Name: production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases
Uploaded: 2013-11-18T21:00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis finansiert med tilskudd fra National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652, og HL068878 til YEC), American Heart Association (National Forsker Development 0835237N til JZ). YEC er finansielt støttet som begavet Frederick Huetwell Professor of Cardiovascular Medicine ved University of Michigan Medical Center (UMMC). Dette arbeidet benyttes Core Services støttes av Center for Advanced Modeller for Translasjonsforskerne Sciences og Therapeutics (CAMTraST) på UMMC.

Alle dyr vedlikehold, pleie og bruke prosedyrer ble gjennomgått og godkjent av Universitetet komité for bruk og stell av dyr av University of Michigan. En. ZFN Design og utvelgelse <ol><li> Tilførsel av den genomiske sekvens informasjonen av genet av interesse (for eksempel kanin ApoCIII) til produsenten. Velg ZFN sett (er) for forsøkene basert på ZFN score. </li></ol> 2. Rabbit Embryo Collection <ol><li> Superovulate seksuelt modnet (6-18 måneder) New Zealand Hvit (NZW) hunnkaniner ved subkutan (sc) injeksjon av FSH to ganger / dag med en dose på 3 mg for de første to injeksjoner, 5 mg for de neste to injeksjoner og 6 mg for de to siste injeksjoner. </li><li> Administrer en enkel intravenøs (iv) injeksjon av 200 IU hCG i 72 timer etter den første FSH-injeksjon for å indusere eggløsning. Mate de superovulated hunner med en mannlig kanin umiddelbart etter hCG-injeksjon. </li><li> Euthanize de superovulated donor kaniner med natrium-pentobarbital (150 mg / kg, iv) ved 16 til 18 timers post inseminering (psi). </li><li> Gjenopprette oviduct ampullae etter nøye samle hele oviduktene og eggstokker struktur. </li><li> Spyl hver oviduct med 10 ml manipulering av HEPES-bufret medium TCM 199 supplert med 10% føtalt bovint serum, ved å injisere mediet fra livmoren enden av egglederen. Samle spylt medium ved eggstokk-ende åpning av egglederen i en petriskål. </li><li> Observere og identifisere gjenvunnet embryoer i bluss medium, vaske embryoene tre ganger i manipulering medium, holde dem i manipulering medium på 38,5 ° C i luft, og observere dem under et stereomikroskop for forekomsten av befruktning. Forbered deg på mikroinjeksjon på pronuclear scene embryoer 19-21 h psi </li></ol> Tre. Utarbeidelse av ZFN mRNA <ol><li> Rens det resulterende mRNA før resuspensjon i RNAse-fri 0,1 X TE (1 mM Tris-Cl pH8,0, 0,1 mM EDTA). Måle konsentrasjonen og lagre mRNA ved -80 ° C inntil bruk. </li><li> Forbered mRNA som koder ZFN par (4-10 ng / mL i en mMTris-Cl, 0,1 mM EDTA ved pH 7,5), delmengde inn 10 mL ampuller. Oppbevar dem ved -80 º C til alt er klart til bruk. Før mikroinjeksjon, tine RNA hetteglass (s), og holde den på is. </li></ol> 4. Embryo Mikroinjeksjon <ol><li> Forbered mikroinjeksjon plattformen ved å plassere en 5 mL dråpe manipulasjon medium på et 1-vel kammer lysbilde som har mediekammeret fjernes. Dekk medium dråpe med mineralolje og sted på den oppvarmede mikroskop scenen. </li><li> Plasser holder pipette (120 mikrometer i diameter) inn i holderen arm av mikromanipulator og posisjonere den i dråpe manipulasjon medium. </li><li> Dikte injeksjon mikropipetter ved oppvarming og trekke borsilikatglass kapillarrør i en mikropipette avtrekker enhet. Legg mRNA som skal injiseres i injeksjons pipette. </li><li>Slå på trykklufttilførsel som er koblet til en microinjector. </li><li> Plasser injeksjon pipette i injeksjonsholderen, satte den på mikromanipluatoren og plassere det inn i dråpe manipulasjon medium. </li><li> Setup microinjector, med følgende foreslåtte parametere: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, Injtime = 1 sek, noe som vil resultere i et injeksjonsvolum på 1-5 pl. </li><li> Åpne tuppen av injeksjons pipetten ved å banke den mot holding pipette. </li><li> Overfør embryoer (30-50) til micromanipulation fallet på plattformen. Bruk beholdning pipetten til å ta et embryo og justere injeksjonsnålen, embryo og holde pipetten langs x-aksen. </li><li> Under 400X forstørrelse, fremme injeksjon pipette gjennom embryo. Vær forsiktig for å unngå kjernen. Når plasma membranen er gjennomboret, trykker pedalen injisere. Etter injeksjon, trekke nålen, slipper embryo. Gjenta prosessen for alle gjenværende embryos. </li><li> Vask injiserte embryoer tre ganger i embryo dyrkningsmedium, som består av Earles Balanced Salt Solution (EBSS) supplementert med ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), essensielle aminosyrer (EAA), 