Name: production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases
Uploaded: 2013-11-18T21:00:00
Duration: 10 min 59 s
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इस काम आंशिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया (HL105114, HL088391, NS066652, और YEC को HL068878), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (JZ को राष्ट्रीय वैज्ञानिक विकास 0835237N). YEC आर्थिक रूप से मिशिगन विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर (UMMC) में हृदय चिकित्सा के संपन्न फ्रेडरिक Huetwell प्रोफेसर के रूप में समर्थन किया है. इस काम translational विज्ञान और UMMC में चिकित्सा विज्ञान (CAMTraST) के लिए उन्नत मॉडल के लिए केंद्र द्वारा समर्थित कोर सेवाओं का उपयोग किया.

सभी पशु रखरखाव, देखभाल और उपयोग प्रक्रियाओं मिशिगन विश्वविद्यालय के पशुओं के उपयोग और देखभाल पर समीक्षा की और विश्वविद्यालय समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. 1. ZFN डिजाइन और चयन <ol><li> निर्माता के लिए ब्याज की जीन (जैसे खरगोश ApoCIII) के जीनोमिक अनुक्रम जानकारी की आपूर्ति. ZFN स्कोर के आधार पर प्रयोगों के लिए ZFN सेट (ओं) का चयन करें. </li></ol> 2. खरगोश भ्रूण संग्रह <ol><li> Superovulate यौन (6-18 महीने) परिपक्व न्यूजीलैंड व्हाइट (NZW) पहले दो इंजेक्शन, अगले दो इंजेक्शन और 6 मिलीग्राम के लिए 5 मिलीग्राम के लिए 3 मिलीग्राम की एक खुराक के साथ FSH के चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) इंजेक्शन दो बार / दिन से महिला खरगोश पिछले दो इंजेक्शन के लिए. </li><li> Ovulation प्रेरित करने के लिए पहली एफएसएच इंजेक्शन के बाद 72 घंटे में 200 आइयू एचसीजी की एक एकल अंतःशिरा (चतुर्थ) इंजेक्शन प्रशासन. तुरंत एचसीजी इंजेक्शन के बाद एक पुरुष खरगोश के साथ superovulated महिलाओं दोस्त. </li><li> Euthaniज़ी सोडियम pentobarbital साथ superovulated दाता खरगोश (150 मिलीग्राम / किग्रा, चतुर्थ) 16-18 घंटे बाद गर्भाधान (साई) में. </li><li> ध्यान से पूरे oviducts और अंडाशय संरचना को इकट्ठा करके डिंबवाहिनी एम्पुली वसूल लेंगे. </li><li> HEPES के 10 एमएल हेरफेर के माध्यम से प्रत्येक डिंबवाहिनी निकलवाने टीसीएम 199 डिंबवाहिनी के गर्भाशय अंत से मध्यम इंजेक्शन लगाने के द्वारा, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक बफर. एक पेट्री डिश के लिए डिंबवाहिनी के अंडाशय अंत उद्घाटन के अवसर पर लाल मध्यम लीजिए. </li><li> निरीक्षण और, प्लावित माध्यम में बरामद भ्रूण की पहचान में गड़बड़ी मध्यम में भ्रूण तीन बार धो लो, हवा में 38.5 डिग्री सेल्सियस पर हेरफेर माध्यम में उन्हें रखने के लिए, और निषेचन की घटना के लिए एक stereomicroscope के तहत उन पर नज़र. Pronuclear चरण भ्रूण पर microinjection के लिए तैयार करें 19-21 घंटे साई </li></ol> 3. ZFN mRNA की तैयारी <ol><li> RNase मुक्त 0.1X ते (1 मिमी Tris-सीएल पीएच में मेजबान से पहले परिणामस्वरूप mRNA शुद्ध8.0, 0.1 मिमी EDTA). एकाग्रता उपाय और उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर mRNA की दुकान. </li><li> 10 μl शीशियों में ZFN जोड़ी (7.5 पीएच पर 1 mMTris-सीएल, 0.1 मिमी EDTA में 4-10 एनजी / μl), विभाज्य एन्कोडिंग mRNAs तैयार करें. उपयोग के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान. Microinjection से पहले, शाही सेना शीशी (ओं) पिघलना, और बर्फ पर रहते हैं. </li></ol> 4. भ्रूण Microinjection <ol><li> हटाया मीडिया कक्ष है कि एक 1-अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड पर जोड़ - तोड़ माध्यम की एक 5 μl बूंद रखकर microinjection मंच तैयार करें. गरम खुर्दबीन मंच पर खनिज तेल और जगह के साथ मध्यम बूंद को कवर किया. </li><li> Micromanipulator के धारक हाथ में पकड़े पिपेट (120 माइक्रोन व्यास) प्लेस और हेरफेर के माध्यम की बूंद में यह स्थिति. </li><li> एक micropipette खींचने डिवाइस में borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब हीटिंग और खींच द्वारा इंजेक्शन micropipettes बनाना. इंजेक्शन पिपेट में इंजेक्ट किया mRNA लोड करें. </li><li>एक microinjector से जुड़ा है कि संपीड़ित हवा की आपूर्ति चालू करें. </li><li> जोड़ - तोड़ माध्यम की बूंद में micromanipulator और स्थिति उस पर डाल दिया, इंजेक्शन धारक में इंजेक्शन पिपेट रखें. </li><li> सेटअप निम्नलिखित सुझाव मानकों के साथ microinjector,: holdP = 2 साई, InjP = 20 साई, ClearP = 60 साई, 1-5 पी एल के एक इंजेक्शन की मात्रा में परिणाम होगा जो Injtime = 1 सेकंड,. </li><li> धीरे होल्डिंग पिपेट के खिलाफ यह दोहन द्वारा इंजेक्शन पिपेट की नोक खोलें. </li><li> मंच पर micromanipulation बूंद के लिए भ्रूण (30-50) स्थानांतरण. एक भ्रूण को पकड़ने और इंजेक्शन की सुई, भ्रूण और एक्स अक्ष के साथ होल्डिंग पिपेट संरेखित करने के लिए होल्डिंग पिपेट का प्रयोग करें. </li><li> 400X वृद्धि के तहत, भ्रूण के माध्यम से इंजेक्शन पिपेट अग्रिम. नाभिक से बचने के लिए सावधान रहें. प्लाज्मा झिल्ली में छेद हो जाने के बाद प्रेस पैर पेडल इंजेक्षन. इंजेक्शन के बाद, सुई वापस लेने भ्रूण जारी. शेष सभी के लिए उन्हें प्रक्रिया दोहराएंbryos. </li><li> Nonessential अमीनो एसिड (NEAA), आवश्यक अमीनो एसिड (EAA), 1 मिमी एल glutamine, 0.4 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और 10% के साथ पूरक अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान (EBSS) के होते हैं, जो भ्रूण संस्कृति के माध्यम में इंजेक्शन भ्रूण तीन बार धोएं FBS. </li><li> वे शल्य चिकित्सा द्वारा एक तुल्यकालन प्राप्तकर्ता महिला NZW खरगोश (5.1 कदम देखें) के oviducts में स्थानांतरित कर रहे हैं पहले 1-2 घंटे के लिए हवा में 5% सीओ 2 में 38.