Name: v3 stain-free workflow for a practical, convenient, and reliable total protein loading control in western blotting
Uploaded: 2013-12-30T20:30:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi og Jeff Durban for deres kritiske gennemgang og redigering af dette manuskript. Forfatterne takker også Allison Schwartz for teknisk support.

1. Forberedelse af proteinprøve
(En typisk procedure for at udvinde proteiner fra cellekultur er beskrevet)
<ol><li>Placer HeLa cellekultur parabol i is og vask cellerne med iskolde Tris-buffered Saltvand (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl).</li>
	<li>Aspirat TBS, tilsæt derefter 1 ml pr. 100 mm skål iskold RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS) suppleret med fosfatase- og proteasehæmmere.</li>
	<li>Skrab vedhængende celler af skålen ved hjælp af en kold plastcelleskraber; overfør forsigtigt celleaffjedringen til et forkølet mikrocentrifugerør.</li>
	<li>Der skal opretholdes konstant omrøring i 30 minutter ved 4 °C på en rotator.</li>
	<li>Spin ved 16.000 x g i 20 min. i en forkølet centrifuge på 4 °C.</li>
	<li>Fjern forsigtigt røret fra centrifuge og læg det på is. Overfør supernatanten til et frisk rør, der holdes på is, og kassér pelleten.</li>
	<li>Fjern et lille volumen (10-20 μl) lysat for at udføre en proteinanalyse. Proteinkoncentrationen bestemmes for hver prøve ved hjælp af RC DC-analysesættet.</li>
	<li>Hvis det er nødvendigt, skal proteinprøverne til langtidsopbevaring til -20 °C tilholdes. Gentagne fryse- og optøningscyklusser forårsager proteinforringelse og bør undgås.</li>
	<li>Tag ca. 20 μg af hver prøve, tilsæt et lige stort volumen på 2x Laemmli Prøvebuffer (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0,004% bromophenol blå, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8).</li>
	<li>Hver celle lysat opvarmes i prøvebuffer ved 95 °C i 5 min.</li>
	<li>Centrifuge ved 16.000 x g i en mikrocentrifuge i 1 min.</li>
</ol>2. Gel elektroforese med pletfri geler (~30 min.
<ol><li>Tag et kriterium TGX Enhver KD pletfri præfabrikeret gel (en midi format gel), fjern kammen og båndet fra bunden af kassetten.</li>
	<li>Kassetten anbringes i criterioncellen, og det integrerede øverste bufferkammer fyldes med 60 ml løbebuffer (25 mM Tris, 190 mM glycin, 0,1% SDS, pH 8,3). Skyl brøndene med løbebuffer.</li>
	<li>Fyld hver halvdel af den nederste buffertank med 400 ml kørende buffer til den markerede påfyldningslinje.</li>
	<li>Lad proteinprøverne og passende proteinmarkører.</li>
	<li>Læg låget på tanken, og juster de farvekodede bananpropper med tilsvarende donkrafte på låget.</li>
	<li>Kør gelen i ~ 30 min ved 200 V eller 20 min ved 300 V.</li>
</ol>3. Pletfri Gel Imaging Brug af Chemidoc MP System til at kontrollere proteinseparationskvalitet (~5 min.
<ol><li>Fjern gelkassetten fra cellen. Brug gelkassetteåbningsværktøjet i Criterion Cell-låget til at åbne kassetten og slippe gelen.</li>
	<li>Påfør et par milliliter vand til midten af UV-prøvebakken på ChemiDoc MP-billedfilen. Løft forsigtigt gelen fra kassetten og læg den på bakken.</li>
	<li>Start Image Lab-softwaren, og hent det pletfrie gelbillede (Figur 1A) med følgende indstillinger: Anvendelse: pletfri gel Gel aktiveringstid: 1 min. Billedbehandlingsområde: kriteriumgel Billedeksponeringstid: optimeres automatisk til de mest intense bånd</li>
	<li>Gelen tages ud af prøvebakken, og der straks overføres trin.</li>
</ol>4. Proteinoverførsel med Trans-Blot Turbo System (~10 min.)
<ol><li>Åbn en Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Pack; læg den nederste stak (som omfatter membranen) på bunden af overførselskassetten.</li>
	<li>Placer gelen oven på membranen, læg den øverste stak på gelen, og rul bobler ud.</li>
	<li>Læg låget på kassettebasen, og drej skiven for at låse den.</li>
	<li>Sæt kassetten i blotterrummet.</li>
	<li>Start overførslen ved at vælge et forudindstillet Turbo-program og vælge Kriteriegelstørrelsen (midi), og tryk derefter på RUN. En typisk kørsel tager kun 7 minutter.</li>
	<li>Når overførslen er overstået, skal du skille blottingssandwichen ad og placere både blot og gelen i en beholder med deioniseret vand.</li>
</ol>5. Pletfri Gel og Blot Imaging Brug af Chemidoc MP System til at kontrollere proteinoverførsel effektivitet og kvalitet (~ 5 min)
<ol><li>Placer gelen efter overførslen på prøvebakken på ChemiDoc MP-billedlinjen.</li>
	<li>Start Image Lab-softwaren, og indfang det pletfri billede af gelen efter overførslen (Figur 1B) med følgende indstillinger: Anvendelse: pletfri gel Gel aktiveringstid: ingen Billedbehandlingsområde: kriteriumgel Billedeksponeringstid: samme eksponeringstid for det forføre gelbillede</li>