1 mM L-glutamin, 0,4 mM natrium-pyruvat, og 10% FBS. </li><li> Inkuber embryoer ved 38,5 ° C i 5% CO2 i luft i 1-2 timer før de blir overført kirurgisk inn i egglederne hos en synkronisert mottaker hunn NZW kanin (se trinn 5.1). Alternativt, kultur embryoene til de når blastocyst stadiet før de brukes til in vitro validering eller analyser. </li></ol> 5. Embryo Transfer <ol><li> Velg en kvinnelig NZW kanin 5-12 måneder gammel, i god helse, veier ca. 4,0 til 5,0 kg som mottaker dyr. Administrer Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) injeksjon intramuskulært (im, 50 mcg / ml, 0,3 ml / dyr) til mottakeren på samme tid punktet med den av hCG-injeksjon til donordyre (e) (se trinn 2.2). </li&gt; <li> Etter ferdigstillelse av mikroinjeksjon, klar mottaker kanin for embryo (normalt 16-24 timer etter GnRH injeksjon). Anesthetize kanin med 10 til 40 mg / kg ketamin (im), og / eller fordampede isofluran (2-4%) ved innånding. Beskytt kaninens øyne mot overdreven uttørking ved anvendelse av et sterilt oftalmisk salve. Observere dyret før det er fullt bevisstløs, altså. ikke svare på pedal reflekser; klemme foten pad brukes til å sjekke for mangel på pedal refleks som er en indikasjon på tilstrekkelig anestesi. </li><li> Barbere kaninens mage, vask med antiseptiske skrubb, etterfulgt av antiseptisk løsning, og tørk det barberte området med sterilt gasbind svamper. </li><li> Utføre operasjonen under sterile betingelser, opp vitale tegn på mottaker kanin omtrent hvert 15 min i løpet av operasjonen. </li><li> Overfør 10-25 embryoer til én mottaker dyr, avhengig av tilgjengelig antall embryoer. </li><li> Ved slutten av denkirurgiske prosedyrer, lukke muskelen laget med belagt absorberbare sutur. Sutur huden med enten en subcuticular sutur ved hjelp av absorberbare sutur eller med enkle avbrutte hud sting ved hjelp nonabsorable sutur (f.eks monofilament nylon eller lignende). </li><li> Hold dyret varm og overvåke det til sin sternal recumbency er oppnådd. </li><li> Overvåk dyret daglig. Følg veterinærens instrukser for å ta vare på dyret. Administrer meloksikam (sc 1,0 mg / kg) for å lindre smerter og / eller redusere feber daglig innlegg operasjonen hvis bestemmes nødvendig av veterinær. </li><li> Fjern nonabsorable hud sting på ca 10-14 dager etter operasjonen. </li></ol> 6. Påvisning av ZFN Induced Gene Forstyrrelse <ol><li> For in vitro validering, utføre genotyping på in vitro dyrkede embryoer. Lyse individuelle embryoer som er utviklet for å morula / blastocyst stadier i 5 mL NP40 løsning (1% NP40 pluss 1 ug / ml proteinase K i Taq Buffer) På 0,5-1 timer ved 55 ° C og 10 min ved 95 ° C. </li><li> For genotyping av avkommet, samle øret huden prøver fra nyfødte kits, trekke genomisk DNA, og bruke dem som maler for PCR sekvensering. Påfør Kwik-Stop til prøvetaking området etter samlingen for å stoppe blødning og redusere ubehag. </li><li> Bruk lysis fra trinn 6.2 eller 6.3 som templat for PCR ved bruk av LA-Taq-og PCR-primer-par, som er plassert oppstrøms (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;) og nedstrøms (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3&#39;) av ZFN målstedet . </li><li> Rens PCR-produkter og sekvensere dem med sekvense primer (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;). </li><li> Identifiser mutant prøvene ved å se etter dobbel kurve i sekvensdiagram rundt målretting nettstedet. Merke de med doble kurver som &quot;positive&quot;. </li><li> Klone &quot;positive&quot; PCR-produkter i TA kloningsvektor, plukke opp 10-20 kloner, sekvens innsatsene, og bekrefte mutasjoner rundt targeting nettstedet. </li></ol>

<ol>
	<li>Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+C-III:+understanding+an+emerging+cardiovascular+risk+factor.">Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor.</a> Clinical Science. 114, 611-624 (2008).</li><li>Pollin, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+null+mutation+in+human+APOC3+confers+a+favorable+plasma+lipid+profile+and+apparent+cardioprotection.">A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection.</a> Science. 322, 1702-1705 (2008).</li><li>Ginsberg, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+B+metabolism+in+subjects+with+deficiency+of+apolipoproteins+CIII+and+AI.+Evidence+that+apolipoprotein+CIII+inhibits+catabolism+of+triglyceride-rich+lipoproteins+by+lipoprotein+lipase+in+vivo.">Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo.</a> The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).