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते हैं. वे इन विट्रो मान्यता या assays के लिए उपयोग किया जाता है से पहले वैकल्पिक रूप से, संस्कृति भ्रूण वे ब्लास्टोसिस्ट चरण तक पहुंचने तक. </li></ol> 5. भ्रूण स्थानांतरण <ol><li> लगभग वजन अच्छे स्वास्थ्य में 5-12 महीने पुराने एक महिला NZW खरगोश, का चयन करें. प्राप्तकर्ता जानवर के रूप में 4.0-5.0 किलो. Gonadotropin (2.2 कदम देखें) दाता जानवर (ओं) के लिए एचसीजी इंजेक्शन के साथ कि एक ही समय बिंदु पर प्राप्तकर्ता को हार्मोन (GnRH) इंजेक्शन intramuscularly (आईएम, 50 मिलीग्राम / एमएल, 0.3 मिलीग्राम / पशु) का विमोचन प्रशासन. </ली&gt; <li> Microinjection के पूरा होने के बाद, भ्रूण स्थानांतरण (GnRH इंजेक्शन के बाद सामान्य रूप से 16-24 घंटे) के लिए प्राप्तकर्ता खरगोश तैयार करते हैं. 10-40 मिलीग्राम / किग्रा ketamine (आईएम) के साथ खरगोश चतनाशून्य, और / या वाष्पीकृत isoflurane (2-4%) साँस लेना के माध्यम से. एक बाँझ नेत्र मरहम के आवेदन के द्वारा अत्यधिक सुखाने से खरगोश की आंखों की रक्षा करें. यह यानी, पूरी तरह से बेहोश है जब तक पशु को ध्यान से देखें. पैर पैड पर्याप्त संज्ञाहरण का एक संकेत है जो पेडल पलटा की कमी के लिए जाँच करने के लिए प्रयोग किया जाता है फैलाएंगे, पेडल सजगता का जवाब नहीं है. </li><li> खरगोश के पेट दाढ़ी, एंटीसेप्टिक समाधान द्वारा पीछा किया, एंटीसेप्टिक हाथ धोने से धो लें, और बाँझ धुंध स्पंज के साथ मुंडा क्षेत्र पोंछे. </li><li> बाँझ शर्तों के तहत सर्जरी प्रदर्शन, सर्जरी के दौरान प्राप्तकर्ता खरगोश लगभग हर 15 मिनट के महत्वपूर्ण संकेत रिकॉर्ड. </li><li> भ्रूण की उपलब्ध संख्या के आधार पर, एक प्राप्तकर्ता जानवर को 10-25 भ्रूण स्थानांतरण. </li><li> के अंत मेंशल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं, लेपित absorbable सीवन के साथ मांसपेशी परत बंद करें. Absorbable सीवन का उपयोग कर एक subcuticular सीवन के साथ या तो या nonabsorable सिवनी (जैसे monofilament नायलॉन या समान) का उपयोग कर सरल बाधित त्वचा sutures के साथ त्वचा सीवन. </li><li> पशु गर्म रखें और अपनी sternal अवलंबन उपलब्ध हो जाता है जब तक यह निगरानी. </li><li> दैनिक पशु मॉनिटर. जानवर की देखभाल के लिए पशु चिकित्सक के निर्देशों का पालन करें. दर्द को राहत देने और / या पशु चिकित्सक द्वारा आवश्यक निर्धारित अगर बुखार दैनिक पोस्ट कार्रवाई को कम करने के लिए meloxicam (SC 1.0 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन. </li><li> के बारे में 10-14 दिनों के बाद आपरेशन में nonabsorable त्वचा टांके निकालें. </li></ol> 6. ZFN प्रेरित जीन विघटन की जांच <ol><li> इन विट्रो सत्यापन के लिए, इन विट्रो सुसंस्कृत भ्रूण पर जीनोटाइपिंग प्रदर्शन करते हैं. 5 μl NP40 समाधान (1% NP40 प्लस 1 यूजी में morula / ब्लास्टोसिस्ट चरण के लिए विकसित / एमएल Taq बफर में proteinase कश्मीर कि lyse व्यक्तिगत भ्रूण) 55 डिग्री सेल्सियस पर 0.5-1 घंटा, और 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए </li><li> संतानों की जीनोटाइपिंग के लिए, नवजात किट से कान त्वचा के नमूने लेने जीनोमिक डीएनए निकालने, और पीसीआर अनुक्रमण के लिए टेम्पलेट्स के रूप में उपयोग. रक्तस्राव को रोकने और परेशानी को कम करने के लिए इकट्ठा करने के बाद नमूना क्षेत्र के लिए क्विक बंद करो लागू करें. </li><li> ला Taq और ZFN लक्ष्य साइट के अपस्ट्रीम स्थित (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG -3 &#39;) और (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC -3 बहाव के&#39;) कर रहे हैं जो पीसीआर प्राइमर जोड़ी का उपयोग करते हुए पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में कदम 6.2 या 6.3 से सेल का प्रयोग करें . </li><li> पीसीआर उत्पादों को शुद्ध और अनुक्रमण प्राइमर (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG -3 &#39;) के साथ उन्हें अनुक्रम. </li><li> लक्ष्यीकरण स्थल के आसपास अनुक्रम आरेख में डबल वक्र की तलाश द्वारा उत्परिवर्ती नमूने को पहचानें. &quot;सकारात्मक&quot; के रूप में डबल घटता के साथ लोगों को लेबल. </li><li> , टीए क्लोनिंग वेक्टर में &quot;सकारात्मक&quot; पीसीआर उत्पादों क्लोन 10-20 क्लोन, अनुक्रम आवेषण उठा, और टी के आसपास म्यूटेशन की पुष्टिargeting साइट. </li></ol>

