Name: high-throughput flow cytometry cell-based assay to detect antibodies to n-methyl-d-aspartate receptor or dopamine-2 receptor in human serum
Uploaded: 2013-11-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Australian National Health and Medical Research Council, Star Scientific Foundation (Australien), Tourette-Syndrom Association (USA) unterstützt wird, Trish Die Multiple Sklerose Forschungsgemeinschaft und Multiple-Sklerose-Forschung Australien, Petre Foundation (Australien), die Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australien). Wir danken allen Patienten und Familienmitglieder, die Proben für unsere Studie zur Verfügung gestellt.

<html> 1. Subklonierung Strategie zur pIRES2-EGFP Vektor Encoding D2R oder NMDAR Construct <ol><li> Erhalten vollständigen cDNA-Klon des menschlichen D2R oder NMDAR-Untereinheit 1 (NR1). </li><li> Wähle einen Expressionsvektor, wie pIRES2-EGFP, die für die Expression des Transmembranproteine ​​mit Enhanced Green Fluorescent Protein (GFP)-Reporter unter der Kontrolle einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES), so dass die beiden Antigene und GFP in koexprimiert werden Zellen getrennt. </li><li> Subklonieren ...

<ol>
	<li>Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalitis+and+antibodies+to+synaptic+and+neuronal+cell+surface+proteins.">Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins.</a> Neurol. 77, 179-189 (2011).</li><li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS:+new+developments+and+future+challenges.">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+encephalitis:+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies.">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma.">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).</li><li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methyl-D-aspartate+receptor+antibodies+in+pediatric+dyskinetic+encephalitis+lethargica.">N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica.</a> Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).</li><li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+the+GABA(B)+receptor+in+limbic+encephalitis+with+seizures:+Case+series+and+characterisation+of+the+antigen.">Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen.</a> Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location.">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).</li><li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+Kv1+potassium+channel-complex+proteins+leucine-rich,+glioma+inactivated+1+protein+and+contactin-associated+protein-2+in+limbic+encephalitis,+Morvan&#8217;s+syndrome+and+acquired+neuromyotonia.">Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan&#8217;s syndrome and acquired neuromyotonia.</a> Brain. 133, 2734-2748 (2010).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels:+a+case+series.">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).</li><li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+Ophelia+syndrome.">Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome.</a> Neurol. 77, 1698-1701 (2011).</li><li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+surface+dopamine-2+receptor+in+autoimmune+movement+and+psychiatric+disorders.">Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders.</a> Brain. , (2012).</li><li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis:+an+observational+cohort+study.">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).</li><li>Hughes, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+synaptic+mechanisms+of+anti-NMDA+receptor+encephalitis.">Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis.</a> J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).</li><li>Bien, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathology+of+autoantibody-associated+encephalitides:+clues+for+pathogenesis.">Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis.</a> Brain. 135, 1622-1638 (2012).</li><li>Waters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serologic+diagnosis+of+NMO:+a+multicenter+comparison+of+aquaporin-4-IgG+assays.">Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays.</a> Neurol. 78, 665-671 (2012).</li><li>McLaughlin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+B+Cell+Autoimmunity+to+a+Myelin+Surface+Antigen+in+Pediatric+Multiple+Sclerosis.">Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis.</a> J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).</li><li>Probstel, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+MOG+are+transient+in+childhood+acute+disseminated+encephalomyelitis.">Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis.</a> Neurol. 77, 580-588 (2011).</li><li>Cho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+Region+of+Dopamine+D2+Receptor,+a+Rhodopsin+Family+GPCR,+Regulates+Proper+Integration+into+Plasma+Membrane+and+Endocytic+Routes.">N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes.</a> British journal of pharmacology. , (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pathogenic+antibody+response+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+multiple+sclerosis.">Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).</li><li>Brilot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+children+with+inflammatory+demyelinating+central+nervous+system+disease.">Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease.</a> Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).</li><li>Boronat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalitis+and+Antibodies+to+Dipeptidyl-Peptidase-Like+Protein-6,+a+Subunit+of+Kv4.2.">Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2.</a> Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).</li><li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2.">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li></ol>