</li><li>Cohn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+apoC-III+production+is+a+characteristic+feature+of+patients+with+hypertriglyceridemia.">Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia.</a> Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).</li><li>Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+production+of+plasma+and+very-low-density+lipoprotein+(VLDL)+apolipoprotein+C-III+is+strongly+related+to+the+concentration+and+level+of+production+of+VLDL+triglyceride+in+male+subjects+with+different+body+weights+and+levels+of+insulin+sensitivity.">Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).</li><li>Maeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+apolipoprotein+C-III+gene+in+mice+results+in+hypotriglyceridemia+and+protection+from+postprandial+hypertriglyceridemia.">Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia.</a> The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).</li><li>Jong, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+C-III+deficiency+accelerates+triglyceride+hydrolysis+by+lipoprotein+lipase+in+wild-type+and+apoE+knockout+mice.">Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice.</a> Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).</li><li>James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+physiology+in+transgenic+mice.">Cardiac physiology in transgenic mice.</a> Circ. Res. 82, 407-415 (1998).</li><li>Duranthon, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+emerging+role+of+rabbit+as+human+disease+model+and+the+instrumental+role+of+novel+transgenic+tools.">On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools.</a> Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).</li><li>Fan, J., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rabbits+as+therapeutic+protein+bioreactors+and+human+disease+models.">Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models.</a> Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).</li><li>Shiomi, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Watanabe+heritable+hyperlipidemic+(WHHL)+rabbit,+its+characteristics+and+history+of+development:+a+tribute+to+the+late+Dr.+Yoshio+Watanabe.">The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe.</a> Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).</li><li>Morehouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CETP+activity+by+torcetrapib+reduces+susceptibility+to+diet-induced+atherosclerosis+in+New+Zealand+White+rabbits.">Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits.</a> Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).</li><li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li><li>Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+editing+of+bacterial+genomes+using+CRISPR-Cas+systems.">RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.</a> Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).</li><li>Petersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+'molecular+scissors'+for+transgenic+farm+animal+production.">Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+PPARgamma+mono-allelic+knockout+pigs+via+zinc-finger+nucleases+and+nuclear+transfer+cloning.">Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning.</a> Cell Research. 21, 979-982 (1038).</li><li>Flisikowska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+immunoglobulin+gene+disruption+and+targeted+replacement+in+rabbit+using+zinc+finger+nucleases.">Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases.</a> PLoS ONE. 6, e21045 (2011).</li><li>Foley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+zebrafish+using+customized+zinc-finger+nucleases.">Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases.</a> Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).</li><li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li><li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+knockout+rats+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+(X-SCID)+using+zinc-finger+nucleases.">Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases.</a> PLoS ONE. 5, e8870 (2010).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertriglyceridemia+and+delayed+clearance+of+fat+load+in+transgenic+rabbits+expressing+human+apolipoprotein+CIII.">Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII.</a> Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).</li><li>Hauschild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+a+biallelic+knockout+in+pigs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

I dette arbeidet ble fem ApoCIII KO kaniner generert ved hjelp av ZFN teknologien. