Name: isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus
Uploaded: 2013-09-19T21:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus at JoVE.com

私たちは、CDR2抗体を提供するための胸腺サンプルとブルーノKyewski（DKFZ、ハイデルベルグ、ドイツ）を私たちに提供するための胸部心臓血管外科、大学クリニックチュービンゲンの外科医に感謝しています。また、仕分け施設（チュービンゲン大学）からハンス·イェルクBühringとサブリナグリムに感謝したいと思います。この作品は、SFB 685とHertie財団によってサポートされていました。

1。ツール、酵素溶液、およびバッファの準備前のプロトコルを先頭に次の分取の手順を実行します。 <ol><li>ツール 、清潔で乾燥し、次のツールをオートクレーブし、使用するまで無菌包装に保管してください。 <ol><li>胸腺組織を切断するための湾曲した又はストレートのどちらかのヒントに小さな鋭いはさみ。組織を処理するための鋸歯状の先端の小さな湾曲し?...

<ol>
	<li>Miller, J. F. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+of+thymus+function+and+of+thymus-derived+lymphocytes.">The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes.</a> Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).</li><li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction.">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).</li><li>Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+thymus+contains+2+distinct+dendritic+cell+populations.">Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations.</a> Blood. 97, 1733-1741 (2001).</li><li>Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medullary+Epithelial+Cells+of+the+Human+Thymus+Express+a+Highly+Diverse+Selection+of+Tissue-specific+Genes+Colocalized+in+Chromosomal+Clusters.">Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).</li><li>Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells.">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).</li><li>Stoeckle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+S+dominates+autoantigen+processing+in+human+thymic+dendritic+cells.">Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells.</a> Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).</li><li>Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+trans-differentiation+of+thymus+cells+into+parathyroid-like+cells+without+genetic+manipulation.">Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).</li><li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Analysis+of+Complex+Thymus+Stromal+Cell+Populations:+Rapid+Thymic+Epithelia+Preparation+Characterizes+Radiation+Injury.">Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury.</a> Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).</li><li>Bendriss-Vermare, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+thymus+contains+IFN-&#945;-producing+CD11c-,+myeloid+CD11c+,+and+mature+interdigitating+dendritic+cells.">Human thymus contains IFN-&#945;-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).</li><li>Schmitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+characterization+of+human+thymic+dendritic+cell+subsets.">Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets.</a> Immunobiology. 212, 167-177 (2007).</li><li>Dzionek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDCA-4:+Three+Markers+for+Distinct+Subsets+of+Dendritic+Cells+in+Human+Peripheral+Blood.">BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood.</a> The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).</li><li>Wu, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+thymic+dendritic+cells.">Heterogeneity of thymic dendritic cells.</a> Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).</li><li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium.">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).</li><li>Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+MHC-peptide+matrix+of+central+tolerance+in+the+human+thymus.">Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus.</a> Nature Communications. , (2013).</li></ol>

ここで説明するプロトコルは、ゴッターら 4が発行するプロトコルの改変である。プロトコルにおける重要なステップは、条件や組織の初期準備だけでなく、パーコール密度分離である。私たちは強く、採取後できるだけ速やかに組織を処理することをお勧めします。これは、清掃や組織を切断する際に高速だが、十分に機能することが重要です。ステップ2.3で説明した胸腺細...