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

काम में मौजूद है, पांच ApoCIII को खरगोश ZFN प्रौद्योगिकी का उपयोग कर उत्पन्न किया गया. इससे पहले GTT खरगोश के उत्पादन का केवल रिपोर्ट में यह भी ZFN प्रौद्योगिकी 18 का इस्तेमाल किया. वर्तमान कार्य ZFN प्रभावी ढंग से खरगोश में जीनों को लक्ष्य करने के लिए उपयोगी है कि पुष्टि की. अध्ययन में मौजूद है, खरगोश में पिछले ZFN रिपोर्ट (30.8%, 16/52) 18 के बराबर है, और उन जो सूचना दी ट्रांसजेनिक दर (सकारात्मक किट / कुल) का जन्म is23.8% (5/21), ज़ेबरा मछली 19, चूहों 20 चूहों 21 और सूअरों 17 सहित अन्य जानवरों की प्रजातियों में ZFN का उपयोग कर की. यह दर सामान्य रूप से 5-20% की सीमा में गिर जो कई पारंपरिक ट्रांसजेनिक खरगोश उत्पादन पढ़ाई, की दर से अधिक वास्तव में है. उदाहरण के लिए, पारंपरिक डीएनए microinjection के माध्यम से उत्पाद ApoCIII ट्रांसजेनिक खरगोश के प्रयास में, डिंग एट अल. (5.6%) जन्म 22 54 पिल्ले से बाहर 3 सकारात्मक संस्थापकों प्राप्त की. पिछले निष्कर्षों के साथ संगत को लक्षित स्थलों पर म्यूटेशन (पांच को खरगोशों में 1-21 लेकर) ठिकानों की विभिन्न संख्या मिलकर विलोपन या सम्मिलन सहित, चर रहे हैं. संस्थापक जानवरों के विशिष्ट अनुक्रम जानकारी के आधार पर यह (Δ1, 1, 1, या Δ20 म्यूटेशन युक्त उन अर्थात्.) ApoCIII के समारोह में नुकसान होता है कि कम से कम चार भविष्यवाणी की है. इस उत्परिवर्तन सात अमीनो एसिड के ही कारण नुकसान की भविष्यवाणी की है, लेकिन एक पढ़ने फ्रेम बदलाव नहीं किया गया है के रूप में पशु आर -16 Δ21 साथ, कार्यात्मक हानि प्रदर्शित नहीं हो सकता. अंत में, फेनोटाइप assays इन संस्थापक जानवरों वास्तव में ApoCIII कार्यों की हानि प्रदर्शित निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं. वर्तमान अध्ययन में उत्पन्न पाँच को खरगोशों से कोई biallelic संशोधनों होते हैं. दिलचस्प है, यह भी पिछले ZFN खरगोश की रिपोर्ट में मामला है. इसके विपरीत, ZFNs α1 ,3-galactosyltransferase लक्ष्य बनाते समय सुअर के लिए लागू किया गयाकोशिकाओं, 23 knockouts biallelic एकल कदम बनाने परिवर्तन के लगभग एक तिहाई के साथ, 7-46% से लेकर एक एकल एलील को निशाना बनाने की आवृत्ति. Talen सुअर fibroblast कोशिकाओं को लागू किया गया था जब इस के अनुरूप,, biallelic संशोधनों कुल सकारात्मक क्लोन 14 के लगभग 15-40% में पाए गए. यह वर्तमान अध्ययन में biallelic को खरगोश उत्पन्न करने के लिए विफलता को लक्षित nuclease आधारित जीन की ऐसी क्षमता के लिए एक प्रजाति का अंतर (यानी खरगोश बनाम सूअर) का संकेत हो सकता है कि संभव है. यह इस परियोजना में उत्पन्न को खरगोश की संख्या अपेक्षाकृत छोटा है क्योंकि यह बस है कि हालाँकि, और अधिक होने की संभावना है. हम ZFN ZFN आधारित GTT खरगोश उत्पादन का एक और संभावित लाभ के रूप में माना जाना चाहिए जो खरगोश में bialleic म्यूटेशन पैदा करने में सक्षम है कि विश्वास करते हैं. आगे के प्रयोगों खरगोश में ZFN की ऐसी क्षमता की पुष्टि करने की जरूरत है. अंत में, वर्तमान कार्य दर्शाता है कि जेडदृष्टिकोण को लक्षित एफ एन आधारित जीन को खरगोश का निर्माण करने में प्रभावी है. विशेष रूप से, हम 23.8% की एक संतोषजनक ट्रांसजेनिक दर के साथ पांच ApoCIII को खरगोश उत्पन्न. इन जानवरों को इसी माउस मॉडल की तुलना में मानव में लिपिड metabolisms पर इस प्रोटीन की भूमिका के बारे में अधिक सार्थक जानकारी प्रदान करने के लिए माना जाता है. हम ZFN आधारित जीन लक्ष्यीकरण, साथ ही इस तरह के talen और RGEN के रूप में अन्य nuclease आधारित प्रौद्योगिकियों की भविष्यवाणी, nonmurine पशुओं में काफी विभिन्न मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए उपन्यास पशु मॉडल के विकास की सुविधा होगी. <img alt="चित्रा 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> चित्रा 1. ZFN प्रौद्योगिकी का उपयोग पीटकर खरगोश के उत्पादन के चार्ट प्रवाह. ZFN प्रौद्योगिकी का उपयोग को खरगोश का उत्पादन ब्याज की जीन के चयन के साथ शुरू होता है. अनुक्रम जानकारी ZFN सेट तैयार कर रहे हैं, प्रदान की, और Subj हैected खमीर को घर में मान्यता आधारित है. जाँच बिंदु (सीपी) 1 (सीपी -1) में, घर में मान्यता (आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के 50% या अधिक) पारित केवल उन सेट के चयन के लिए उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध कराया जाएगा. कोई सेट सीपी -1 गुजरती हैं, तो अतिरिक्त अनुक्रम प्रभावी ZFN सेट को डिजाइन करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इन विट्रो भ्रूण मान्यता चयनित ZFN सेट चयनित साइटों (सीपी -2) में म्यूटेशन पैदा कर सकते हैं सुनिश्चित करने के लिए पीछा किया जाता है. यह (इन विट्रो भ्रूण में&gt; = 10% उत्परिवर्तन दर) CP-2 गुजरता अगर ZFN सेट (ओं) ही उपयोग किया जाएगा. सी.पी. -2 में विफलता ZFN सेट का एक नया स्वरूप की आवश्यकता होगी. भ्रूण दाताओं तैयार हो जाएगा और pronuclear चरण भ्रूण मान्य ZFN सेट के साथ microinjected किया जाएगा. ये microinjected भ्रूण सिंक्रनाइज़ भ्रूण प्राप्तकर्ताओं को हस्तांतरित किया जाएगा. एक माह के गर्भ की अवधि के बाद, नवजात शिशुओं (सीपी -3) genotyped किया जाएगा. नवजात शिशुओं में से कोई भी सकारात्मक रहे हैं, अतिरिक्त microinjection प्रदर्शन किया जाएगा. यह n संभालने, सी.पी.-2 के लिए इस परियोजना के शुरू होने से 2-3 महीने लग जाते हैंप्रक्रिया के दौरान ओ विफलता. यह सीपी -3 के लिए CP-2 से अतिरिक्त 2-3 महीने लग जाते हैं. इसलिए यह ZFN प्रौद्योगिकी का उपयोग कर एक 4-6 महीने की समय सीमा में एक पीटा खरगोश उत्पन्न करने के लिए संभव है. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> . <img alt="चित्रा 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> चित्रा 2. ZFN डिजाइन. तीन ZFN सेट (, 2 1 सेट, और 3) एक्सॉन 1 या खरगोश ApoCIII (ए) के एक्सॉन 2 पर विभिन्न दृश्यों को लक्षित डिजाइन किए गए थे. सभी तीन सेटों ZFN गतिविधियों का निर्धारण करने के लिए खमीर एमईएल -1 संवाददाता परख के अधीन थे. निर्माण के प्रोटोकॉल के अनुसार, निर्माण के आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण की है कि&gt; 50% गतिविधियों बताते हैं कि ZFNs में इन विट्रो और इन विवो जीनोम संपादन प्रयोगों में के लिए उपयोगी माना जाता है.ZFN गतिविधियों इसलिए 1 वर्तमान अध्ययन में चयनित किया गया था सेट, 1 सेट के लिए 224.2%, 2 सेट के लिए 196.9% और सेट 3 (ख) के लिए 177.8% थे. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> . <img alt="चित्रा 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> ZFN की चित्रा 3. इन विट्रो भ्रूण मान्यता. सेट 1 की mRNA (5 ग्राम / एमएल) 35 pronuclear चरण खरगोश भ्रूण (ए) के cytoplasm को microinjected किया गया था. Microinjection उपचार (एन = 31) के बिना प्लावित भ्रूण नियंत्रण समूह के रूप में इस्तेमाल किया गया. बीएल विकास दर नियंत्रण समूह में 77.4% थी. Microinjected समूह में, बीएल दर 51.4% थी. पीसीआर अनुक्रमण के अधीन 16 बी एल से 8 (50%) सकारात्मक रूप में पहचान की गई, सेट 1 का संकेत targe में म्यूटेशन के लिए प्रेरित करने के लिए एक प्रभावी ZFN सेट हैting साइट (बी, apoc3wt.seq, काले बॉक्सिंग) खरगोश में ApoCIII की. म्यूटेशन युक्त बीएलएस बीएल # APOC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, और 17 (बी, लाल रेखांकित). शेष BLS (# APOC-2, 6, 9, 10, 12, 14 और 16) लक्ष्यीकरण साइट पर म्यूटेशन नहीं है. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> . <img alt="चित्रा 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> चित्रा 4. ApoCIII को खरगोश का उत्पादन. ZFN सेट 1 mRNAs साथ microinjected एक सौ पैंतालीस भ्रूण 7 छद्म गर्भवती प्राप्तकर्ता खरगोश (ए) को स्थानांतरित कर दिया गया. ZFN microinjection बिना हौसले प्लावित भ्रूण (एन = 75) प्राप्तकर्ताओं को हस्तांतरित किया गया है (n = 6) नियंत्रण समूह के रूप में. प्रयोग समूह में कुल अवधि किट / कुल भ्रूण के रूप में गणना की अवधि की दर 14 है.5% (21/145), दर नियंत्रण समूह में (22/75) 29.3% है, जबकि (ए). Microinjected समूह, पाँच (आर 1, R9, R11, R12 और R16) में पैदा हुए 21 किट के बाहर पीसीआर अनुक्रमण (बी) के बाद के रूप में सकारात्मक को किट की पहचान की गई. लक्ष्यीकरण साइट पर indels दो सम्मिलन (R9 और R11 दोनों के लिए एक) और तीन विलोपन (क्रमशः Δ1, Δ 20, R1, R12 और R16 के लिए Δ 21) शामिल हैं. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> .