Dieser Aufsatz beschreibt eine neuartige Anwendung der Durchflusszytometrie Live-Assay auf Zellbasis, um Antikörper, die gegen spezifische Zelloberflächen neuronale Proteine ​​unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Probennehmer erfassen. Mit dieser Technik berichten wir, dass eine Untergruppe von Patienten mit Autoimmun ZNS-Erkrankungen betroffen sind, Serum-Antikörper an die Oberfläche oder in Oberflächen NMDAR D2R. Wesentliche Schritte für eine optimale Antikörpernachweis unter Ve...

In den letzten Jahren haben die Autoimmun Formen des zentralen Nervensystems (ZNS) identifiziert worden. Es hat sich gezeigt, dass diese Krankheiten assoziiert sind und durch die Anwesenheit von Autoantikörpern definiert. Diese Antikörper binden an neuronale Rezeptoren oder synaptische Proteine ​​in 1,2 Neurotransmission beteiligt ist. Unterschiedliche Antigene erkannt wurden, wie N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDAR) 3-5, γ-Aminobuttersäure-Rezeptor (GABA)-Rezeptor 6, α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic (AMPA)-Rezeptor 7, spannungsabhängigen Kaliumkanals (VGKC) assoziierte Proteine: Leucin-reichen Gliom-aktivierte Protein-1 (LGL-1) und Contactin-assoziiertes Protein 2 (capsr2) 8,9-, Glutamat-Rezeptor 5,10 und Dopamin-2-Rezeptor (D2R) 11. In der Vergangenheit waren diese Autoimmun ZNS-Störungen (vor allem genannt Enzephalitis) oft nicht diagnostiziert und unbehandelt. Diese neuartigen Antikörper Biomarker, z. B.NMDAR Antikörper oder Antikörper D2R, haben wesentlich verbesserte Diagnose und Bewusstsein und haben die Behandlungsmöglichkeiten für Patienten eröffnet. In der Tat ist eine frühzeitige Behandlung mit Immuntherapien mit verbesserten Ergebnis 11,12 verbunden. Traditionelle Verfahren, um Antikörper, wie Enzym-Immunoassay (ELISA) und Western-Blot erkennen sind zum Nachweis von Antikörpern in Seren eingesetzt. Sie sind jedoch nicht ohne weiteres zu ermöglichen Erkennung von extrazellulären Oberfläche oder Epitope und vielmehr kann die Immunreaktivität gegen ein intrazelluläres Epitop zeigen. Weiterhin Antikörper, die an die extrazelluläre Domäne von wichtigen Proteinen bei der Neurotransmission beteiligt sind, binden wahrscheinlich pathogenen 2,3,7,13,14 sein. Daher ist die Entwicklung von genauen und empfindlichen Assays zu relevanten Zelloberfläche oder der extrazellulären Antikörperzielen bei Patienten entdecken, von größter Bedeutung. Der Goldstandard-Methode im Bereich basiert auf der Verwendung von lebenden Zellen basieren, in so genannten &quot;Zelle-based-Tests &quot;. Dieses Verfahren umfasst die Expression eines Antigens auf der Oberfläche von Säugerzellen (meistens menschliche embryonale Nieren-293 (HEK293-Zellen)) in seiner nativen Form durch Transfektion von Vektoren, die die vollständige cDNA-Sequenz des Antigens von Interesse. Live nonpermeabilized Zellen werden dann mit verdünntem Patientenserum inkubiert, gefolgt von Fluorochrom-konjugierten Anti-Human-Immunglobulin (Ig)-sekundären Antikörper. Die Intensität oder Fluoreszenzgrad wird dann festgestellt und in der Ebene der Autoantikörper-Bindung verbunden sind. Dieses Verfahren ist spezifisch, da nur ein Antigen in Zellen überexprimiert. Die am weitesten verbreitete &quot;read-out&quot; hat nach Immunzytochemie 4,5,8-10 gewesen konfokalen Mikroskopie-Analyse. Jedoch Durchflusszytometrie zellbasierten Assays wurden erfolgreich verwendet, um Antikörper in Patienten mit demyelinisierenden Erkrankungen 15-17 erfassen. Insbesondere Waters et al. 15 Vergleich der Antikörpernachweis unter Verwendung einer Pfanneel des Antikörper-Nachweistechniken, einschließlich Tests auf Zellbasis, gefolgt von Mikroskopie oder Durchflusszytometrie analysiert, und hat gezeigt, Durchflusszytometrie Assay auf Zellbasis, um die empfindlichen, genauen und zuverlässigen Methode. Daher ist die Durchflusszytometrie zellbasierten Assay vorteilhaft, wie es ist quantitativ, nicht Prüfer abhängig, und jede Verwendung von radioaktivem Material nicht um. Es ist auch praktisch, da es ermöglicht vielen Patienten, in einer kurzen Zeit untersucht werden. In jüngerer Zeit haben wir ein Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie-Assay auf Zellbasis, um NMDAR Antikörper und D2R-Antikörper in Patienten mit Autoimmunerkrankungen CNS 11 zu erfassen optimiert. Unsere Gruppe vor kurzem erkannt NMDAR Antikörper in Patientenproben mit Durchflusszytometrie zellbasierte Assays. Diese NMDAR Antikörper-positiven Seren wurden zuvor mittels konfokaler Mikroskopie analysiert und ebenfalls als positive 11 zu sein. Dieses Protokoll beschreibt einen Durchflusszytometrie Zellen basierender Test für den Nachweis von conformation empfindlichen ZNS-Antikörper in Patientenserum Verwendung eines automatisierten Hochdurchsatz-Sampler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">pIRES2-EGFP vector</td>
