Name: improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier
Uploaded: 2013-11-12T18:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier at JoVE.com

Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus dem National Health and Medical Research Council of Australia (Zuschuss # 606658) an RLM ausgezeichnet finanziert.

1. Cell Culture (3-7 Tage vor BBB Versammlung) 1.1. Primary Human Brain mikrovaskulären Endothelzellen (BEK) BECs wurden im Handel erhalten. Die Zellen wurden durch Dispase Dissoziation von normalen menschlichen Hirnrinde Gewebe hergestellt und bereitgestellt bei Passage 3 (&lt;12 Populationsverdopplungen) eingefroren. <ol><li> Substrat: Mantel Gewebekulturgefäße mit &quot;Anhang Factor&quot; nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Zellenpf...

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	<li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier/neurovascular+unit+in+health+and+disease.">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders.">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.</a> Neuron. 57, 178-201 (2008).</li><li>Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+plasminogen+activator+on+the+neurovascular+unit:+from+clinical+data+to+experimental+evidence.">Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).</li><li>Stewart, P. A., Wiley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+nervous+tissue+induces+formation+of+blood-brain+barrier+characteristics+in+invading+endothelial+cells:+a+study+using+quail--chick+transplantation+chimeras.">Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras.</a> Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).</li><li>Janzer, R. C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+induce+blood-brain+barrier+properties+in+endothelial+cells.">Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells.</a> Nature. 325, 253-257 (1987).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li><li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease.">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).</li><li>Girouard, H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+coupling+in+the+normal+brain+and+in+hypertension,+stroke,+and+Alzheimer+disease.">Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease.</a> J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).</li><li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+physiology,+pathology,+and+pharmacology.">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).</li><li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(muBBB).">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB).</a> Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).</li><li>Gaillard, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+functional+characterization+of+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier,+comprising+a+co-culture+of+brain+capillary+endothelial+cells+and+astrocytes.">Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes.</a> Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).</li><li>Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+astrocytes+induce+the+expression+of+blood-brain+barrier+specific+proteins+by+autologous+endothelial+cells.">Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells.</a> Brain Res. 625, 238-243 (1993).</li><li>Demeuse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+coculture+of+rat+brain+endothelial+cells+and+astrocytes:+a+syngenic+model+to+study+the+blood-brain+barrier.">Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier.</a> J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).</li><li>Coisne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+syngenic+in+vitro+blood-brain+barrier+model:+a+new+tool+to+examine+inflammatory+events+in+cerebral+endothelium.">Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium.</a> Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).</li><li>Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+gap+between+the+in+vivo+and+in+vitro+blood-brain+barrier+tightness.">Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness.</a> Brain Res. 1284, 12-21 (2009).</li><li>Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+blood-brain+barrier+by+glucocorticoids+and+the+cells+of+the+neurovascular+unit.">Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).</li><li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling:+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies.">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+endothelial+and+astrocyte+cocultures:+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+drug+delivery+studies.">Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).</li><li>Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+In+Vitro+Models+of+Ischaemic+Stroke:+a+Test+Bed+for+Translation.">Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation.</a> Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).</li><li>Major, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+line+of+human+fetal+glial+cells+that+supports+JC+virus+multiplication.">Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).</li><li>Eugenin, E. A., Berman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-dependent+mechanisms+of+leukocyte+trafficking+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier.">Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier.</a> Methods. 29, 351-361 (2003).</li><li>Dehouck, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transfer+across+the+blood-brain+barrier:+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+models.">Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models.</a> J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).</li><li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li><li>Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin-induced+activation+of+astrocytes+in+mixed+rat+hippocampal+cultures+is+inhibited+by+soluble+thrombomodulin.">Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin.</a> Brain Res. 1381, 38-51 (2011).</li><li>Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endothelial+and+astrocyte+co-culture+model+of+the+blood-brain+barrier+utilizing+an+ultra-thin,+nanofabricated+silicon+nitride+membrane.">An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane.</a> Lab Chip. 5, 74-85 (2005).</li><li>Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=t-PA-specific+modulation+of+a+human+BBB+model+involves+plasmin-mediated+activation+of+the+Rho-kinase+pathway+in+astrocytes.">t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes.</a> Blood. , (2012).</li><li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine+increases+the+permeability+of+primary+mouse+cerebral+endothelial+cell+monolayers.">N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers.</a> Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).</li><li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nat. Med. 14, 731-737 (2008).</li><li>Yepes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-type+plasminogen+activator+induces+opening+of+the+blood-brain+barrier+via+the+LDL+receptor-related+protein.">Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein.</a> J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).</li><li>Abu Fanne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+permeability+and+tPA-mediated+neurotoxicity.">Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity.</a> Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+receptor-mediated+induction+of+matrix+metalloproteinase+by+tissue+plasminogen+activator.">Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator.</a> Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hemorrhagic+transformation+after+tissue+plasminogen+activator+reperfusion+therapy+for+ischemic+stroke.">Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke.</a> Stroke. 35, 2726-2730 (2004).</li><li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+better+use+of+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke.">How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke.</a> Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).</li><li>Acheampong, P., Ford, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+alteplase+in+the+treatment+of+ischaemic+stroke.">Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke.</a> Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).</li><li>Derex, L., Nighoghossian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+haemorrhage+after+thrombolysis+for+acute+ischaemic+stroke:+an+update.">Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).</li><li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+treatment--light+at+the+end+of+the+tunnel.">Stroke treatment--light at the end of the tunnel.</a> Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).</li><li>Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+Stroke+in+the+2010s.">Reversing Stroke in the 2010s.</a> Stroke. 40, 3156-3158 (2009).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Song, L., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+that+maintain+expression+and+cytoskeletal+association+of+tight+junction-associated+proteins.">Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li></ol>

Medizinische Forschung in Hirnerkrankungen leidet viel translationale Schwierigkeiten. Im Bereich des akuten ischämischen Schlaganfalls, zum Beispiel viele Medikamente, die große Verheißung in Tiermodellen zeigten, scheiterte an der Klinik 38,39. Die Gründe für diese enttäuschende Ergebnisse sind vielfältig und umfassen Untreue der präklinischen Testsysteme auf den menschlichen Schlaganfall-Szenario und Überbewertung der Ergebnisse aus Tierstudien, 21 erhalten. Eine Strategie, um den Vorhe...

Die BBB ist eine spezielle Schnittstelle zwischen der peripheren Durchblutung und des zentralen Nervensystems, entscheidend für die Aufrechterhaltung der Hämostase Gehirn verantwortlich. Es umfasst verschiedene Hirnmikrovaskulären Endothelzellen (BEK), die funktional durch wenige zellulären und zellfreien Komponenten (unten) beeinflusst werden, um eine enge und dynamische Gateway in das Gehirn bilden. Unter physiologischen Bedingungen ist die BBB schränkt den Durchtritt von Blutzellen, Plasmabestandteile und Schadstoffe, alle potentiell neurotoxische, in das Gehirn. Parallel dazu wird die BBB selektiv tauscht Schlüssel-Ionen und Nährstoffe (Glukose und Aminosäuren) und Stoffwechselabfallprodukte zwischen dem Gehirn und den Kreislauf, genau die Gehirnumgebung 1,2 zu halten. In den letzten Jahren ist es immer deutlicher, dass Versagen der BBB in einer Vielzahl von chronischen Hirnerkrankungen, wie z. B. neurodegenerative oder entzündungsbedingten Krankheiten (z. B. Alzheimer-Krankheit und tritt multiple Sklerose, beziehungsweise) 3, sowie bei akuten Erkrankungen wie Schlaganfall 4. Die einzigartigen Eigenschaften von BBB Hirnendothelzellen (BECs) sind weitgehend durch ihre Gehirnumgebung 5 induziert, insbesondere durch Astrozyten 6,7. Es gibt ein wachsendes Verständnis, dass andere Zelltypen, wie Perizyten 8, Nervenzellen und Mikroglia 1,3 sowie die Basalmembran 9, unterstützt BECs und bilden zusammen eine Funktionseinheit als der &quot;neurovaskuläre Einheit&quot; (NVU), die gleichzeitig Paare neuronalen Stoffwechselanforderungen, um ihre Versorgung Kapillaren 10. Die Beteiligung des BBB in pathologischen Situationen zugrunde zahlreiche Versuche, in-vitro-Modelle zu entwickeln, um BBB in BBB-Forschung 11,12 unterstützen. Diese Modelle versuchen, so nah wie möglich in vivo nachahmen BBB Eigenschaften nach der NVU-Prinzip. In-vitro- </em&gt; BBB-Modelle basieren im Allgemeinen auf einer Monolage von Tight-Junction-bildenden BECs (vor allem aus Rinder 13, Menschen 14, 15 Ratte, Maus 16, 17,18 und Schweine Herkunft), auf einer porösen Membran kultiviert zusammen mit unterstützenden Astrozyten (ausführlich bis zum Jahr 2005 11 Deli et al. prüft). Astrozyten in der berührungslosen Bedingungen auf dem Boden einer Gewebekulturvertiefung, von BECs (auf der oberen Oberfläche der Membran kultiviert) noch durch das Kulturmedium mit BECs Kommunikation über lösliche Faktoren 16 getrennt gehalten werden. In fortgeschritteneren Modelle, die besser ähneln die anatomische Struktur der BBB in vivo werden in Astrozyten Kontaktbedingungen und unmittelbar auf der gegenüberliegenden Seite der Membran in nächster Nähe