अपोलीपोप्रोटीन (ए पी ओ) सी-III (ApoCIII) जिगर और आंत में मुख्य रूप से संश्लेषित है कि एक छोटी सी ओ ग्लाइकोसिलेटेड स्रावी प्रोटीन होता है. यह प्लाज्मा भोजन की वसा के पाचन एवं अवशोषण के पश्चात् रक्त में पाया जाने वाला वसालीका का छोटा कण (मुख्यमंत्री) की सतह पर बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (वीएलडीएल) और उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन (एचडीएल) रहता है. ApoCIII हृदय रोग 1 के लिए एक जोखिम कारक के रूप में पहचाना गया है. ApoCIII की वंशानुगत कमी के साथ रोगियों कम प्लाज्मा ट्राइग्लिसराइड (टीजी) के स्तर और कम subclinical कोरोनरी धमनी atherosclerosis 2,3 है. बुलंद प्लाज्मा ApoCIII स्तर, दूसरे हाथ पर, अक्सर इंसुलिन प्रतिरोध, मोटापा, और हाइपरट्राइग्लिसरीडेमिया (HTG) 4,5 के साथ संबद्ध करता है. जीन पीटा (को) एक जीन के समारोह में अध्ययन करने के लिए एक सशक्त माध्यम है. मानव उत्परिवर्ती आबादी में टिप्पणियों के साथ संगत, चूहों में ApoCIII जीन की पीटकर एक प्लाज्मा टीजी में कमी और भोजन के बाद HTG 6 से सुरक्षा के लिए नेतृत्व किया. ApoCIII के इस तरह के सकारात्मक भूमिका दिखाई दियाApoE और ApoCIII दोनों के चूहों की कमी भी भोजन के बाद हाइपरलिपिडीमिया 7 से संरक्षित कर रहे हैं, अपोलीपोप्रोटीन ई (APOE) के स्वतंत्र होने के लिए. इन ApoCIII KO माउस मॉडल मानव में ApoCIII के संभावित कार्यों पर अमूल्य जानकारी प्रदान की है, यद्यपि यह चूहों की लिपोप्रोटीन की चयापचय कई पहलुओं में मनुष्य के उस से अलग है कि विख्यात है. उदाहरण के लिए, माउस प्लाज्मा cholesteryl एस्टर स्थानांतरण प्रोटीन (CETP), वीएलडीएल, एलडीएल के परिवहन में शामिल एक प्रमुख एंजाइम, और एचडीएल 8 का अभाव है. इसलिए, यह आगे vivo में ApoCIII की शारीरिक भूमिका को समझने के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल विकसित करने के लिए आवश्यक है. खरगोश एक शास्त्रीय मॉडल पशु प्रजातियों 9-11 है. यह एक छोटी अवधि (30-31 दिन), बड़े कूड़े का आकार (4-12/litter) है और एक इनडोर सुविधा में आसानी से रखे जा सकते हैं. चूहों की तुलना में, खरगोश मनुष्यों 10 जातीवृति के आधार पर करीब हैं. महत्वपूर्ण बात है, जैसे हूआदमी लेकिन चूहों के विपरीत, खरगोश एलडीएल अमीर स्तनधारियों हैं और CETP 10,12 के पर्याप्त स्तर है. इसके अलावा, वे मानव atherosclerosis के 13 में देखा उन के समान घावों के साथ कोलेस्ट्रॉल युक्त आहार प्रेरित atherosclerosis करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. इन कारणों के लिए, हम ApoCIII को खरगोश मानव में लिपिड चयापचय और atherosclerosis में ApoCIIIplay की भूमिका की जांच के लिए अपने माउस समकक्षों की तुलना में एक बेहतर मॉडल के रूप में काम कर सकते हैं कि धारणा. जीन का उत्पादन (GTT) खरगोश एक चुनौती रहा है ट्रांसजेनिक को निशाना बनाया. इस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) के प्रसारण के germline की कमी है, और खरगोश में दैहिक सेल परमाणु हस्तांतरण (SCNT) की बेहद कम क्षमता की वजह से है. और SCNT सफलतापूर्वक सूअर, भेड़ और मवेशी, लेकिन नहीं खरगोश सहित germline संचारण ESCs, कमी प्रजातियों में KO जानवरों उत्पन्न करने के लिए लागू किया गया है जबकि ईएससी, GTT चूहों उत्पन्न करने के लिए प्राथमिक उपकरण है. हाल ही में जिंक फिंगर Nuclease (ZFN), ट्रॅनscription उत्प्रेरक की तरह effector के Nuclease (talen) 14, और शाही सेना गाइडेड endonuclease (RGEN) 15 जीनोम संपादन के लिए के रूप में शक्तिशाली साधन उभरा. इसलिए &quot;आणविक कैंची&quot; नामक ये न्युक्लिअसिज़, लक्षित जीन की एक कार्यात्मक को नेतृत्व करने के लिए या में जीनोम में एक विशिष्ट ठिकाना पर एक डीएनए अनुक्रम को एकीकृत करने के लिए इस्तेमाल कर सकते हैं कि जीनोम में डबल भूग्रस्त टूटता (डीएसबी) पैदा करने में कुशल हैं प्रजातियों 16 के एक नंबर. 2011 में, ZFN प्रौद्योगिकी आदत डाल पहले के बीच, हम SCNT 17 के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करने के बाद इस दृष्टिकोण से और सफलतापूर्वक उत्पन्न PPARγ को सूअरों के माध्यम से peroxisome proliferator सक्रिय रिसेप्टर गामा (PPARγ) को सुअर की कोशिकाओं को उत्पन्न किया. एक ही वर्ष में, कुशल immunoglobulin जीन विघटन और भी ZFN का उपयोग खरगोश में लक्षित प्रतिस्थापन 18 सूचना मिली थी. (देखें चित्र 1 ZFN 1 सेट का उपयोग कर, पीसीआर अनुक्रमण द्वारा की पुष्टि के रूप में वर्तमान अध्ययन में, पांच ApoCIII को खरगोश उत्पन्न किया गया </sटुनिशिया&gt;. प्रवाह चार्ट उदाहरण के लिए). इन जानवरों को लिपिड metabolisms में ApoCIII की भूमिका का अध्ययन करने के उपन्यास संसाधन हैं.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">APOC3-ZFN</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">CSTZFNY-1KT</td>
			<td style="width:167px;">Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344M</td>
			<td>mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAclear Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">AM1908M</td>
			<td>mRNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Bioniche Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">Folltropin-V</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Intervet</td>
			<td style="width:136px;">Chorulon</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gonadotropin-releasing hormone</td>
			<td>Prospecbio</td>
			<td>HOR-255</td>
			<td>Treating embryo recipient rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30029.02</td>
			<td>Embryo culture, base medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (nonessential amino acid)</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M7145</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BME AMINO ACIDS solution</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">B6766</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffered TCM 199&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td style="width:136px;">12350039</td>
			<td>Embryo manipulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Incubator</td>
			<td style="width:276px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Galaxy 170</td>
			<td>Embryo culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">TransferMan NK 2</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Inc.</td>
			<td style="width:136px;">P-1000</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td style="width:136px;">MINJ-D&#160;</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary tubes&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">TW100F-6</td>
			<td>Embryo manipulation supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Euthasol (pentobarbitol sodium)</td>
			<td style="width:276px;">Virbac AH, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">ANADA#200-071</td>
			<td>Euthanization of embryo donor rabbits</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases

अपोलीपोप्रोटीन (ए पी ओ) सी-III (ApoCIII), प्लाज्मा भोजन की वसा के पाचन एवं अवशोषण के पश्चात् रक्त में पाया जाने वाला वसालीका का छोटा कण (मुख्यमंत्री) की सतह पर बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (वीएलडीएल) और उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन (एचडीएल) रहता है. यह स्वीकार किया गया है कि हृदय रोगों के लिए प्लाज्मा ApoCIII constitutea जोखिम कारक (सीवीडी) के उच्च स्तर पर. बुलंद प्लाज्मा ApoCIII स्तर अक्सर इंसुलिन प्रतिरोध, मोटापा, और हाइपरट्राइग्लिसरीडेमिया साथ संबद्ध है. हालांकि, यह चूहों में लिपोप्रोटीन की चयापचय कई पहलुओं में मनुष्य के उस से अलग है कि विख्यात है, ApoCIIIin लिपिड metabolisms और सीवीडी की भूमिका पर अमूल्य ज्ञान ApoCIII पीटा (को) चूहों सहित ट्रांसजेनिक माउस मॉडल से प्राप्त किया गया है. यह अब बुलंद प्लाज्मा ApoCIII सीधे मेदार्बुदजनक है कि क्या जब तक ज्ञात नहीं है. हम खरगोश मानव लिपिड चयापचय और atherosclerosis का अध्ययन कर एक reasonablemodelfor के रूप में काम कर सकते हैं कि परिकल्पना पर आधारित अध्ययन में मौजूद ApoCIII को खरगोशों को विकसित करने का काम किया. जिंक उंगली nuclease (ZFN) सेट को लक्षित खरगोश ApoCIIIgene पूर्व भ्रूण microinjection के लिए इन विट्रो सत्यापन के अधीन थे. mRNA 35 खरगोश pronuclear चरण भ्रूण की कोशिका द्रव्य को इंजेक्शन, और ब्लास्टोसिस्ट राज्य में उत्परिवर्तन दरों मूल्यांकन किया गया था. Assayed गया कि सोलह ब्लास्टोसिस्ट्स की, लक्ष्यीकरण स्थल पर एक संतोषजनक 50% उत्परिवर्तन दर (8/16) में vivo प्रयोगों के लिए 1 सेट के उपयोग का समर्थन हासिल था. अगला, हम सेट 1 mRNA के साथ 145 भ्रूण microinjected, और 7 प्राप्तकर्ता खरगोश को इन भ्रूण स्थानांतरित कर दिया. 30 दिन के गर्भ के बाद, 21 किट पांच पीसीआर अनुक्रमण assays के बाद ApoCIII को खरगोशों के रूप में पुष्टि की गई जिसमें से, पैदा हुए थे. KO जानवर दर (# KO किट / कुल में जन्म) 23.8% थी. कुल उत्पादन क्षमता (5 kits/145 भ्रूण तबादला) 3.4% है. वर्तमान कार्य ZFN को खरगोश का उत्पादन करने के लिए एक बेहद कारगर तरीका है कि प्रदर्शन किया. ये ApoCIII को खरगोश लिपिड metabolisms में ApoCIII की भूमिका का अध्ययन करने के उपन्यास संसाधन हैं.

