Name: production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases
Uploaded: 2013-11-18T21:00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (HL105114، HL088391، NS066652، وHL068878 لYEC)، ورابطة القلب الأميركية (الوطنية للتنمية 0835237N عالم لJZ). ويدعم ماليا YEC كما هبت فريدريك Huetwell أستاذ الطب القلب والأوعية الدموية في جامعة ميتشيغان مركز طبي (UMMC). هذا العمل المستخدمة الخدمات الأساسية التي يدعمها مركز لنماذج متقدمة للعلوم بالحركة والتداوي (CAMTraST) في UMMC.

تم استعراض جميع إجراءات الصيانة الحيوانية والرعاية والاستخدام والتي وافقت عليها لجنة جامعة على استخدام ورعاية الحيوانات من جامعة ميشيغان. 1. ZFN التصميم والاختيار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توفير المعلومات التسلسل الجيني من الجينات في المصالح (مثل أرنب ApoCIII) إلى الشركة المصنعة. حدد مجموعة ZFN (ق) عن التجارب استنادا إلى عشرات ZFN. </li></ol> 2. أرنب الأجنة كوكتيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Superovulate نضجت جنسيا (6-18 شهرا) نيوزيلندا الأبيض (NZW) إناث الأرانب عن طريق تحت الجلد (الشوري) حقن FSH مرتين / يوم مع جرعة من 3 ملغ للحقن الأولين، 5 ملغ للحقن المقبلين و 6 ملغ لحقن الماضيين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدير الوريد (رابعا) حقنة واحدة من 200 وحدة دولية قوات حرس السواحل الهايتية في 72 ساعة بعد أول حقن FSH للحث الإباضة. تتزاوج مع الإناث superovulated أرنب الذكور مباشرة بعد الحقن قوات حرس السواحل الهايتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Euthaniزي الأرانب المانحة superovulated مع بنتوباربيتال الصوديوم (150 ملغ / كغ، والرابع) في 16-18 ساعة بعد التلقيح (رطل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد الأمبولات قناة البيض عن طريق جمع بعناية ناقلة البيضات والمبايض كامل الهيكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد كل قناة البيض مع 10 مل من التلاعب المتوسطة HEPES مخزنة TCM 199 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، عن طريق حقن المتوسطة من نهاية الرحم من قناة البيض. جمع المتوسطة مسح في افتتاح المبيض-نهاية قناة البيض إلى طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة وتحديد الأجنة تعافى في المتوسطة مسح، وغسل الأجنة ثلاث مرات في المتوسط ​​التلاعب، والاحتفاظ بها في المتوسطة التلاعب في 38.5 درجة مئوية في الهواء، ومراقبة لهم تحت stereomicroscope لحدوث الإخصاب. تحضير لحقن مكروي على الأجنة مرحلة pronuclear 19-21 ساعة رطل </li></ol> 3. إعداد ZFN مرنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية مرنا الناتجة قبل إعادة تعليق في ريبونوكلياز خالية 0.1X TE (1 ملي تريس، ودرجة الحموضة الكلورين8.0، 0.1 ملي EDTA). قياس تركيز وتخزين مرنا في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد mRNAs وترميز الزوج ZFN (4-10 نانوغرام / ميكرولتر في 1 mMTris-CL، 0.1 ملي EDTA عند pH 7.5)، قسامة إلى 10 قارورة ميكرولتر. تخزينها في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. قبل حقن مكروي، ذوبان الجليد قارورة الحمض النووي الريبي (ق)، ويبقيه على الجليد. </li></ol> 4. الجنين حقن مكروي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منصة حقن مكروي عن طريق وضع قطرة 5 ميكرولتر من التلاعب المتوسطة على شريحة الغرفة 1-جيدا أن لديه غرفة وسائل الاعلام إزالتها. تغطية انخفاض المتوسطة مع الزيوت المعدنية ومكان على المسرح المجهر ساخنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عقد ماصة (120 ميكرون قطر) في ذراع حامل مياداة مجهرية وضعه في قطرة من التلاعب المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتعال بال micropipettes حقن عن طريق تسخين وسحب أنابيب زجاجية البورسليكات الشعرية في جهاز micropipette مجتذب. تحميل مرنا ليتم حقنه في ماصة الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">بدوره على إمدادات الهواء المضغوط الذي يتم وصله بجهاز microinjector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حقن ماصة في حامل الحقن، ووضعها على مياداة مجهرية وضعه في قطرة من التلاعب المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد microinjector، مع المعلمات المقترحة التالية: holdP = 2 رطل، InjP = 20 رطل، ClearP = 60 رطل، Injtime = 1 ثانية، الأمر الذي سيؤدي في حجم الحقن من 1-5 رر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح غيض من ماصة حقن عن طريق التنصت بلطف ضد ماصة القابضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة (30-50) إلى انخفاض المجهرية على المنصة. استخدام ماصة عقد لالتقاط الجنين ومحاذاة إبرة الحقن، والجنين وماصة عقد على طول المحور س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت التكبير 400X، ودفع ماصة حقن عن طريق الجنين. كن حذرا لتجنب النواة. مرة واحدة اخترقت غشاء البلازما، ودواسة القدم لحقن الصحافة. بعد الحقن، وسحب الإبرة، والإفراج عن الجنين. كرر العملية لجميع طب الطوارئ المتبقيةbryos. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأجنة حقن ثلاث مرات في المتوسط ​​الجنين والثقافة، والذي يتكون من محلول الملح ايرل المتوازن (EBSS) تستكمل مع الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) والأحماض الأمينية الأساسية (EAA)، 1 ملم L-الجلوتامين، البيروفات 0.4 ملي الصوديوم، و 10٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة في 38.5 درجة مئوية في 5٪ CO 2 في الهواء لمدة 1-2 ساعة قبل أن يتم نقلها جراحيا أنها في ناقلة البيضات من الإناث متزامنة المتلقي NZW أرنب (انظر الخطوة 5.1). بدلا من ذلك، ثقافة الأجنة حتى تصل إلى مرحلة الكيسة قبل استخدامها لفي المختبر التحقق من صحة أو المقايسات. </li></ol> 5. نقل الجنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد NZW أرنب الإناث 5-12 شهرا من العمر، في صحة جيدة، وتزن تقريبا. 4،0-5،0 كجم كما الحيوان المتلقي. إدارة إفراز هرمون موجهة الغدد التناسلية ([نره]) حقن في العضل (ايم، 50 ميكروغرام / مل، 0.3 مل / حيوان) إلى المتلقي في الوقت نفسه نقطة مع أن من قوات حرس السواحل الهايتية حقن للحيوان المانحة (ق) (انظر الخطوة 2.2). </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من حقن مكروي، وإعداد الأرنب المتلقية لنقل الأجنة (عادة 16-24 ساعة بعد الحقن نره]). تخدير الأرنب مع 10-40 مغ / كغ الكيتامين (ايم)، و / أو تبخيرها isoflurane و(2-4٪) عن طريق الاستنشاق. حماية العينين الأرنب من الجفاف المفرط من تطبيق مرهم للعين معقمة. مراقبة الحيوان حتى يصبح فاقدا للوعي تماما، مثال. لا يستجيب لردود الفعل دواسة؛ الضغط يستخدم لوحة القدم للتحقق من عدم وجود دواسة المنعكس وهو دلالة كافية من التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق البطن الأرنب، ويغسل مع فرك مطهر، تليها محلول مطهر، ومسح منطقة حلق مع الإسفنج شاش معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء عملية جراحية تحت ظروف معقمة، وتسجيل العلامات الحيوية للأرنب المستفيدة تقريبا كل 15 دقيقة طوال الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة إلى 10-25 الحيوان مستلم واحد، اعتمادا على عدد من الأجنة المتاحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهايةالعمليات الجراحية، وإغلاق طبقة العضلات مع خياطة للامتصاص المغلفة. خياطة الجلد إما مع خياطة تحت البشرة باستخدام خياطة للامتصاص أو مع بسيطة خيوط الجلد باستخدام خياطة توقف nonabsorable (مثل النايلون حيدة أو ما شابه ذلك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الحارة الحيوانية ومراقبة ذلك حتى يتحقق لها الاستلقاء القصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد حيوان يوميا. اتبع تعليمات الطبيب البيطري لرعاية الحيوان. إدارة ميلوكسيكام (الشوري 1.0 ملغ / كلغ) لتخفيف الألم و / أو الحد من عملية الحمى آخر يوميا إذا لزم الأمر يحدد من قبل طبيب بيطري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغرز الجلد nonabsorable في حوالي 10-14 يوما بعد العملية. </li></ol> 6. الكشف عن ZFN المستحثة تعطيل الجينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفي المختبر والمصادقة، وأداء التنميط الجيني على الأجنة في المختبر مثقف. ليز الأجنة الفردية التي وضعت لمراحل التوتية / الكيسة في 5 ميكرولتر حل NP40 (1٪ NP40 زائد 1 ميكروغرام / مل K بروتين في طق العازلة) ل0.5-1 ساعة عند 55 درجة مئوية، و 10 دقيقة في 95 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالتنميط الجيني للذرية، وجمع عينات من الجلد من الأذن مجموعات الأطفال حديثي الولادة، واستخراج الحمض النووي الجيني، واستخدامها كقوالب لPCR التسلسل. تطبيق كويك إيقاف لمنطقة أخذ العينات بعد جمعها لوقف النزيف والحد من الانزعاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تحلل من الخطوة 6.2 أو 6.3 كقالب لPCR باستخدام LA-PCR طق والزوج التمهيدي، والتي تقع المنبع (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;) والمصب (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3&#39;) من موقع الهدف ZFN . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية المنتجات PCR وتسلسل لهم التمهيدي التسلسل (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عينات متحولة من خلال البحث عن منحنى مزدوج في مخطط تسلسل حول موقع الاستهداف. تسمية تلك مع منحنيات مزدوجة بانها &quot;ايجابية&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ &quot;ايجابية&quot; المنتجات PCR TA الاستنساخ في ناقلات، والتقاط استنساخ 10-20، وتسلسل وتدرج، والتأكد من الطفرات في جميع أنحاء رموقع argeting. </li></ol>