zu BECs 13,15,17 (Fig. 1) kultiviert gehalten. Diese Konfiguration ermöglicht physischen Kontakt zwischen BEK und Astrozyten gegründet, als Astrozyten Projektihre Prozesse durch die poröse Membran. Wichtig ist, dass für einen echten Kontakt zu treten die Poren sollte 1 um im Durchmesser ≥ werden, da Astrozyten End-Füße können nicht durch kleinere Porengrößen (dh 0,4 um) 14,15 geben. Insbesondere werden Kontakt BBB Systeme in einigen Studien gezeigt, überlegen ihrer berührungsGegen hinsichtlich ihrer trans-endothelialen elektrische Widerstand (TEER) und endotheliale Permeabilität Werte verschiedener Tracer 13,17,18 sein. Eine zusätzliche Dimension der Medienfluss wurde kürzlich in einer Reihe von in vitro-Modellen BBB Scherkräfte am Endothel engere Simulation des Hirngefäßsystems gelten 12,19 aufgenommen. Ein technisches Hindernis bei der Erzeugung eines Kontakt BBB Modell zu überwinden, ist das Impfen von Astrozyten gegen die Schwerkraft auf der abluminalen Oberfläche der porösen Membran. Vorherige Protokolle 13,20, wo Astrozyten wurden einfach in einem Tropfen Medien nicht auf eine in ausgesätumgewandelt Einsatz, erlaubt nur kurze Aussaatzeiten (dh 10 min 13 oder 2 Std. 20), die in unseren Händen gefunden wurden, nicht ausreichend für die ordnungsgemäße Zellhaftung zu sein. Unter Verwendung dieses Grundverfahren eine längere Periode Astrozyten Befestigung erfordert eine ständige Überwachung der Einsätze durch häufiges Öffnen des Inkubators (was Schwankungen in Temperatur, pH und Luftfeuchtigkeit) und ist auch anfällig für ungleichmäßige Zellaussaat durch Leckage von Medium durch die Poren, insbesondere Wenn Poren größer als 1 &amp;mgr; m verwendet. Hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll für die Herstellung einer Kontakt BBB Modell. Unser Verfahren schließt ein alternatives Verfahren für die Zellaussaat auf invertierte Einsätze, die die oben genannten Einschränkungen Adressen. Das Verfahren ermöglicht die Einhaltung von Astrozyten ungestört auf der abluminalen Membranoberfläche, äquilibriert in einem Inkubator, für einen längeren Zeitraum. Als Ergebnis wird eine gleichmäßige Aussaat von Astrozyten erreicht, die Barrierequalität erhöhtund minimiert die basale Durchlässigkeit Variationen zwischen den Einsätzen. Da die Verwendung von menschlichen Zellen ist wichtig für die Mensch-relevanten Forschungs 21, zusätzlich haben wir in diesem Artikel zeigen, die spezifische Nutzung einer neuartigen Kombination von primären humanen BECs und verewigt menschlichen Astrozyten für die Einrichtung einer Kontakt menschlichen BBB-Modell mit einem Hochdurchsatz-Screening-Kapazität . Da die Anzeige von Zellen auf porösen Membranen kann schwierig wir auch ausführlich Färbetechniken, die bei der Bestimmung der Zusammenfluss und Zellmorphologie auf den porösen Membranen unterstützen kann. Schließlich veranschaulichen wir, wie unsere menschlichen BBB-Modell kann genutzt werden, um die Wirkung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) zu untersuchen - ein Blutgerinnsel Zerschlagung Enzym, das als einzige Behandlungsoption für akuten ischämischen Schlaganfall dient - auf der BBB.

