Name: improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier
Uploaded: 2013-11-12T18:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier at JoVE.com

この研究は、オーストラリア国立保健医療研究評議会（助成金＃606658）からRLMに授与の補助金によって賄われていた。

1。細胞培養（前はBBB総会に3〜7日） 1.1。初代ヒト脳微小血管内皮細胞（BECは） BECは、商業的に入手した。細胞を、正常なヒト脳皮質組織のディスパーゼ解離によって生成され、通路3（&lt;12回の集団倍加）で凍結提供された。 <ol><li> 基層 ：メーカーの指示に従って「接着因子」とコート組織培養容器。 </li><li> 細胞の維持 ：血清含有?...

<ol>
	<li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier/neurovascular+unit+in+health+and+disease.">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).</li><li>Zlokovic, B. 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脳の病理への医学研究は、多くの翻訳困難を抱えている。急性虚血性脳卒中の領域では、例えば、動物モデルにおいて非常に有望であった多くの薬剤は、臨床38,39に失敗しました。これらの不本意な結果の理由は多様であり、人間のストロークシナリオおよび動物実験21から得られた結果の過大評価に前臨床試験システムの不倫が含まれています。臨床段階に前臨床調査結果?...

BBBは、末梢血液循環および脳止血の維持に決定的に責任が中枢神経系との間の特殊なインタフェースである。それは、機能的に脳内にしっかりと動的ゲートウェイを形成するために（下記参照）、いくつかの細胞性および無細胞成分によって影響される別個の脳微小血管内皮細胞（前記下部電極）を含む。生理的条件下でBBBは、脳内に、血液細胞、血漿成分と有害物質、すべての潜在的に神経毒性の通過を制限する。並行して、BBBを選択的に脳および脳正確に環境を維持するために、1,2の循環の間にキーイオンおよび栄養素（グルコースおよびアミノ酸）および代謝老廃物を交換する。近年、BBBの障害が神経変性または炎症関連疾患（ 例えば、アルツハイマー病およびmultiplのような慢性の脳の病理の多様で起こることが明らかになってきているEは3だけでなく、虚血性脳卒中4のような急性状態で）それぞれ硬化症。 脳内皮細胞（BECは）の固有のBBB特性は、主にそれらの脳環境5によって誘導され、特にアストロサイト6,7によってれる。これと同時に「神経血管装置」（NVU）と呼ばれるような周皮8、ニューロンとミクログリア1,3だけでなく、基底膜9、サポートBECはなどの他の細胞型、という機能ユニットを一緒になって成長して理解することがありますカップル彼らの供給毛細血管10への神経代謝要求。 病理学的状況でのBBBの関与は、BBB関連の研究11,12を支援するためにin vitro BBBモデルで開発する多くの試みの下にある。これらのモデルは、NVU原理に従って生体 BBB特性にできるだけ近くを模倣することを目指しています。 インビトロ </EM&gt; BBBモデルは、一般的に（、（主に牛13から、人間の14、ラット15、マウス16、およびブタ17,18起点）タイトジャンクションを形成する前記下部電極の単層上に多孔質膜上で培養し、一緒支えるアストロサイトに依存して広範囲にデリら 2005 11）によって検討。 星状細胞は、培養培地がまだ可溶性因子を介して前記下部電極16と通信することによって、（膜の上面上で培養）前記下部電極から分離されたウェルの組織培養の底面上に非接触状態で増殖させることができる。より良い生体内で BBBの解剖学的構造に似ている、より高度なモデルでは、アストロサイトが直接前記下部電極13,15,17（ 図1）に近接した膜の反対側に接触条件で培養で維持されています。この構成は、確立され、前記下部電極とアストロサイトとの間の物理的な接触を可能にするときアストロサイトプロジェクト多孔質膜を通って、そのプロセス。アストロサイトのエンドフィートは小さい細孔サイズ（ すなわち 0.4ミクロン）14,15を通過することができないため、重要なのは、発生する真の接触のための細孔は、直径1μmのを≥必要があります。注目すべきことに、コンタクトBBBシステムは、それらの経内皮電気抵抗（TEER）および種々のトレーサー13,17,18の内皮透過性値に関して、それらの非接触型対応物よりも優れていることがいくつかの研究で実証されている。メディアフローの追加の次元が最近、脳血管系12,19の近いシミュレーションに内皮にせん断力を加えるためのin vitro BBBモデルの数に追加されました。 コンタクトBBBモデルを生成する際に克服する一つの技術的な障害は、多孔質膜の反管腔側表面上の重力に抗して星状細胞の播種である。アストロサイトは、単に内の一番上のメディアの落下に播種した前回のプロトコル13,20、verted挿入、許される唯一の短い播種回適切な細胞の付着のためには不十分であることが私たちの手で発見された（ すなわち 、10分13または2時間20）。この基本的な方法を用いて、より長いアストロ装着期間は、特に、（温度、pH、湿度の変動を引き起こす）​​インキュベーターの頻繁な開口部によってインサートの常時監視を必要とし、また、孔を通る媒体の漏れに起因する不均一な細胞播種する傾向がある細孔場合が1μmよりも大きいが使用される。 ここでは、コンタクトBBBモデルの製造のための一般的なプロトコルを記載している。我々の手順は、上述の制限に対処反転インサート上の細胞播種のための代替の方法を含む。この方法は、長時間にわたって、平衡化したインキュベーター中、反管腔側膜表面上への星状細胞の乱されない付着を可能にする。その結果、星状細胞の均一な播種は、バリア品質を向上が達成されると挿入の間、基礎透過性の変動を最小限に抑えることができます。 ヒト細胞の使用は、人間が関連する研究21のために重要であるとして、我々は、さらに、この記事で初代ヒトBECは、新規な組み合わせの具体的な利用を実証し、ハイスループットスクリーニング能力との接触人間BBBモデルの確立のための人間のアストロサイトを不死化。多孔性膜上に細胞を観察すると、多孔質膜上に合流し、細胞形態の決定を補助することができる困難で、また我々の詳細を染色技術とすることができるからである。 BBB上 - 急性虚血性脳卒中のための唯一の治療選択肢となって血栓破裂酵素 - 最後に、私たちは私たち人間のBBBモデルは、組織型プラスミノーゲン活性化因子の影響（T-PA）を調べるために利用することができる方法の例である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-210</td>
			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

血液脳関門（BBB）は、しっかりと脳環境を制御する不透過性はなく適応脳毛細血管を含む。 BBBの障害は、臨床的に関連の研究を助けるために、インビトロ BBBモデルにおいてヒトの開発の必要性が生じ、多くの脳の病態の病因に暗示されている。これまでに説明した数々のBBBモデル、（フローなし）静的な中では、星状細胞および脳内皮細胞（BECは）は、多孔質膜の両側に共培養されたBBBモデルを連絡し、シミュレートするために、簡略化され、まだ本格的なシステムとして登場ハイスループットスクリーニング能力を有するBBB。それにもかかわらず、このようなモデルの生成は、いくつかの技術的な課題を提示。ここでは、一次ヒトBECはと不死化ヒトアストロサイトの新規な組み合わせを利用したコンタクト人間BBBモデルの製造のためのプロトコルを記述します。具体的には、詳細な反転インサート上の細胞播種のための革新的な方法だけでな​​く、inserを指定T染色技術と、我々は、BBB関連の研究のための我々のモデルをどのように使用するかを例示している。

人間を確立するために、BBBモデルに連絡し、我々は、内皮細胞14,15,27,28と接触するアストロサイトのエンドフィートの通過を可能にするために示され、3ミクロンの細孔径を有する多孔質膜上SVGsと前記下部電極を育成しなければならなかった。完全な接触モデルの概略図を図1（図示の左側）に示されている。コンタクトシステムによって提示された主要な技術的な課題は?...

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

血液脳関門（BBB）のヒトモデルの確立は、BBBの障害に関連する脳条件の研究に利益をもたらすことができる。ここでは、多孔質膜の両側に、ヒト星状細胞および脳内皮細胞の共培養を可能に接触BBBモデルを調製するための改善された技術が記載されている。

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

ルシファーイエロー - ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける堅牢な細胞透過性マーカー

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

癌細胞培養から採取した培地における液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

心筋梗塞のマウスモデルにおける3次元バイオプリントパッチの移植

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

ラットモデルにおける低強度集束超音波を用いた脊髄バリアの破壊

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...

A Novel Minimally Invasive Slow Injection Method for Reducing Tissue Injury

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion (Video) | JoVE 

浸潤の少ない新規細胞注入法

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...