bare uoverensstemmelser mellom DNA-trådene i heterodupleks PCR-produkter. Derfor, i sjeldne tilfelle at en gründer bærer to identisk muterte alleler, PCR produktene ville ikke vise noen T7 fordøyelsen mønster. En slik forskjell er imidlertid alltid mulig når et bestemt restriksjonssete er plassert inne i nuklease spacer regionen som skal bli eliminert ved NHEJ-Indusert innsett / slettinger (figur 5). Her ufordøyde band indikere nærværet av mutasjoner, og fraværet av eventuelle fordøyd produkt tyder sterkt på en legger bærer mutasjoner i begge alleler av målrettet genet (merket med stjerner i Figur 4b). <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> Figur 1. Golden Gate kloning av Talen rvds inn heterodimere pCAG-T7-Destination vektorer. A) Montering av RVD arrays i pFUS vektorer. Her et eksempel er vist for en TALEN par med individuelle fortelling arrays bestående 15 rvds og 17 rvds, henholdsvis (for Tale arrays lenger enn 21 rvds, er tre pFUS-rvds forsamlinger som kreves, ikke vist). Pilene angir primere for pFUS spesifikke koloni PCR reaksjoner. B) PCR-produkteramplifisert fra korrekte pFUS monte vanligvis viser et bånd tilsvarende den kombinerte lengde av rvds klonet (f.eks rundt 1,1 kb til 10 rvds) og en &quot;stige&quot; med mindre mindre fremtredende bånd på grunn av repeterende natur RVD matriser. C) Ferdig sammensetning av pFUS-RVD arrays og et plasmid som inneholder den siste gjentakelse (PLR) inn heterodimere Talen ekspresjonsvektorene med FokIELD og FokIKKR varianter, henholdsvis. Den TALEN ryggrad (kommentert som N-og C) ligner den arkitekturen publisert av Miller et al. 23. Den CAG (CMV-tidlig forsterkerelement / kylling beta-aktin) promoter sikrer høye ekspresjonsnivåer i transfekterte pattedyrceller, mens T7 phage-promoteren tillater in vitro-mRNA-syntese (bruke Saci for linearisering av vektoren nedstrøms for nuklease stoppkodonet). D) Colony PCR ved bruk av primere som er markert med piler i C) gjør det mulig å identifisere korrekt montert Talens. Full-Length PCR produktene er ofte mindre fremtredende mens &quot;ladder effekten&quot; representerer en robust indikator på vellykket montering. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <img alt="Fig. 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> Figur 2. . Kvalitetskontroll av nuklease mRNA in vitro-syntese ved hjelp av agarosegel-elektroforese ZFN mRNA er vist som et eksempel (L, venstre ZFN, R, rett ZFN). Prøver L1/R1 vise mRNA før polyadenylering, prøver L2/R2 showet polyadenylated mRNA og L3/R3 vise renset polyadenylert mRNA. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <img<html> alt = &quot;Figur 3&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figur 3. Eksempel på en T7-endonuklease-analyse anvendes for identifisering av stifter dyr som bærer nuklease-induserte mutasjoner av målet locus. A) En TALEN pair er designet for å holde seg innenfor den kodende regionen muse prion protein genet (Prnp, kan TALEN target-sekvensen gis på forespørsel). Et PCR-produkt blir generert ved hjelp av en fremre primer (F) som ligger 110 bp oppstrøms og en revers primer (R) 250 bp nedstrøms for TALEN spaltningssete. B) PCR-produktet ble deretter underkastet heterodupleks-dannelsen og T7 endonukleasefordøyelse. C) TALEN-indusert mutagenese innenfor målrettet genomisk regionen i enkelt gründerne er avslørt av tilstedeværelsen av en full-lengde PCR produkt med fordøyelsen produkter av 250 og 110 bps.50930/50930fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klikk her for å se større bilde. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> Figur 4. Eksempel på en begrensning sammendrag av PCR-produkter som brukes til identifisering av grunnleggeren dyr som bærer nukleasefritt indusert mutasjoner av målet locus. ZFN spesifikke for musen Rosa26 locus 29 mål en XbaI begrensning nettsted innen intron 1. A) Grunnleggerne ble skjermet av genotype PCR hjelp en forward primer (F) ligger 500 bp oppstrøms og en omvendt primer (R) 250 bp nedstrøms spaltningssetet. B) Fordøyelse av PCR-produkter med Xbal avslører fordøyelsen mønstre indikerer mus med bi-allele mutasjoner (markert med stjerne), mono -allele mutasjoner (fordøyd og ufordøyd band, for eksempel dyr 2)og vekt mus (komplett fordøyelsen, f.eks dyr 21). C) Sekvensering av mus med potensielle bi-allelisk modifikasjoner viser opptil 3 (animalsk 24) distinkte innsett / slettinger. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Navn på Primer </td><td> Sekvens 5 &#39;til 3&#39; </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-en </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Sekvenser med primere som brukes for koloni PCRs og sekvensering innenfor Golden Gate TALEN monteringprotokoll. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Plasmid / Collection </td><td> Senior </td><td> Addgene ID </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Golden Gate TALEN og TAL Effector Kit 2,0 </td><td> Voytas lab </td><td> 1000000024 </td><td> Inneholder alle plasmider nødvendige for Golden Gate TALEN montering </td></tr><tr><td> pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD destinasjon vektorer </td><td> Pelczar lab </td><td> 40131, 40132 </td><td> Add-on plasmider for TALEN ekspresjon i mammalske celler, og in vitro-mRNA-syntese </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Plasmider og plasmid samlinger som kreves for Golden Gate TALEN montering kan fås fra Addgene ( <a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a> ). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> OnlineRessurs </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> Design av TALEN; TALEN off-target prediksjon </td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> Design av TALEN, OPEN ZFN, CODA ZFN, CRISPR/Cas9 </td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> Design av TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 off-target prediksjon </td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> Montering av TALEN sekvenser for bekreftelse av sekvense resultater </td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td> Design av modulær montering ZFN </td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td> Design av modulær montering ZFN </td></tr></tbody></table> Tabell 3. Online ressurser for å utforme ZFN, TALEN, og CRISPR/Cas9. </strong&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases at JoVE.com

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Designer nukleaser som sink finger nukleaser (ZFNs) og transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens) kan brukes til å endre genomet muse preimplantation embryoer ved å utløse både ikkehomologe ende bli (NHEJ) og homolog rekombinasjon (HR) trasé. Disse fremskrittene muliggjøre rask generasjon av mus med presise genetiske modifikasjoner.

Mouse Genome Engineering Bruke Designer nukleaser

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Genome-wide Screen for miRNA Targets Bruke MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Genome Redigerer med CompoZr Custom sink finger nukleaser (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon Mus Utledet fra Utførte pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling av Morbid Human Genome hjelp Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...