	<li>Fjern gelen fra prøvebakken, og billede derefter blot (Figur 1C) med følgende indstillinger. Hold skamplet vådt med et par dråber vand eller TBST, når du tager billedbehandling. Anvendelse: pletfri skamplet Billedbehandlingsområde: kriteriumgel Billedeksponeringstid: optimeres automatisk til de mest intense bånd</li>
	<li>Tag blottingmembranen ud af prøvebakken, og læg den i en beholder med TBST (0,1% Tween 20 i TBS).</li>
</ol>6. Antistof inkubation
<ol><li>Bloker ved at placere blot i en opløsning på 3% kvæg serum albumin (BSA) i TBST på værelse temp i 1 time.</li>
	<li>Bloten inkuberes natten over ved 4 °C i den opløsning, der indeholder det primære museantistof, der er rejst mod det første målprotein og det primære kaninantistof, der er rejst mod det andet målprotein.</li>
	<li>Hæld opløsningen, der indeholder det primære antistof, ud. Derefter vaskes blot ved omrøring i 20 ml TBST i 5 min. Gentag 4x for i alt 5 vasker.</li>
	<li>Inkuberes i 1 time ved rumtemperatur i den sekundære antistofopløsning, der indeholder et Dylight 650 konjugeret gede-antimus-antistof og et Dylight 549 konjugeret gedeantikaninantistof.</li>
	<li>Hæld opløsningen, der indeholder det primære antistof, ud. Derefter vaskes blot ved omrøring i 20 ml TBST i 5 min. Gentag 4x for i alt 5 vasker.</li>
</ol>7. Billeddannelse og dataanalyse af Image Lab Software-Total Protein Normalisering (~ 5 min)
<ol><li>Anskaf et fluorescerende billede af blot (Figur 1E) ved at åbne en ny multikanalprotokol, konfigurere tre lysstofrørskanaler og køre protokollen. Kanal 1: Anvendelse: blot Dylight 650 Billedbehandlingsområde: kriteriumgel Billedeksponeringstid: optimeres automatisk til de mest intense bånd Kanal 2: Anvendelse: blot Dylight 549 Billedbehandlingsområde: kriteriumgel Billedeksponeringstid: optimeres automatisk til de mest intense bånd Kanal 3: Anvendelse: pletfri skamplet Billedbehandlingsområde: kriteriegel Billedeksponeringstid: optimeres automatisk til de mest intense bånd</li>
	<li>Klik på ikonet Normalisering i analyseværktøjsboksen, og klik på Ja for at registrere baner og bånd.</li>
	<li>Vælg og brug "Lanes and Bands-værktøjer" til at foretage justeringer af baner og bånd, hvis det er nødvendigt.</li>
	<li>Vælg et pletfrit billede som normaliseringskanal.</li>
	<li>Vælg MW-analyseværktøjer, og tildel MW-standardbanerne ved at markere felterne under dem.</li>
	<li>Klik på analysetabellen på værktøjslinjen for at få vist de normaliserede diskenheder. Alle beregninger udføres automatisk af softwaren, herunder normaliseringsfaktoren og normaliserede diskenheder. Målproteinbåndets intensitetsværdier justeres nu for variation i proteinbelastningen. Dette vil give mulighed for nøjagtige sammenligninger af målproteiner blandt prøverne.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls:+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting.">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li><li>Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+four+housekeeping+proteins+in+elderly+patients+with+schizophrenia.">Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia.</a> J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).</li><li>Casta&#241;o, Z., Kypta, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+Proteins:+Limitations+as+References+During+Neuronal+Differentiation.">Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation.</a> Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).</li><li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+plasma+membrane+Ca-ATPase+and+stromal+interacting+molecule+1+expression+levels+for+Ca2++signaling+in+dystrophic+mdx+mouse+muscle.">Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).</li><li>Dittmer, A., Dittmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-actin+is+not+a+reliable+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis.</a> Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).</li><li>Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+carnosine+on+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+human+skeletal+muscle+fibers.">Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers.</a> J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).</li><li>Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+and+function+of+erythropoietin+receptors+in+the+kidney.">Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).</li><li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+proteins:+a+preliminary+study+illustrating+some+limitations+as+useful+references+in+protein+expression+studies.">Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies.</a> Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+genes;+expression+levels+may+change+with+density+of+cultured+cells.">Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).</li><li>G&#252;rtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stain-Free+Technology+as+Normalization+Tool+in+Western+Blot+Analysis.">Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis.</a> Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).</li><li>Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+SYPRO+Ruby-+and+Flamingo-stained+polyacrylamide+gels+to+Western+blot+analysis.">Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis.</a> Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).</li><li>Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kowalczykowski+SC+BRCA2+is+epistatic+to+the+RAD51+paralogs+in+response+to+DNA+damage.">Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage.</a> DNA Repair. , (2013).</li><li>Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+proteins+in+human+placenta:+general+protein+stains+are+the+benchmark.">Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark.</a> Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).</li><li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+temperature,+oxidative+stress,+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers.">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li><li>Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Oligomerization+Disrupting+Mutation+in+CRY&#913;A+Associated+with+Congenital+Cataract+in+a+South+Australian.">Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRY&#913;A Associated with Congenital Cataract in a South Australian.</a> , (2012).</li><li>Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+rice+reference+proteins+for+western+blotting.">Identification and validation of rice reference proteins for western blotting.</a> J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+varies+with+age+in+glycolytic+muscles+of+rats.">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).</li><li>Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+of+troponin+I+(fast)+increases+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+in+fast-twitch+muscle+fibres+of+rats+and+humans.">S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans.</a> J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).</li><li>Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).</li><li>Neill, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+Data+are+not+created+Equal.">All Data are not created Equal.</a> J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).</li><li>P&#233;rez-P&#233;rez, R., L&#243;pez, J. A., Garc&#237;a-Santos, E., Camafeita, E., G&#243;mez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fern&#225;ndez-Real, J. M., Peral, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+suitable+reference+proteins+for+expression+studies+in+human+adipose+tissue+with+relevance+to+obesity.">Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Pitfalls+of+Internal+Controls:+Validation+of+Reference+Genes+for+Analysis+by+qRT-PCR+and+Western+Blot+throughout+Rat+Retinal+Development.">Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Romero-Calvo, I., Oc&#243;n, B., Mart&#237;nez-Moya, P., Su&#225;rez, M. D., Zarzuelo, A., Mart&#237;nez-Augustin, O., de Medina, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Ponceau+staining+as+a+loading+control+alternative+to+actin+in+Western+blots.">Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots.</a> Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).</li><li>Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+GAPDH+regulation+in+tumor-cells+of+different+origin+under+hypoxic+conditions+in-vitro.">Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro.</a> BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).</li><li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+western+blots.">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots.</a> Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).</li><li>Welinder, C., Ekblad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+staining+as+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Coomassie staining as loading control in Western blot analysis.</a> J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).</li><li>You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+soybean+trypsin+inhibitor+as+an+external+loading+control+for+Western+blot+analysis+of+tear+proteins:+application+to+corneal+disease.">Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease.</a> Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).</li></ol>

Forfatterne, Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond, og Ning Liu er ansatte i Bio-Rad Laboratories, Inc.

Den V3 pletfri protokol, der er beskrevet ovenfor, er til multipleksering af fluorescerende vestlig blotting. Det kan også anvendes i vestlige blotting ved hjælp af chemiluminescent afsløring. I multiplex fluorescerende vestlige blot protokol, den pletfri blot billeder er erhvervet på to tidspunkter: 1) lige efter protein overførsel; 2) ved multiplex fluorescerende billeddannelse trin efter antistof inkubation. Det første pletfri billede bruges til at beregne overførselseffektivitet, og det andet pletfrie billede bruges som lastekontrol. Når chemiluminescent-metoden anvendes, er det ikke muligt at tage et multiplexbillede til de pletfri og målproteinsignaler, fordi chemiluminescent-signalet også vises i den pletfri kanal. I dette tilfælde anbefaler vi at bruge det pletfri billede, der er taget lige efter proteinoverførselstrinnet til lastningskontrol og normaliseringsanalyse.
V3 vestlige arbejdsgang giver følgende unikke fordele i forhold til den traditionelle vestlige blot workflow, der bruger husholdningsproteiner som lastning kontrol:
For det første giver V3-arbejdsgangen en praktisk, praktisk og mere pålidelig belastningskontrol for at validere ændringerne i niveauet af det protein, der er af interesse. V3-protokollen bruger en total proteinbelastningskontrol til at normalisere niveauet af det protein af interesse, der måles i hver prøve. Det undgår to faldgruber ved at bruge husholdningsproteinerne som lastningskontrol: mættet immunodetection og inkonsekvente husholdningsproteinudtryksniveauer blandt prøverne under visse eksperimentelle forhold. Stripning og reprobing trin med antistoffer rettet mod husholdning er ikke længere nødvendigt. Ved hjælp af pletfri teknologi er der ingen grund til at plette og plette en skamplet med pletter som Coomassie eller Sypro Ruby til total proteinmåling. Det tager kun et par sekunder at erhverve en skamplet billede og omkring 5 minutter til at gøre den samlede protein normalisering ved hjælp af Image Lab software.
For det andet giver V3-arbejdsgangen forskerne mulighed for at tage bedre kontrol over den vestlige procedure, fordi den gør proceduren mere gennemsigtig og introducerer flere checkpoints til kvalitetskontrol. Ved hjælp af pletfri teknologi kan forskere visualisere deres proteinprøver på både gelen og blot. Forskere kan vurdere proteinprøvens integritet (forringet eller ej), adskillelseskvalitet (udfældet eller ej), overførselseffektivitet og overførselskvalitet (endda overførsel eller ej). Disse checkpoints hjælper forsker opsige eksperimentet, når de ser store fejl i processen og undgå at spilde tid på dårlige prøver og pletter. Denne teknologi hjælper også forskere med at vurdere, om der er en betydelig mængde proteintab efter membranstripping, og om blot er egnet til at genprobere et andet mål 4.
Her er et par tips til at sikre god oplevelse og kvalitet data ved hjælp af V3 vestlige arbejdsgang.
<ol><li>Billede gelen umiddelbart efter gel løb. Gelen må ikke suges i en buffer før den første billeddannelse i proceduren, da den kan vaske pletblandingen væk.</li>
	<li>Brug det samme billedområde til at hente alle billeder i protokollen. Dette vil gøre det muligt for softwaren at overlejre billeder til dataanalyse såsom total protein normalisering.</li>
	<li>Sørg for, at eksponeringstiden er konsistent, når der dannes billeddiagnossivelser af for- og efteroverførselsgelerne. Dette vil gøre det muligt for softwaren at måle overførselseffektiviteten kvantitativt.</li>
	<li>Hold membranen våd med et par dråber vand eller TBST, når du køber blot-billedet. Dette vil undgå mulige beskidte baggrundsproblemer for målproteindetektion.</li>
	<li>Brug PVDF-membranen med lavt lysstofindhold til multipleksering af fluorescerende vestlig blotting.</li>
</ol>Det er vigtigt at bemærke, at det pletfrie molekyle efter UV-aktivering er uigenkaldeligt bundet til tryptofanrester. Denne irreversible ændring kan potentielt påvirke antigengenkendelsen, når der bruges monoklonale antistoffer, hvis epitopen indeholder tryptofan. Polyklonale antistoffer vil sandsynligvis ikke blive påvirket, fordi de genkender flere epitoper på antigenet. Ubundne pletfri molekyler vaskes let af gelen og membranen og vil derfor ikke forstyrre antistof-antigeninteraktioner.
Afslutningsvis gør V3 vestlige arbejdsgang den vestlige skamplet proces hurtigere, mere gennemsigtig, kvantitative og mere pålidelige. Forskere kan nu nemt anvende total proteinbelastningskontrol i et vestligt blot-eksperiment for at gøre deres data mere troværdige. Den V3 pletfri arbejdsgang er blevet vedtaget af en række laboratorier, og deres publikationer har vist, at tidsskrifter accepterer pletfri data som lastning kontrol i det vestlige blot22,17,7,8,5,23,18,15.