<ol>
	<li>Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+C-III:+understanding+an+emerging+cardiovascular+risk+factor.">Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor.</a> Clinical Science. 114, 611-624 (2008).</li><li>Pollin, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+null+mutation+in+human+APOC3+confers+a+favorable+plasma+lipid+profile+and+apparent+cardioprotection.">A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection.</a> Science. 322, 1702-1705 (2008).</li><li>Ginsberg, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+B+metabolism+in+subjects+with+deficiency+of+apolipoproteins+CIII+and+AI.+Evidence+that+apolipoprotein+CIII+inhibits+catabolism+of+triglyceride-rich+lipoproteins+by+lipoprotein+lipase+in+vivo.">Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo.</a> The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).</li><li>Cohn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+apoC-III+production+is+a+characteristic+feature+of+patients+with+hypertriglyceridemia.">Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia.</a> Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).</li><li>Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+production+of+plasma+and+very-low-density+lipoprotein+(VLDL)+apolipoprotein+C-III+is+strongly+related+to+the+concentration+and+level+of+production+of+VLDL+triglyceride+in+male+subjects+with+different+body+weights+and+levels+of+insulin+sensitivity.">Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).</li><li>Maeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+apolipoprotein+C-III+gene+in+mice+results+in+hypotriglyceridemia+and+protection+from+postprandial+hypertriglyceridemia.">Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia.</a> The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).</li><li>Jong, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+C-III+deficiency+accelerates+triglyceride+hydrolysis+by+lipoprotein+lipase+in+wild-type+and+apoE+knockout+mice.">Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice.</a> Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).</li><li>James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+physiology+in+transgenic+mice.">Cardiac physiology in transgenic mice.</a> Circ. Res. 82, 407-415 (1998).</li><li>Duranthon, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+emerging+role+of+rabbit+as+human+disease+model+and+the+instrumental+role+of+novel+transgenic+tools.">On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools.</a> Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).</li><li>Fan, J., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rabbits+as+therapeutic+protein+bioreactors+and+human+disease+models.">Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models.</a> Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).</li><li>Shiomi, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Watanabe+heritable+hyperlipidemic+(WHHL)+rabbit,+its+characteristics+and+history+of+development:+a+tribute+to+the+late+Dr.+Yoshio+Watanabe.">The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe.</a> Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).</li><li>Morehouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CETP+activity+by+torcetrapib+reduces+susceptibility+to+diet-induced+atherosclerosis+in+New+Zealand+White+rabbits.">Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits.</a> Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).</li><li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li><li>Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+editing+of+bacterial+genomes+using+CRISPR-Cas+systems.">RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.</a> Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).</li><li>Petersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+'molecular+scissors'+for+transgenic+farm+animal+production.">Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+PPARgamma+mono-allelic+knockout+pigs+via+zinc-finger+nucleases+and+nuclear+transfer+cloning.">Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning.</a> Cell Research. 21, 979-982 (1038).</li><li>Flisikowska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+immunoglobulin+gene+disruption+and+targeted+replacement+in+rabbit+using+zinc+finger+nucleases.">Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases.</a> PLoS ONE. 6, e21045 (2011).</li><li>Foley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+zebrafish+using+customized+zinc-finger+nucleases.">Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases.</a> Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).</li><li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li><li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+knockout+rats+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+(X-SCID)+using+zinc-finger+nucleases.">Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases.</a> PLoS ONE. 5, e8870 (2010).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertriglyceridemia+and+delayed+clearance+of+fat+load+in+transgenic+rabbits+expressing+human+apolipoprotein+CIII.">Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII.</a> Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).</li><li>Hauschild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+a+biallelic+knockout+in+pigs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

في العمل الحالي، تم إنشاؤها خمسة أرانب ApoCIII KO باستخدام التكنولوجيا ZFN. سبق التقرير فقط من إنتاج أرانب GTT تستخدم أيضا تقنية ZFN 18. وأكد أن العمل الحالي ZFN مفيد بشكل فعال لاستهداف الجينات في الأرانب. في هذه الدراسة، فإن معدل وراثيا (مجموعات ايجابية / مجموع ولد) is23.8٪ (5/21)، والذي هو مشابه لذلك من التقرير السابق ZFN في الأرانب (30.8٪، و 16/52) 18، وتلك التي ذكرت استخدام ZFN في الأنواع الحيوانية الأخرى، بما في ذلك حمار وحشي الأسماك 19، 20 الفئران والجرذان والخنازير 21 17. هذه النسبة هي في الواقع أعلى من معدلات العديد من الدراسات إنتاج الأرانب المعدلة وراثيا التقليدية، التي تندرج عادة في حدود 5-20٪. على سبيل المثال، في محاولة لمنتج ApoCIII الأرانب المعدلة وراثيا عن طريق حقن مكروي الحمض النووي التقليدية، أقرع وآخرون الحصول على 3 مؤسسي إيجابية من 54 الجراء ولدت (5.6٪) 22. يتفق مع النتائج السابقة، والطفرات في المواقع التي تستهدف هي المتغير، بما في ذلك الحذف أو الإدراج تتألف عدد مختلف من القواعد (تتراوح 1-21 في الأرانب خمسة KO). استنادا إلى المعلومات تسلسل معين من الحيوانات مؤسس، ومن المتوقع أن لا يقل عن أربعة (أي. تلك التي تحتوي على Δ1، +1، +1، أو Δ20 الطفرات) من شأنه أن يكون فقدان وظيفة من ApoCIII. الحيوان R-16 مع Δ21 قد لا يتم عرض فقدان الوظائف، كما توقع هذه الطفرة إلى سبب الخسارة الوحيدة من سبعة الأحماض الأمينية، ولكن ليس تحولا إطار القراءة. في نهاية المطاف، النمط الظاهري المقايسات اللازمة لتحديد ما إذا كانت هذه الحيوانات مؤسس عرض حقا فقدان الوظائف ApoCIII. أيا من الأرانب KO خمسة ولدت في هذه الدراسة تتضمن التعديلات biallelic. ومن المثير للاهتمام، وهذا هو الحال في التقرير السابق أرنب ZFN أيضا. في المقابل، عند استهداف ZFNs α1 ،3-galactosyltransferase تم تطبيقها على خنزيرالخلايا، وتواتر استهداف أليل واحد تراوحت 7-46٪، مع ما يقرب من ثلث الطفرات خلق خطوة واحدة biallelic بالضربة القاضية 23. واتساقا مع ذلك، عندما تم تطبيق TALEN إلى الخلايا الليفية خنزير، عثر على التعديلات biallelic في حوالي 15-40٪ من مجموع الحيوانات المستنسخة إيجابية 14. فمن الممكن أن الفشل في توليد الأرانب KO biallelic في هذه الدراسة قد تشير إلى وجود اختلاف الأنواع (أي الأرانب مقابل الخنازير) لمثل هذه قدرة نوكلياز على الجينات الاستهداف. هو عليه، ومع ذلك، من الأرجح أن هذا هو ببساطة لأن عدد الأرانب KO ولدت في هذا المشروع صغير نسبيا. ونحن نعتقد أن ZFN قادر على توليد الطفرات bialleic في الأرانب، والتي ينبغي اعتبارها ميزة أخرى محتملة من إنتاج الأرانب GTT ZFN القائمة. وهناك حاجة إلى مزيد من التجارب لتأكيد هذه القدرة من ZFN في الأرانب. في الختام، يدل على أن العمل الحالي Zالجينات FN مقرها تستهدف النهج هو فعالة في إنتاج الأرانب KO. على وجه الخصوص، ونحن ولدت خمسة أرانب ApoCIII KO مع معدل وراثيا مرضيا من 23.8٪. ويعتقد أن هذه الحيوانات لتوفير معلومات أكثر وضوحا حول دور هذا البروتين على الأيض الدهون في البشر من نماذج الماوس المقابلة. نتوقع استهداف الجين ZFN مقرها، وكذلك التكنولوجيات القائمة على نوكلياز أخرى مثل TALEN وRGEN، في الحيوانات nonmurine سيسهل بشكل كبير في تطوير نماذج حيوانية رواية لدراسة مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> الشكل 1. تدفق الرسم البياني من إنتاج أرانب بالضربة القاضية باستخدام التكنولوجيا ZFN. إنتاج الأرانب KO باستخدام التكنولوجيا ZFN يبدأ مع اختيار الجينات في المصالح. يتم توفير المعلومات التسلسل، فقد تم تصميم مجموعات ZFN، وsubjected إلى الخميرة على أساس التحقق من صحة في المنزل. في نقطة تفتيش (CP) 1 (CP-1)، وسيتم توفير فقط تلك المجموعات مرت في المنزل التحقق من صحة (50٪ أو أعلى من السيطرة الإيجابية الداخلية) للمستخدمين للاختيار. إذا لم يكن هناك مجموعات تمر CP-1، قد تكون هناك حاجة تسلسل إضافية لتصميم مجموعات ZFN فعالة. ويتبع في المختبر التحقق من صحة الجنين لضمان مجموعة مختارة ZFN يمكن أن تحدث طفرات في مواقع مختارة (CP-2). وليس هذا فقط مجموعة ZFN (ق) أن تستخدم إذا كان يمر CP-2 (&gt; = 10٪ معدلات الطفرة في الأجنة في المختبر). والفشل في CP-2 تتطلب إعادة تصميم مجموعات ZFN. وسوف تكون على استعداد المانحين الجنين وسيتم microinjected الأجنة مرحلة pronuclear مع مجموعات ZFN التحقق من صحتها. وسيتم نقل هذه الأجنة microinjected إلى المستلمين الجنين متزامنة. بعد فترة الحمل شهر واحد، سيتم مرمزة بالجينات حديثي الولادة (CP-3). إذا كان أي من الأطفال حديثي الولادة هي إيجابية، سيتم تنفيذ حقن مكروي إضافية. يستغرق 2-3 أشهر من بداية المشروع إلى CP-2، على افتراض نفشل س خلال العملية. يستغرق 2-3 أشهر إضافية من CP-2 إلى CP-3. ولذا فمن الممكن أن تولد أرنب خروج المغلوب في إطار زمني 4-6 الشهر باستخدام تكنولوجيا ZFN. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> الشكل 2. تصميم ZFN. ثلاث مجموعات ZFN (مجموعة 1 و 2 و 3) تم تصميمها استهداف سلاسل مختلفة على اكسون 1 أو 2 من اكسون الأرنب ApoCIII (A). وتعرض جميع المجموعات الثلاث إلى الخميرة MEL-1 مراسل مقايسة لتحديد الأنشطة ZFN. وفقا لبروتوكولات تصنيع، وتعتبر ZFNs التي تظهر الأنشطة&gt; 50٪ من تلك السيطرة الإيجابية الداخلية للتصنيع كما مفيدة لفي المختبر والمجراة الجينوم التحرير التجارب.وكانت أنشطة ZFN 224.2٪ لمجموعة 1، 196.9٪ للمجموعة 2 و 177.8٪ للمجموعة 3 (ب)، لذلك تم اختيار مجموعة 1 في الدراسة الحالية. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> الرقم 3. في المختبر التحقق من صحة الجنين من ZFN. تم microinjected مرنا (5 ميكروغرام / مل) من مجموعة 1 إلى السيتوبلازم من 35 pronuclear الأجنة مرحلة أرنب (A). واستخدمت أجنة مسح دون علاج حقن مكروي (ن = 31)، والسيطرة على المجموعة. كان معدل التنمية BL 77.4٪ في مجموعة المراقبة. في المجموعة microinjected، كان معدل 51.4٪ BL. من 16 BLS تعرض لPCR التسلسل، 8 (50٪) تم تحديدها على أنها إيجابية، مما يشير إلى مجموعة 1 هو مجموعة ZFN فعالة للحث على الطفرات في targeموقع تينغ (B، apoc3wt.seq، أسود محاصر) من ApoCIII في الأرانب. و BLS التي تحتوي على الطفرات هي BL-APOC # 3، 4، 5، 7، 11، 13، 15، و (أكد B والأحمر) 17. و BLS المتبقية (# APOC-2، 6، 9، 10، 12، 14 و 16) لم يكن لديك الطفرات في موقع الاستهداف. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> الشكل 4. إنتاج الأرانب ApoCIII KO. تم نقل مائة وخمسة وأربعين الأجنة microinjected مع مجموعة ZFN 1 إلى 7 mRNAs والأرانب المتلقي شبه الحوامل (A). تم نقل الأجنة الطازجة مسح (ن = 75) دون ZFN حقن مكروي إلى المستلمين (ن = 6)، والسيطرة على المجموعة. معدل الأجل تحسب على النحو مجموعات المدى الكل / مجموع الأجنة في المجموعة التجربة هو 14.5٪ (21/145)، في حين أن معدل 29.3٪ (22/75) في السيطرة على المجموعة (A). من أصل 21 مجموعات ولد في المجموعة microinjected، وخمسة (R1، R9، R11، R12 R16 و) تم تحديد مجموعات KO إيجابية بعد PCR التسلسل (B). تشمل indels في موقع الاستهداف اثنين الإدراج (+1 لكل R9 وR11) وثلاثة الحذف (Δ1، Δ 20، Δ 21 لR1، R12 R16 و، على التوالي). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

ئي (آبو) C-III (ApoCIII) هو-O الغليكوزيلاتي إفرازية البروتين الصغيرة التي يتم تصنيعه بشكل رئيسي في الكبد والأمعاء. أنه يتواجد على سطح الكيلومكرونات البلازما (CM)، منخفضة جدا كثافة البروتين الدهني (VLDL) والبروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL). وقد تم الاعتراف ApoCIII كعامل خطر للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية 1. المرضى الذين يعانون من نقص وراثي من ApoCIII لديهم انخفاض الدهون الثلاثية البلازما (TG) وانخفاض مستويات تحت الإكلينيكي الشريان التاجي وتصلب الشرايين 2،3. ارتفاع مستوى ApoCIII البلازما، من ناحية أخرى، وغالبا ما يرتبط مع مقاومة الانسولين والبدانة، وفرط ثلاثي غليسيريد الدم (HTG) 4،5. الجينات خروج المغلوب (KO) هي وسيلة قوية لدراسة وظيفة الجين. بما يتفق مع الملاحظات في السكان متحولة الإنسان، أدى خروج المغلوب من الجينات في الفئران ApoCIII إلى الحد من البلازما TG والحماية من HTG بعد الأكل 6. هذا الدور الإيجابي للApoCIII ظهرأن تكون مستقلة من ئي E (APOE)، والقصور الذي يعتري كل من الفئران وAPOE ApoCIII محمية أيضا من الدهون بعد الأكل 7. على الرغم من أن وفرت هذه النماذج الماوس ApoCIII KO معلومات لا تقدر بثمن على الوظائف المحتملة من ApoCIII في البشر، لوحظ أن عملية التمثيل الغذائي للبروتين شحمي من الفئران يختلف عن نظيره لدى البشر في كثير من الجوانب. على سبيل المثال، يفتقر الماوس البلازما الكوليسترول نقل استر البروتين (CETP)، انزيم الرئيسية المشاركة في نقل VLDL، LDL، HDL و8. وبالتالي، فمن الضروري لتطوير نموذج حيواني المناسبة لزيادة فهم دور الفسيولوجية للApoCIII في الجسم الحي. الأرنب هو الكلاسيكية الأنواع نموذج حيواني 9-11. لديها فترة قصيرة من الحمل (30-31 يوما)، وحجم القمامة الكبيرة (4-12/litter) ويمكن أن يكون مقر ملائم في منشأة في الأماكن المغلقة. بالمقارنة مع الفئران والأرانب هي أقرب إلى البشر phylogenetically 10. الأهم من ذلك، مثل هو جين تاوولكن على عكس الرجل الفئران والأرانب والثدييات-LDL الغنية ولها مستويات كبيرة من CETP 10،12. وعلاوة على ذلك، فهي عرضة للالغنية بالكوليسترول النظام الغذائي الناجم عن تصلب الشرايين مع آفات مماثلة لتلك التي ظهرت في تصلب الشرايين الإنسان 13. لهذه الأسباب، ونحن افترضنا أن الأرانب ApoCIII KO يمكن أن تكون بمثابة نموذج أفضل من نظرائهم الماوس الخاصة بهم للتحقيق في أدوار ApoCIIIplay في استقلاب الدهون وتصلب الشرايين لدى البشر. إنتاج الجينات المستهدفة المعدلة وراثيا كان (GTT) الأرانب تحديا. ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود سلالة الجرثومية نقل الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)، وكفاءة منخفضة للغاية من نقل نواة الخلية الجسدية (SCNT) في الأرانب هذا. ESC هو الأداة الرئيسية لتوليد الفئران GTT، في حين وأنها طبقت بنجاح SCNT لتوليد الحيوانات KO في الأنواع التي تفتقر إلى سلالة الجرثومية المجالس الاقتصادية والاجتماعية تحيل، بما في ذلك الخنازير والأغنام والماشية، ولكن ليس الأرانب. مؤخرا الزنك فنجر نوكلياز (ZFN)، ترانظهرت SCRIPTION المنشط على غرار المستجيب نوكلياز (TALEN) 14، والجيش الملكي النيبالي نوكلياز داخلية الإرشادية (RGEN) 15 وسيلة قوية للتحرير كما الجينوم. هذه nucleases، ما يسمى ب &quot;مقص الجزيئية&quot;، هي فعالة في توليد فواصل المزدوج حبلا (DSB) في الجينوم التي يمكن أن تؤدي إلى KO وظيفية من الجينات المستهدفة أو تستخدم لدمج تسلسل الحمض النووي في موضع محدد في الجينوم في عدد من الأنواع 16. في عام 2011، من بين أول تطويع التكنولوجيا ZFN، ونحن ولدت بيروكسية تنشيط مستقبلات غاما ناشر (PPARγ) خلايا الخنازير KO عبر هذا النهج ولدت بنجاح الخنازير PPARγ KO بعد استخدام هذه الخلايا لSCNT 17. في نفس العام، أفيد كفاءة المناعي اضطراب الجينات واستبدال المستهدفة في الأرانب أيضا باستخدام ZFN 18. في هذه الدراسة، تم إنشاؤها خمسة أرانب ApoCIII KO ما أكده PCR التسلسل، وذلك باستخدام مجموعة ZFN 1 (انظر الشكل 1 </sترونج&gt;. للمخطط تدفق التوضيح). هذه الحيوانات هي موارد جديدة لدراسة أدوار ApoCIII في الأيض الدهون.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">APOC3-ZFN</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">CSTZFNY-1KT</td>
			<td style="width:167px;">Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344M</td>
			<td>mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAclear Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">AM1908M</td>
			<td>mRNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Bioniche Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">Folltropin-V</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Intervet</td>
			<td style="width:136px;">Chorulon</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gonadotropin-releasing hormone</td>
			<td>Prospecbio</td>
			<td>HOR-255</td>
			<td>Treating embryo recipient rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30029.02</td>
			<td>Embryo culture, base medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (nonessential amino acid)</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M7145</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BME AMINO ACIDS solution</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">B6766</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffered TCM 199&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td style="width:136px;">12350039</td>
			<td>Embryo manipulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Incubator</td>
			<td style="width:276px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Galaxy 170</td>
			<td>Embryo culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">TransferMan NK 2</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Inc.</td>
			<td style="width:136px;">P-1000</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td style="width:136px;">MINJ-D&#160;</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary tubes&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">TW100F-6</td>
			<td>Embryo manipulation supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Euthasol (pentobarbitol sodium)</td>
			<td style="width:276px;">Virbac AH, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">ANADA#200-071</td>
			<td>Euthanization of embryo donor rabbits</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases

ئي (آبو) C-III (ApoCIII) تتواجد على سطح الكيلومكرونات البلازما (CM)، منخفضة جدا كثافة البروتين الدهني (VLDL) والبروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL). وقد تم الاعتراف بأن مستويات عالية من بلازما ApoCIII عامل خطر لأمراض القلب والأوعية الدموية constitutea (الأمراض القلبية الوعائية). ارتفاع مستوى ApoCIII البلازما غالبا ما يرتبط مع مقاومة الانسولين والبدانة، وفرط ثلاثي غليسيريد الدم. لقد تم الحصول على المعرفة لا تقدر بثمن على أدوار ApoCIIIin الأيض الدهون والأمراض القلبية الوعائية من نماذج الماوس المعدلة وراثيا بما في ذلك ApoCIII بالضربة القاضية (KO) الفئران، ومع ذلك، لوحظ أن عملية التمثيل الغذائي للبروتين شحمي في الفئران مختلفة عن البشر في كثير من الجوانب. ومن غير المعروف حتى الآن ما إذا البلازما مرتفعة ApoCIII مباشرة تصلب الشرايين. عملنا على تطوير الأرانب ApoCIII KO في هذه الدراسة بناء على فرضية أن الأرانب يمكن أن تكون بمثابة reasonablemodelfor دراسة استقلاب الشحوم الإنسان وتصلب الشرايين. الزنك الاصبع نوكلياز (ZFN) مجموعات استهداف أرنب ا ف بتعرضوا لoCIIIgene في المختبر التحقق من صحة الجنين قبل حقن مكروي. تم حقن مرنا إلى السيتوبلازم من 35 أرنب الأجنة مرحلة pronuclear، وتقييم معدلات طفرة في الدولة الكيسة. ستة عشر مثانات بلاستولية التي تم يعاير، تم التوصل إلى نسبة مرضية طفرة 50٪ (8/16) في موقع الاستهداف، ودعم استخدام مجموعة 1 لفي التجارب المجراة. المقبل، ونحن microinjected الأجنة مع 145 مجموعة 1 مرنا، ونقل هذه الأجنة إلى 7 الأرانب المتلقي. بعد 30 يوما من الحمل، ولدوا 21 مجموعات، منها تأكدت خمسة أرانب كما ApoCIII KO بعد PCR المقايسات التسلسل. كان معدل الحيوان KO (# لدت مجموعات KO / الكل) 23.8٪. كفاءة الإنتاج الكلي هو 3.4٪ (5 kits/145 الأجنة المنقولة). تظاهر العمل الحالي التي ZFN هو طريقة فعالة للغاية لإنتاج الأرانب KO. هذه الأرانب ApoCIII KO هي موارد جديدة لدراسة أدوار ApoCIII في الأيض الدهون.

في التحقق من صحة المختبر من أزواج ZFN وقد صممت أزواج ستة عشر ZFN في البداية. يقع تسلسل تعطيل استهدفت مجموعة من 1 في اكسون 2 من أرنب ApoCIII (الشكل 2A). وقد تم اختيار ثلاثة أزواج (مجموعة 1، 2، و 3، الشكل 2A) وتعرض لالخميرة MEL-1 مراسل مقايسة لتحديد الأنشطة ZFN (الشكل 2B). مجموعة 1 لديه درجة ZFN من 224.2٪، وهي نسبة أعلى من تلك التي مجموعة 2 (196.9٪)، ومجموعة 3 (177.8٪) وأعلى بكثير من عتبة اختيار (أي 50٪ من السيطرة الإيجابية الداخلية). لذا تم اختيار مجموعة 1 للتجارب في المختبر التحقق من الصحة. وهناك مجموعة معينة يجب أن تؤدي إلى معدلات إيجابية في الأجنة من 10٪ أو أعلى لتمرير التحقق من صحة الجنين في المختبر، استنادا إلى معايير التحقق من صحة الداخلية. تم microinjected مرنا (5 ميكروغرام / مل) من مجموعة 1 إلى السيتوبلازم من 35 pronuclear الأجنة مرحلة الأرنب (الشكل 3A &lt;/ STRONG&gt;). واستخدمت أجنة مسح دون علاج حقن مكروي (ن = 31)، والسيطرة على المجموعة. ثمانية عشر الأجنة المجموعة microinjected المتقدمة إلى مرحلة BL على D5، منها التسلسل ستة عشر، وثمانية (، وأكد الأحمر BL # APOC-3، 4، 5، 7، 11، 13، 15، 17، الشكل 3B) عرض تحور متواليات في موقع الاستهداف (أسود محاصر، الشكل 2B، الصف العلوي، apoC3wt.seq). معدل BL المجموعة microinjected (51.4٪) هو أقل من المجموعة الضابطة (77.4٪)، مما يدل على الكفاءة التنموية ضعف قليلا من الأجنة microinjected. معدل طفرة إيجابية من الأجنة microinjected هو 50.0٪ (8/16)، وهي نسبة أعلى بكثير من عتبة اختيار (أي 10٪). وكشفت هذه النتائج أن مجموعة 1 هو مجموعة ZFN فعالة للحث على الطفرات في موقع استهداف ApoCIII الأرانب. وبالتالي مجموعة 1 اختير لفي الجسم الحي إنتاج الأرانب ApoCIII KO. إنتاج الأرانب ApoCIII KO مرنا ستم microinjected و ZFN مجموعة 1 إلى السيتوبلازم من أرنب الأجنة مرحلة pronuclear، ونقل الأجنة 145 microinjected إلى 7 الأرانب المتلقي شبه الحوامل (الشكل 4A). تم نقل الأجنة الطازجة مسح (ن = 75) دون ZFN حقن مكروي إلى المستلمين (ن = 6)، والسيطرة على المجموعة. بعد 30 يوما من الحمل، ولدوا 21 مجموعات في المجموعة microinjected. تحديد تسلسل PCR خمسة (apoC3-R1، R9، R11، R12 R16 و) إلى مجموعات KO إيجابية (الشكل 4B). معدل الأجل تحسب على النحو مجموعات المدى الكل / مجموع الأجنة هو 14.5٪ (21/145)، في حين أن معدل 29.3٪ (22/75) في السيطرة على المجموعة. معدل KO المحسوبة على النحو الكلي مجموعات KO / المدى إجمالية تبلغ 23.8٪ (5/21). واحد KO عدة (APOC-R16) توفي خمسة أيام بعد الولادة (20.0٪، و 1/5). وindelsat موقع الاستهداف تشمل اثنين من الإدراج والحذف الثلاث، بل areΔ1، +1، +1، Δ20 وΔ21، على الأرانب # R1، R9، R11، R12، R16 و، على التوالي (الشكل 4B). ثنائيةوتم استخدام تحليل oinformatics لتحديد ZFN المحتملة خارج أهداف مع 7 أو أقل عدم التطابق تعيين تسلسل 1، كما هو موضح سابقا 17. فقط توقع واحد ممكن الموقع بعيدا عن الهدف، وتقع على الصبغي 14، تم تحديدها مع 7 نقاط أساس غير متطابقة. PCR فحص الكشف عن أي أحداث خارج الهدف في أي من الحيوانات مؤسس.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases at JoVE.com

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

إنتاج ئي C-III الأرانب الضربة القاضية باستخدام الزنك Nucleases فنجر

التطورات الأخيرة في أدوات استهداف الجينات يجعل إنتاج بالضربة القاضية (KO) الأرانب ممكن. في العمل الحالي، ونحن ولدت خمسة أرانب ئي (آبو) C-III KO باستخدام الزنك Nucleases فنجر (ZFN). أظهر هذا العمل الذي ZFN هو طريقة فعالة للغاية لإنتاج الأرانب KO.

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

عزل وعن طريق أقسام الأبقار الشريان والوريد المساريقي باعتباره الأحيائي لاختبار لVasoactivity في الأمعاء الدقيقة

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

خطوة بالبروتوكول الخطوة لجراحة تحت الشبكية في الأرانب

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

إنتاجية عالية، تعدد والمستهدفة [بروتيوميك CSF الفحص لقياس المؤشرات الحيوية الاعصاب وئي E الإسوية الحالة

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

تحريض لويحات تصلب الشرايين من خلال تنشيط مستقبلات مينيرالوكورتيكويد في الفئران الابوليبوبروتين ه التي تفتقر إلى

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

نموذج قبل السريرية من نقص التروية الأطراف هند في الأرانب السكري

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

إنشاء نموذج العين الجافة الشديدة باستخدام استئصال الددريوادادينال الكامل في الأرانب

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Blind Endotracheal Intubation in Neonatal Rabbits

التنابيب Endotracheal الأعمى في الأرانب حديثي الولادة

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical ...

Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits

رصد متعدد النظم لتحديد المضبوطات وعدم انتظام ضربات القلب وانقطاع النفس في الأرانب المقيدة الواعية

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease ...

Three-Dimensional Finger Motion Tracking during Needling: A Solution for the Kinematic Analysis of Acupuncture Manipulation

تتبع حركة الإصبع ثلاثي الأبعاد أثناء الإبر: حل للتحليل الحركي للتلاعب بالوخز بالإبر

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D ...

A Modified Technique for Arteriovenous Fistula Construction in Rabbits

تقنية معدلة لبناء الناسور الشرياني الوريدي في الأرانب

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury ...