Name: improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier
Uploaded: 2013-11-12T18:45:00
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이 연구는 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (허가 번호 606658)에서 RLM에게 수여 교부금에 의해 투자되었다.

1. 세포 배양 (이전 BBB 조립에 3-7 일) 1.1. 차 인간의 뇌 미세 혈관 내피 세포 (를 BECs) 를 BECs는 상업적으로 수득 하였다. 세포는 정상적인 인간의 뇌 피질 조직의 디스 파제 해리에 의해 생성 및 통로 (3) (&lt;12 인구 doublings) 냉동 제공되었다. <ol><li> 하층 : 제조 업체의 지침에 따라 &quot;첨부 인자&quot;와 코트 조직 문화 선박. </li><li> 세포의 유지 보?...

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뇌 병변에 의료 연구는 많은 번역 어려움을 겪고있다. 급성 허혈성 뇌졸중의 영역에서, 예를 들어, 동물 모델에서 큰 약속을 보여 많은 약물 클리닉 (38, 39)에 실패했습니다. 실망스러운 결과에 대한 이유는 다양하며 인간의 스트로크 시나리오 및 동물 연구 (21)에서 얻어진 결과의 과장에 임상 테스트 시스템의 부정이 (가) 있습니다. 임상 단계에 임상 연구 결과의 예측을 개선하는 ...

BBB는 말초 혈액 순환과 뇌 지혈 유지에 결정적인 책임 중추 신경계 사이의 특수한 인터페이스이다. 기능적 뇌에 단단하고 역동적 인 게이트웨이를 형성하기 위해 (아래) 몇 가지 세포 및 무 세포 구성 요소에 의해 영향을하는 별개의 뇌 미세 혈관 내피 세포 (를 BECs)를 포함한다. 생리적 조건 하에서 BBB는 뇌에 혈액 세포, 혈장 성분 및 유해 물질, 모든 잠재적 신경 독성의 통과를 제한한다. 병행 BBB 선택적 정확하게 뇌 1,2 환경을 유지하기 위해 뇌와 순환 사이 키 이온 및 영양분 (포도당과 아미노산) 및 대사 노폐물을 교환한다. 최근 몇 년 동안은 BBB의 실패는 신경 퇴행성 염증 관련 질환 (예를 들어, 알츠하이머 질환과 multipl과 같은 만성 뇌 병변의 다양한 발생하는 것을 분명 해지고있다전자는 허혈성 뇌졸중 4와 같은 심각한 상황뿐만 아니라,)는 각각 3 경화증. 뇌 혈관 내피 세포 (를 BECs)의 독특한 BBB 속성은 크게 자신의 대뇌 환경 (5)에 의해 유도, 특히 성상 세포 6,7로됩니다. 다른 이러한 혈관 주위 세포 08 뉴런과 마이크로 글 1,3 세포 유형뿐만 아니라, 기저막 (9),를 BECs을 지원 기능 유닛이 &quot;신경 혈관 유닛&quot;(NVU)를 지칭 함께 형성하는 성장 이해있어 동시에 부부는 공급 모세 혈관 10 신진 대사 요구를 신경. 병적 인 상황에서 BBB의 참여 BBB 관련 연구 11, 12을 지원하기 위해 관내 BBB 모델의 개발에 많은 시도를 기초. 이 모델은 NVU의 원리에 따라 생체 BBB 특성에 가깝게 모방하는 것을 목표로하고 있습니다. 체외 </EM&gt; BBB 모델은 일반적으로 ((주로 소 (13)으로부터, 인간의 14, 쥐 15, 쥐 16, 17, 18 및 돼지 유래) 꽉 접합 형성를 BECs의 단층에 다공성 막에서 배양 함께 지원하는 성상 세포와 의존 광범위 ) 델리 등 2005. (11)에 의해 검토. 성상 세포는 배양액 아무런 가용성 요소 (16)를 통해를 BECs와 통신하여 (막의 상면에 재배)를 BECs 분리 잘 조직 배양의 하단에 비접촉 상태에서 성장 될 수있다. 더 나은 생체 내에서 BBB의 해부학 적 구조를 닮은 고급 모델에서, 성상 세포는 접촉 조건과 직접를 BECs 13,15,17 가까이 (그림 1)에서 멤브레인의 반대편에 배양에 유지됩니다. 이 구성은 설립를 BECs 및 성상 세포 사이에 신체 접촉을 가능하게 할 때 성상 프로젝트다공성 막을 통해 자신의 프로세스. 성상 교세포 최종 피트 작은 기공 크기 (즉, 0.4 μM) (14, 15)을 통과 할 수 있기 때문에 중요한 것은, 발생하는 진정한 담당자의 기공은 직경이 1 ㎛를 ≥해야합니다. 특히, 연락처 BBB 시스템은 자신의 트랜스 내피 전기 저항 (봉사자) 및 각종 추적기 13,17,18의 투과도 값에 대한 비접촉 대응에 우수한 것으로 일부 연구에서 입증됩니다. 미디어 흐름의 또 다른 차원은 최근 뇌 혈관 12, 19의 가까운 시뮬레이션을위한 내피 세포에 전단력을 적용 할 수있는 체외 BBB 모델의 숫자에 추가되었습니다. 접촉 BBB 모델을 생성 할 때 극복하는 한 가지 기술적 장애물은 다공성 멤브레인의 abluminal 표면에 중력에 대하여 성상 교세포의 시드이다. 성상 세포는 단순히의 상단에 미디어의 드롭에 씨앗을 품고 있었다 이전 프로토콜 13,20,, 변환 된 삽입, 수 만 짧은 시드 배 적절한 세포 부착에 대한 불충분 우리의 손에서 발견되었다 (즉, 10 분 13 2 시간 20). 이 기본적인 방법을 사용하여, 긴 성상 세포 부착 기간 (온도, pH 및 습도의 변동을 일으키는) 인큐베이터의 빈번한 개폐함에 인서트의 지속적인 모니터링을 필요로 인한 기공을 통한 매체의 누설에도 요철 세포 시딩하는 경향이있다 특히 1 μm의보다 큰 기공을 사용하는 경우. 여기서, 우리는 접촉 BBB 모델의 준비를위한 일반적인 프로토콜을 설명한다. 우리의 절차는 위에서 언급 한 제한 사항을 해결 반전 삽입에 세포 파종을위한 다른 방법을 포함한다. 방법은 장시간 동안, 평형화 인큐베이터에서 abluminal 막 표면 상 교세포의 교란 부착을 허용한다. 결과적으로, 성상 세포의 균일 한 시드가 장벽 품질을 증가시킨다 달성과 인서트 사이의 기초 투자율 변화를 최소화 할 수 있습니다. 인간 세포의 사용은 인간 관련 연구 21 중요하기 ​​때문에, 우리는 또한이 문서에서 인간의 기본를 BECs의 새로운 조합의 특정 사용을 설명하고 높은 처리량 검사 용량 접촉 인간 BBB 모델의 설립을위한 인간의 성상 세포를 불멸 . 다공성 막에 세포를 보는 것은 다공성 막에 합류하고 세포 형태의 결정에 도움을 줄 수 어렵습니다, 우리는 또한 세부 염색 기술이 될 수 있기 때문에. BBB에 - 급성 허혈성 뇌졸중에 대한 유일한 치료 옵션으로 제공하는 응고 파열 효소 - 마지막으로, 우리는 우리 인간의 BBB 모델은 조직 형 플라스 미노 겐 활성제의 영향 (t-PA)를 조사하는 데에 이용 될 수있는 방법을 예시.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-210</td>
			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​은 밀접 뇌 환경을 제어하지만, 불 투과성 적응할 뇌 모세관을 포함한다. BBB의 실패는 임상 관련 연구를 지원하기 위해 체외 BBB 모델에서 인간의 개발에 대한 필요성을 만들고, 많은 뇌 병변의 원인에 함축되어 있습니다. 지금까지 설명한 여러 BBB 모델 중, (흐름)없이 정적, 성상 세포 및 뇌 혈관 내피 세포 (를 BECs가) 다공성 막의 양측에 동시 배양하는 BBB 모델을 문의 시뮬레이션 단순화 아직 확실한 시스템으로 부상 높은 처리량 검사 능력 BBB. 그럼에도 불구하고 이러한 모델의 생성은 몇 가지 기술적 과제를 제시한다. 여기서 우리는 인간의 기본를 BECs 및 불후의 인간의 성상 세포의 새로운 조합을 이용하여 연락처 인간 BBB 모델의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 특히, 세부 반전 삽입에 세포 파종을위한 혁신적인 방법뿐만 아니라이 inser를 지정T 염색 기술과 우리가 BBB 관련 연구에 대한 우리의 모델을 사용하는 방법을 예시.

우리는 내피 세포 14,15,27,28과 접촉 성상 세포의 최종 피트의 통과를 허용하는 것으로 3 ㎛의 기공 크기, 다공성 막에 SVGs과를 BECs을 연마했다 인간, 연락처 BBB 모델을 수립하기 위해. 전체 연락처 모델의 개략도는 그림 1 (그림 왼쪽)에 설명되어 있습니다. 연락처 시스템에 의해 제공되는 주요 기술적 과제는 멤브레인의 abluminal 표면의 중력에 성상을 시드 할 필요가있다. 우리는...

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

나노 크기의 지질 Vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

연구

생체공학

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

피부에서 타입 I 콜라겐의 제조를위한 개선 된 방법

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

쥐 뇌 혈관 벽의 맞은 편에 FITC로드 Ferritins의 생체 외 투과 년 : 모델 Nanoformulated 분자의 배달을 공부하기

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

루시퍼 옐로우 - 인간 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 강력한 파라셀룰러 투과성 마커

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

심근 경색의 뮤린 모델에서 3D 생체 인쇄 패치의 이식

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

쥐 모델에서 저강도 집속 초음파를 사용한 혈액-척수 장벽 파괴

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...

A Novel Minimally Invasive Slow Injection Method for Reducing Tissue Injury

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion (Video) | JoVE 

침습을 최소화하는 새로운 세포 주입 방법

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...