			<td style="width:187px;">Clontech</td>
			<td style="width:136px;">6029-1</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA</td>
			<td style="width:187px;">Missouri S&#38;T cDNA Resource Centre</td>
			<td style="width:136px;">DRD020TN00</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">Gift from Prof A. Vincent&#160; (Oxford, UK)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)</td>
			<td style="width:187px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:136px;">556308</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">WH0001813M1-50UG</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A31571</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A21445</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">11995-065</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Foetal bovine serum</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10099-141</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15710-072</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">35050-061</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15140-122</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Geneticin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10131-035</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">14190-144</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TrypLE Express (1x) with Phenol Red</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">12605-028</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">0.9% Sodium chloride</td>
			<td style="width:187px;">Baxter</td>
			<td style="width:136px;">AHF7975</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyethylenimine</td>
			<td style="width:187px;">Polysciences Inc</td>
			<td style="width:136px;">9002-98-6</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Versene</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15040-066</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">XhoI</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10899194001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NheI</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10885843001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">K3100-01</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">JetQuick Gel Extraction Spin Kit</td>
			<td style="width:187px;">Genomed</td>
			<td style="width:136px;">420050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10481220001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Plasmid&#160;Plus&#160;Maxi Kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td style="width:136px;">12963</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Name of Equipment/Software</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Model/Version</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Flow cytometer with high-throughput sampler system</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">BDLSRII with HTS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Electronic multichannel pipette (15-300 &#956;l)</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:136px;">613-2240P</td>
			<td style="width:173px;">12-channel Xplorer Plus</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:255px;">Excel</td>
			<td style="width:187px;">Microsoft</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Prism</td>
			<td style="width:187px;">GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">v4</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:255px;">FlowJo</td>
			<td style="width:187px;">Treestar</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">v7.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">50 ml polypropylene conical tubes</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">352070</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">353046</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">353136</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Parafilm</td>
			<td style="width:187px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td style="width:136px;">PM-992</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">V-bottom 96-well plate</td>
			<td style="width:187px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">651180</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput flow cytometry cell-based assay to detect antibodies to n-methyl-d-aspartate receptor or dopamine-2 receptor in human serum

In den letzten Jahren haben sich Antikörper gegen Oberflächenproteine ​​und Konformationsänderungen in der Neurotransmission im ZNS Autoimmunerkrankungen bei Kindern und Erwachsenen nachgewiesen. Diese Antikörper wurden verwendet, um die Diagnose und Behandlung zu führen. Zellbasierte Assays zum Nachweis von Antikörpern in Patientenserum verbessert. Sie werden auf der Oberflächenexpression von Gehirn-Antigene auf eukaryotische Zellen, die dann mit verdünntem Patientenserum, gefolgt von Fluorochrom-konjugierten sekundären Antikörper inkubiert basiert. Nach dem Waschen wird sekundären Antikörperbindung dann durch Durchflusszytometrie analysiert. Unsere Gruppe hat ein Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie Live zellbasierten Assay entwickelt, um Antikörper gegen bestimmte zuverlässig erkennen Neurotransmitter-Rezeptoren. Diese Durchflusszytometrie Verfahren ist unkompliziert, quantitative, effizient, und die Verwendung eines Hochdurchsatz-Probennehmer System ermöglicht vielen Patienten auf einfache Weise in kurzer Zeit untersucht werden. Außerdem ist diese Zellbasis alssagen kann leicht angepasst, um Antikörper gegen verschiedene antigene Ziele zu erfassen, die beide aus dem zentralen Nervensystem und der Peripherie werden. Entdecken zusätzliche neue Antikörper Biomarker ermöglicht die schnelle und genaue Diagnose und Behandlung zu verbessern von immunvermittelten Erkrankungen.

Leben HEK293 D2R + CTL und HEK293-Zellen wurden mit dem Durchflußzytometer unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Probennehmer erworben. Bei der Analyse wurden die Zellen auf Basis von Vorwärtsstreuung (Größe) und Seitenstreuung (Granularität) Parameter (1A und 1D) verknüpft. HEK293-Zellen das Reportermolekül, GFP, im Zytoplasma und nicht transfizierten Zellen wurden von der Analyse (Fig. 1B und 1E) ausgeschlossen. Innerhalb der GFP <sup...

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High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

In den letzten Jahren wurden mit lebenden Zellen basierende Tests erfolgreich verwendet worden, um Antikörper gegen Oberflächenantigene erkennen und Konformationsänderungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie ermöglicht die Analyse von großen Kohorten von Patienten. Detektion von neuen Antikörper Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu verbessern.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Die Messung und Behandlung von Unterdrückung in Amblyopie

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Forschung

Medizin

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Stereo und Durchflusszytometrie Charakterisierung von Leukozyten-Subpopulationen in Models der vorübergehend oder bleibend zerebrale Ischämie

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Mittels Durchflusszytometrie

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Systembiologie der Stoffwechselregulation von Estrogen Receptor Signaling bei Brustkrebs

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Ein hoher Durchsatz, Multiplexed und Proteom-CSF-Assay Gezielte Quantifizieren Neurodegenerative Biomarkers und Apolipoprotein E Isoformen-Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

Eine kinetische Fluoreszenz basierenden Ca2 + Mobilisierung Assay, G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten und Antagonisten allosterische Modulatoren zu identifizieren

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Hochdurchsatz-Nitrobenzoxadiazole-Label Cholesterin-Efflux-Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

Einsatz von Biochip mikrofluidischen Technologie zur Erkennung Serum Allergen-spezifische Immunglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...

Improved Renal Denervation Mitigated Hypertension Induced by Angiotensin II Infusion

Verbesserte renale Denervierung milderte Hypertonie durch Angiotensin-II-Infusion

The benefits of renal sympathetic denervation (RDN) on blood pressure have been proved in a large number of clinical trials in recent years. However, the ...