Western blot er en meget nyttig teknik9, men der er to store udfordringer med vestlig blotting: lang og arbejdskrævende proces og kvalitet af data. En traditionel protokol kræver ca. 2 dage. Det involverer mange trin, herunder prøveforberedelse, gelstøbning, proteinelektroforese og overførsel, membranblokering efterfulgt af antistofinkubation, billeddannelse og ganske ofte stripning, reprobing og endelig dataanalyse. Gennem hele denne proces er der ingen pålidelige og fleksible værktøjer til processtyring. Som sådan kan fejl introduceres på hvert trin, og disse fejl har potentialet til at generere dataartefakter; Derfor er lastningskontrol afgørende for vestlig blotting for at identificere og rette fejlene. Belastningskontrollen udføres normalt ved at kontrollere proteinniveauet for et referenceprotein i hver prøve for at se, om det er ligeligt præsenteret. Folk bruger ofte husholdningsproteiner, såsom β-actin, β-tubulin, GAPDH, som lastningskontrol.
Kvaliteten af vestlige blot data afhænger af pålidelig lastning kontrol. Men der er to legitime betænkeligheder ved anvendelsen af husholdningsproteiner til lastningskontrol: 1) den antistofbaserede immunodesektion af husholdningsproteinbåndene er ofte mættet, og derfor kan man ikke skelne mellem belastningsforskellene mellem prøverne30; 2) niveauet for husholdningsproteinudtryk kan variere i prøverne under visse forsøgsbetingelser , for eksempel siRNA-behandling, celledød, celledifferentiering osv. På grund af disse bekymringer kræver videnskabelige tidsskrifter nu, at "der skal anvendes passende reagenser, kontroller og billeddannelsesmetoder med lineære signalområder" (Naturretningslinje). Tilsvarende beder redaktører fra Journal of Clinical Investigation om mere pålidelige lastekontroller24. Af disse grunde skal et husholdningsprotein valideres for at blive brugt som lastekontrol. For det første skal man sørge for, at det måles i det lineære dynamiske område af immunodetection metode14,29. For det andet skal man sørge for, at det udtrykkes konsekvent i alle prøver26,31,25,19,20.
En alternativ løsning til en pålidelig lastekontrol er at bruge total proteinmåling fra blot. Nogle forskere har plettet blots med samlede proteinpletter, såsom Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S og pletfri teknologi til at måle det samlede proteinsignal i hver vognbane som lastningskontrol16,20,13,27,1,4,12. Den samlede proteinbelastningskontrol undgår de faldgruber, der er forbundet med husholdningsproteiner. For det første er det en sand afspejling af mængden af protein, der er indlæst for hver prøve. For det andet udviser den samlede proteinplet et fremragende lineært dynamisk område i det fælles belastningsområde for western blot-analyse (10-50 μg protein i et komplekst cellelysat) og differentierer nøjagtigt belastningsforskellen mellem prøverne12.
Pletfri teknologi er en ny total protein farvning metode, hvor en unik forbindelse blandes i acrylamid gel løsning og jævnt fordelt i støbt gel. Når elektroforese er afsluttet, udsættes gelen for UV-lys i mindst 1 minut, så pletblandingen reagerer med tryptofanresterne i proteinet. Proteinerne bliver spændende under UV-lys for at give et stærkt fluorescerende signal, der kan visualiseres og kvantificeres i en pletfri aktiveret billedsprog som ChemiDoc MP-systemet. Selve den pletfri forbindelse absorberer imidlertid ikke UV-lys, hvilket resulterer i lav baggrund af gelbilledet. Ændringen af tryptofanresterne er irreversibel, og proteiner kan visualiseres ikke kun i gelen, men også på blot når som helst efter proteinoverførsel.
Den pletfri teknologi anvendes i V3 Western Workflow (Figur 1) til at løse de store klager over den traditionelle arbejdsgang, især bekymringerne ved at bruge husholdningsproteiner som lastningskontrol. Ved hjælp af denne arbejdsgang kunne man: 1) køre en gel i ca. 20-30 minutter, 2) kontrollere prøveintegritet og proteinseparationskvalitet på 5 minutter efter gelkørsel; 3) overføre proteiner i 3-10 min; 4) kontrollere overførselseffektiviteten kvantitativt og 5) vigtigst af alt, validere ændringer i niveauet af protein af interesse ved hjælp af total protein loading kontrol.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>567-8093 </td>
 <td>Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4157 </td>
 <td>Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-5061</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Criterion Cell </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>165-6100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4155</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChemiDoc MP System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-8280</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

v3 stain-free workflow for a practical, convenient, and reliable total protein loading control in western blotting

Den vestlige skamplet er en meget nyttig og bredt vedtaget lab teknik, men dens udførelse er udfordrende. Arbejdsprocessen er ofte karakteriseret som en "sort boks", fordi en eksperimentalist ikke ved, om den er blevet udført korrekt før det sidste af flere trin. Desuden er kvaliteten af vestlige blot data undertiden udfordret på grund af mangel på effektive kvalitetskontrol værktøjer på plads i hele den vestlige blotting proces. Her beskriver vi V3 vestlige workflow, som anvender pletfri teknologi til at løse de store problemer i forbindelse med den traditionelle vestlige blot protokol. Denne arbejdsgang giver forskere: 1) at køre en gel i ca 20-30 min; 2) at visualisere prøveseparationskvaliteten inden for 5 minutter efter gelløbet 3) at overføre proteiner i 3-10 min; 4) at kontrollere overførselseffektiviteten kvantitativt og vigtigst af alt 5) for at validere ændringer i niveauet af det protein af interesse ved hjælp af total protein loading kontrol. Denne nye tilgang eliminerer behovet for stripning og reprobing af skamplet for husholdningsproteiner som β-actin, β-tubulin, GAPDH osv. V3 pletfri arbejdsgang gør den vestlige skampletproces hurtigere, gennemsigtig, mere kvantitativ og pålidelig.

1. Vurdering af prøveintegritet, proteinseparationskvalitet og overførselseffektivitet med pletfrie gelbilleder.
Proteinekstrakt fra HeLa celler blev adskilt ved 300 V i 20 min på en 18-godt Kriterium AnyKD TGX pletfri gel. Proteinprøverne blev lastet 3x ved fire forskellige mængder (Vognbane 1-3, 40 μg; Vognbane 4-6, 30 μg; Vognbane 7-9, 20 μg; Vognbane 10-12, 10 μg). Gelen blev aktiveret under UV-lys i 1 min. Figur 2A viser det gelbillede, der er erhvervet lige efter proteinadskillelse. Proteinprøvens integritet(f.eks. nedbrydning) og adskillelseskvalitet(f.eks. proteinudfældning) kan visuelt vurderes med dette gelbillede. Proteiner blev derefter overført i 7 minutter til en nitrocellulosemembran ved hjælp af Trans-Blot Turbo. Figur 2B viser det pletfri billede af gelen efter overførslen. Begge billeder blev erhvervet med samme eksponeringstid (6,8 sek.). Bane 3 og 12 blev udvalgt til at måle overførselseffektiviteten. Ved hjælp af lydstyrkeværktøjet i Image Lab-softwaren blev der tegnet en rektangulær boks (blå) til at dække vognbane 3 og 12 på begge gelbilleder. Beregningen baseret på volumenværdierne fra disse bokse viste, at overførselseffektiviteten for begge baner var 80% (Figur 2C). I dette eksperiment blev AnyKD TGX gel udvalgt til at studere små til mellemstore målproteiner, og den blev ikke optimeret til overførsel af store proteiner. Optimering af overførselseffektiviteten ville kræve brug af lavere procent gel(f.eks. 4-20%) og/eller en justering af overførselstiden for at lette overførslen af store proteiner. 2. Stain-fri total protein loading kontrol er et pålideligt alternativ til husholdning lastning kontrol i vestlige blotting at kvantificere en lille ændring i niveauet af protein af interesse.
MCM-7 er en DNA-licens replikationsfaktor, hvis niveau falder med 20-50% i lymfoblastoidcellelinjer (LCL) efter bestrålingsbehandling. I dette eksperiment blev lysater (30 μg hver) af fire kontrol- og bestrålingsbehandlede lymfoblastoidcellelinjekulturer (LCL) adskilt på et 12-godt Criterion AnyKD TGX pletfri gel. Gelen blev aktiveret i 1 min under UV-lys og overført af Trans-Blot Turbo til en PVDF membran til immunoblotting. Husholdningsproteinet GAPDH (grøn) blev undersøgt med et kaninantistof (Cell Signaling Technology, USA, 1:2,500) og en Dylight 549 konjugeret ged-anti-kanin antistof (Rockland, USA, 1:20,000). Det protein af interesse MCM-7 (rød) blev undersøgt ved hjælp af en mus antistof (Abcam, USA, 1:1,000) og en Dylight 649 konjugerede Ged-anti-mus antistof (Rockland, 1:10,000).
Figur 3A viser et multiplekslysatorbillede af totalproteiner (blå), MCM-7 (rød) og GAPDH (grøn), der er påvist i fire kontrol- og bestrålingsbehandlede LCL-prøver. Figur 3B er et pletfrit billede af samme skamplet, der viser de samlede proteinmønstre i hver prøve (30 μg). Image lab software valgt prøven baner (blå bokse) til at måle MCM-7, GAPDH, og samlede protein volumen i hver vognbane. MCM-7 niveauerne blev normaliseret enten mod den pletfri totale proteinmåling eller mod GAPDH. De normaliserede MCM-7 proteinniveauer blev statistisk analyseret, og det gennemsnitlige MCM-7 proteinbåndvolumen og standardafvigelse (n=4) er vist i diagrammet (Figur 3C). Begge normaliseringsmetoder afslørede et lille fald (ca. 25%) i MCM-7 proteinniveauer efter bestrålingsbehandling. Dataene med den samlede proteinnormalisering udviste en mindre standardafvigelse end med GAPDH som lastekontrol.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> Figur 1. V3 Vestlige Arbejdsproces. V3-arbejdsprocessen vises i venstre kolonne i 4 trin. De vigtigste instrumenter og reagenser, der bruges i arbejdsgangen, vises på hvert trin. Den anslåede tid for hvert trin er også inkluderet. Den højre kolonne viser, at der kan genereres mindst 4 billeder i V3-arbejdsprocessen. Brugen af hvert stykke data er beskrevet. De pletfri billeder af pretransfer gel, post-transfer gel, og blot (A, B, C) kan ikke genereres let med traditionelle vestlige blotting teknikker; Disse billeder og data giver vigtige oplysninger og checkpoints langs proceduren for at forbedre videnskabsmandens kontrol og reproducerbarhed af vestlige blot workflow. Målproteinsignalerne kan opfanges enten på et chemiluminescent blot image (D), hvis et HRP-konjugeret sekundært antistof blev anvendt til påvisning eller på et fluorescerende blotbillede (E), hvis der blev udført multiplekserende vestlig blotting for at detektere mere end et målprotein samtidigt på samme skamplet. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> Figur 2. Pletfri billeder af foroverførsler og geler efter overførslen i V3 vestlige arbejdsgang for at vurdere prøveintegritet, separationskvalitet og overførselseffektivitet. (A)Foroverfør gel pletfri billede. (B) Efter overførsel gel pletfri billede. (C) Måling af proteinoverførselseffektivitet.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> Figur 3. Sammenligning af pletfri total proteinmåling med GAPDH immunodetection som belastningskontroller for at normalisere niveauet af protein af interesse. (A) Fluorescerende vestlige blot billede. (B) Pletfri blot billede. (C) Normaliserede MCM-7 proteinniveauer. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a>

Watch this Scientific Journal Video about V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting at JoVE.com

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

V3 workflow er en vestlig blot procedure ved hjælp af pletfri geler. Den pletfri teknologi gør det muligt for forskere at visualisere proteinseparationskvaliteten, for at verificere overførselseffektiviteten og vigtigst af alt at validere ændringen i det protein, der er af interesse, ved hjælp af total proteinkvantificering som en pålidelig belastningskontrol.

V3 Pletfri arbejdsgang til en praktisk, praktisk og pålidelig total proteinbelastningskontrol i vestlig blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

Research

JoVE Journal

Biology

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ Fitness Analyse Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

En bekvem og General Expression Platform for produktion af secernerede proteiner fra humane celler

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Regelmæssig pleje og vedligeholdelse af en zebrafisk (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratorium: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

En praktisk og Novel metode til at udvinde Genomisk DNA fra Blood Collection Kits til Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

En praktisk vejledning til fylogeni for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Den hurtigste Western i byen: et moderne twist på den klassiske Western Blot-analyse

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

En guide til Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting med fejlfinding Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...