胸腺はT細胞の発達が起こる器官である。胸腺の活動はまだ古い時代に検出することができますが、それが連続して脂肪に置き換えるになったとき、その相対的で絶対的なサイズは、年齢とともに減少する。免疫応答のためのその重要性は1960年代初頭1で示された。 T細胞レパートリーは、主に機能性および自己寛容T細胞レパートリー2で、その結果、T細胞の開発に生死キューを提供胸腺APCの異なる種類に対するペプチド-MHC複合体とT細胞受容体の相互作用を介して形成されている。 ヒト胸腺細胞の約98％は、胸腺細胞とも呼ばれるT細胞を開発している。残りの2％は、TEC（皮質、髄質、被膜下）、骨髄および形質DC（MDC、PDC）、マクロファージ、B細胞、成熟した再循環T細胞、顆粒球、様々含む異なる細胞型の数で構成されFibroblasts、内皮細胞および筋肉、神経細胞および気道上皮（ 図1）のような他の組織からの細胞に似た発現表現型を有する上皮細胞を非常にまれ。これらのうち、TECとDCは通常の胸腺に見られる主要なAPCタイプです。近年では、文化や分子プロファイリングのためのこれらのAPCタイプの精製は、より多くの関心を集めている。それらの低い周波数に、詳細な分析のためにこれらの細胞型のいずれかの単離は、効率的で再現可能で費用効果の高い手順を必要とする。ここで紹介する方法は、以前に発表された研究3,4からの変更です。 任意の他の組織と同様に、胸腺からの細胞抽出は、単一細胞の懸濁液を得るために、酵素的に細胞 - 細胞および細胞 - マトリックス相互作用ネットワークを脱凝集することによって達成することができる。良好な解離効率、細胞収量、細胞生存率および細胞秒の保持のような特定のパラメータがあります重要であるとurfaceマーカーは、これらの稀な細胞集団の単離の成功のために最適化される必要がある。 このプロトコルでは、DCおよびTECサブセットの単離は、機械的破壊及び酵素消化によって組織の単一細胞懸濁液を作製することによって行われる。私たちは、組織を一緒に保持している天然コラーゲンを打破するために、様々な酵素活性のバランスの取れた比率がクロストリジウムヒストリからコラゲナーゼAを使用しています。 DNアーゼIは死細胞（胸腺細胞は非常に敏感である）からの遊離DNAによる細胞凝集を減少させるために酵素液に含まれています。我々はまた、組織の解離剤により補助機械的および酵素組織治療を含む一般的な酵素組織消化の代替アプローチを提供する。単一細胞懸濁液を、次いで、細胞の低密度画分（LDF）の富化のための単一のパーコール密度遠心分離にかけられる。細胞のこの画分から、DCはFを染色することによって単離することができるまたはDC表面マーカー（ すなわち、のCD11c +）および磁気分離または蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて。胸腺細胞の大部分を含むリンパ系細胞とは異なり、TECは高レベルでCD45を発現しないが、上皮細胞接着分子EpCAMのために陽性である。 CTECは、CDR-2（皮質樹状網状-2）により認識まだ未定義の抗原抗体4,5および幾分低いEpCAM発現の発現によって髄TECと区別することができる。のEpCAMおよびCDR2の差動共発現は、6ソーティング高速セルを介してこれらのTECサブセットの効率的な単離を可能にする。 ここで紹介するプロトコルは、人間の胸腺組織に最適化されています。 FACS選別を使用した場合の手順の持続時間は、組織の量及び実験者の能力ならびにセルソーターの速度に依存する。通常は、DCを単離するためのプロトコルは、5以内に完了することができます-6時間および8〜10時間でのTECの単離のため。胸腺組織からDCおよびTECサブセットの分離は、時間に敏感である。より高速な単離操作、優れた細胞の状態。最後に、単離された細胞は、mRNAの比較研究およびタンパク質発現、PCR実験では、タンパク質の単離、分子プロファイリング（ すなわちトランスクリプトミクス、マイクロRNA分析）、ならびに細胞培養6のようなさらなる調査のために使用することができる。 倫理に関する声明ヒト胸腺組織と連携できるようにするために研究者は、組織は通常、未成年から取得されるため、ローカル倫理委員会や責任ある当局だけでなく、ドナーの書面によるインフォームドコンセント（または通常は彼または彼女の両親からの承認を得る必要がある子どもたち）。さらに、すべてのヒト組織は、潜在的に感染し、適切な処置などなど 、手袋での作業のように、注意が必要であるとして処理する必要があります。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents and Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-Gold</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PAA</td>
			<td>K41-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 103 586 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II bovine pancreatic</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 104 159 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 10x in PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-001</td>
			<td>stock conc. 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CDR2 (purified)</td>
			<td>Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>labeled with Alexa Fluor 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD45 (Pacific Blue)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human EpCAM (APC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD11c (PE)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>for tissue dissociator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1.130 g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare, Life Sciences</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamunex 10%</td>
			<td>Tajecris-Biotherapeutics</td>
			<td>G120052</td>
			<td>1:10 pre-dilution, use 20 &#956;l/1 x 106cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millex GS</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td>Syringe driven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>Pump driven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml PC oak ridge centrifuge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml PP conical tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm 5 ml test tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td>FACS stainings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INSTRUMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Evolution R6 (rotor)</td>
			<td>Kendro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator REAX 2</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093 235</td>
			<td>tissue dissociator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus

このプロトコルでは、ヒト胸腺から樹状細胞（DC）および上皮細胞（TEC）を単離する方法を提供する。 DCとTECは、主要な抗原提示細胞の正常胸腺に見られる（APC）型であり、それはよく、彼らは胸腺選択の際に異なる役割を果たしていることが確立されている。これらの細胞は、胸腺における異なる微小環境に局在化され、各APC型は、細胞のわずかな集団を構成している。さらに、これらの細胞型の生物学を理解するために、これらの細胞集団の特徴付けは非常に望ましいしかし、それらの低い周波数に、これらの細胞型のいずれかの単離は、効率的かつ再現可能な手順を必要とする。このプロトコルは、多様な細胞の性質の特性に適した細胞を得る方法を詳しく説明します。胸腺組織を機械的に破壊され、酵素消化の異なるステップの後に、得られた細胞懸濁液を、パーコール密度遠心分離工程を用いて濃縮される。骨髄DC（CD11cの単離のための&lt;商標&gt; +）、低密度画分（LDF）からの細胞を磁気細胞選別により免疫選択されている。 TEC集団（MTEC、CTEC）の濃縮は、特定の細胞マーカーを用いて細胞ソーティング（FACS）を蛍光活性化を介してそれらのその後の単離を可能にする低密度パーコール細胞画分からの造血の枯渇（CD45用Hi）細胞によって達成される。単離された細胞は、異なる下流の用途に使用することができる。

このプロトコルでは、出発物質として、我々はインフォームドコンセントの後に、制度的なガイドラインの下で得られた矯正心臓血管外科（学科胸部と心臓血管外科、大学クリニックチュービンゲン）を受けている子供から削除胸腺組織を使用しています。この廃棄された材料は2-30 g以上のサイズで大きく異なります。得られたMDCおよびTECサブセット（CTECとMTEC）の数は、サイズだけでなく?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus at JoVE.com

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

このプロトコルは、濃度の単一細胞懸濁液を遠心分離し、最後に、磁気および/または目的の細胞集団のFACS選別に続いて、組織の酵素消化の異なるステップを介して、ヒト胸腺から抗原提示細胞を単離する方法を詳述する。

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

マウス肺樹状細胞の分離

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T細胞は、樹状細胞からTransinfectionによって細菌をキャプチャ

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

人間の女性の生殖器官から樹状細胞の表現型および機能研究の分離

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

分離と養子伝高塩処理樹状細胞の抗原提示

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

唾液圏または単層としての体外増殖のためのヒト唾液腺からの唾液上皮細胞の単離

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...