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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
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			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​umfasst undurchlässig, aber anpassungsfähig Gehirn Kapillaren, die genau steuern das Gehirn Umwelt. Ausfall der BBB hat in der Ätiologie von vielen Hirnerkrankungen deutet worden, entsteht ein Bedarf für die Entwicklung von humanen in vitro Modellen BBB in klinisch relevanten Forschung zu unterstützen. Unter den zahlreichen BBB-Modelle bisher beschrieben, eine statische (ohne Strömung), wenden BBB-Modell, bei dem Astrozyten und Gehirn-Endothelzellen (BEK) auf den gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran kokultiviert, entpuppte sich als ein vereinfachtes System, um noch authentisch zu simulieren, die BBB mit Hochdurchsatz-Screening Kapazität. Dennoch ist die Erzeugung eines solchen Modells stellt einige technische Herausforderungen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung eines Humankontakt BBB Modell unter Verwendung einer neuartigen Kombination von primären humanen BECs und immortalisierten menschlichen Astrozyten. Insbesondere haben wir ausführlich eine innovative Methode zur Zellaussaat auf invertiert Einsätze sowie Insertion angebent Färbetechniken und veranschau, wie wir unser Modell für BBB-Forschung zu verwenden.

Um einen Menschen, Kontakt BBB Modell mussten wir SVG-Dateien und BECs auf porösen Membranen mit einem 3 um Porengröße, um den Durchgang gezeigt Astrozyten End-Füße für den Kontakt mit Endothelzellen 14,15,27,28 erlauben pflegen zu etablieren. Eine schematische Darstellung des kompletten Kontaktmodell ist in Abbildung 1 (linke Abbildung) dargestellt. Die wichtigsten technischen Herausforderungen durch ein Kontaktsystem dargestellt ist die Notwendigkeit, Astrozyten gegen die Schwerkraft ...

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Einrichtung von Menschenmodelle der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​kann die Forschung in Gehirn Bedingungen mit BBB Versagen profitieren. Wir beschreiben hier ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer Kontakt BBB Modell, das Co-Kultur von Astrozyten und menschlichen Endothelzellen des Gehirns auf den gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran erlaubt.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Forschung

Biotechnik

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Typ I-Kollagen aus der Haut

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Luzifergelb - Ein robuster parazellulärer Permeabilitätsmarker in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Barriere

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Gleichzeitige Quantifizierung ausgewählter Kynurenine, analysiert durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Transplantation eines biobedruckten 3D-Patches in einem Murine-Modell des Myokardinfarkts

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

Störung der Blut-Rückenmark-Schranke mittels fokussiertem Ultraschall niedriger Intensität im Rattenmodell

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...

A Novel Minimally Invasive Slow Injection Method for Reducing Tissue Injury

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion (Video) | JoVE 

Eine neuartige Zellinjektionsmethode mit minimaler Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...