ZFN जोड़े के इन विट्रो सत्यापन में सोलह ZFN जोड़े शुरू में डिजाइन किए गए थे. 1 सेट के लक्षित विघटन अनुक्रम खरगोश ApoCIII की एक्सॉन 2 (2A चित्रा) में स्थित है. तीन जोड़े (सेट 1, 2, और 3, 2A चित्रा) चयनित और ZFN गतिविधियों (चित्रा 2B) निर्धारित करने के लिए खमीर एमईएल -1 संवाददाता परख के अधीन थे. 1 सेट 2 (196.9%) और सेट 3 (177.8%) की तुलना में अधिक है और चयन सीमा (आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण की यानी 50%) की तुलना में काफी ज्यादा 224.2% की एक ZFN स्कोर है, सेट करें. इसलिए 1 सेट में इन विट्रो मान्यता प्रयोगों के लिए चुना गया था. एक विशेष सेट आंतरिक सत्यापन मानदंडों के आधार पर इन विट्रो भ्रूण सत्यापन, पारित करने के लिए 10% या अधिक की भ्रूण में एक सकारात्मक दरों में कमी की जरूरत है. सेट 1 की mRNA (5 ग्राम / एमएल) 35 pronuclear चरण खरगोश भ्रूण (चित्रा 3A &lt;की कोशिका द्रव्य को microinjected किया गया था/ मजबूत&gt;). Microinjection उपचार (एन = 31) के बिना प्लावित भ्रूण नियंत्रण समूह के रूप में इस्तेमाल किया गया. Microinjected समूह के अठारह भ्रूण सोलह अनुक्रम थे, जिनमें से D5 पर बीएल चरण के लिए विकसित की है, और आठ (बीएल # APOC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, चित्रा 3 बी, लाल रेखांकित) प्रदर्शित उत्परिवर्तित लक्ष्यीकरण साइट (काले बॉक्सिंग, चित्रा 2B, शीर्ष पंक्ति, apoC3wt.seq) में दृश्यों. Microinjected समूह (51.4%) के बीएल दर microinjected भ्रूण का थोड़ा बिगड़ा विकास क्षमता का संकेत नियंत्रण समूह (77.4%), की तुलना में कम है. microinjected भ्रूण की सकारात्मक उत्परिवर्तन दर चयन सीमा से काफी ज्यादा 50.0% (16/8), (यानी 10%) है. इन परिणामों के सेट 1 खरगोश ApoCIII को निशाना स्थल पर म्यूटेशन के लिए प्रेरित करने के लिए एक प्रभावी ZFN सेट है कि पता चला. इसलिए सेट 1 ApoCIII को खरगोश के vivo उत्पादन के लिए चुना गया था. ApoCIII को खरगोश का उत्पादन mRNA ओच ZFN सेट 1 खरगोश pronuclear चरण भ्रूण की कोशिका द्रव्य को microinjected, और 7 छद्म गर्भवती प्राप्तकर्ता खरगोश (चित्रा -4 ए) को 145 microinjected भ्रूण स्थानांतरित किया गया था. ZFN microinjection बिना हौसले प्लावित भ्रूण (एन = 75) प्राप्तकर्ताओं को हस्तांतरित किया गया है (n = 6) नियंत्रण समूह के रूप में. गर्भ के 30 दिनों के बाद, 21 किट microinjected समूह में पैदा हुए थे. पीसीआर अनुक्रमण सकारात्मक को किट (चित्रा 4 बी) के रूप में पांच (apoC3-R1, R9, R11, R12 और R16) की पहचान की. दर नियंत्रण समूह में (22/75) 29.3% है, जबकि कुल अवधि किट / कुल भ्रूण के रूप में गणना की अवधि दर, 14.5% (21/145) है. कुल KO किट / कुल अवधि के रूप में गणना को दर 23.8% (5/21) है. एक को किट (APOC-R16) पांच दिन प्रसवोत्तर (20.0%, 1/5) की मौत हो गई. लक्ष्यीकरण साइट indelsat दो सम्मिलन और तीन विलोपन शामिल हैं, वे खरगोश क्रमश # R1, R9, R11, R12, और R16, चित्रा (4 बी) के लिए, एक, एक, Δ20 और Δ21 areΔ1. बीआईपहले 17 के रूप में वर्णित oinformatics विश्लेषण, 1 अनुक्रम सेट करने के लिए 7 या उससे कम बेमेल के साथ बंद लक्ष्य संभावित ZFN की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. केवल एक 14 गुणसूत्र पर स्थित, संभव बंद लक्ष्य साइट की भविष्यवाणी, 7 बेमेल बीपीएस के साथ की पहचान की थी. पीसीआर परख संस्थापक जानवरों में से किसी में कोई बंद लक्ष्य घटनाओं का पता चला.

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Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ का उपयोग अपोलीपोप्रोटीन सी-III नॉकआउट खरगोशों का उत्पादन

जीन को लक्षित उपकरणों में हाल ही में विकास पीटकर का उत्पादन (को) खरगोश संभव बनाता है. काम में मौजूद है, हम जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFN) का उपयोग करते हुए पांच अपोलीपोप्रोटीन (ए पी ओ) सी-III को खरगोश उत्पन्न. इस काम ZFN को खरगोश का उत्पादन करने के लिए एक बेहद कारगर तरीका है कि प्रदर्शन किया.

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

एक Bioassay रूप गोजातीय Mesenteric धमनी और शिरा की धारा अलग और उपयोग करना छोटी आंत में Vasoactivity के लिए टेस्ट

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

खरगोशों में subretinal सर्जरी के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

एक उच्च Throughput, मल्टिप्लेक्स और लक्षित प्रोटिओमिक सीएसएफ परख Neurodegenerative Biomarkers और apolipoprotein ई isoforms स्थिति यों

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Apolipoprotein ई की कमी चूहों में Mineralocorticoid रिसेप्टर्स के सक्रियकरण के माध्यम से Atherosclerotic सजीले टुकड़े की प्रेरण

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

पूर्व नैदानिक मॉडल पश्च अंग के Ischemia मधुमेह खरगोशों में

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

खरगोशों में पूर्ण Dacryoadenectomy का उपयोग कर एक गंभीर सूखी आंख मॉडल की स्थापना

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Blind Endotracheal Intubation in Neonatal Rabbits

नवजात खरगोशों में ब्लाइंड एंडोट्रेक्याल इंस्टुबेशन

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical ...

Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits

होश में संयमित खरगोशों में बरामदगी, अतालता और एपनिया की पहचान के लिए बहु-प्रणाली निगरानी

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease ...

Three-Dimensional Finger Motion Tracking during Needling: A Solution for the Kinematic Analysis of Acupuncture Manipulation

Needling के दौरान तीन आयामी उंगली गति ट्रैकिंग: एक्यूपंक्चर हेरफेर के कीनेमेटिक विश्लेषण के लिए एक समाधान

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D ...

A Modified Technique for Arteriovenous Fistula Construction in Rabbits

खरगोशों में धमनीशिरापरक फिस्टुला निर्माण के लिए एक संशोधित तकनीक

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury ...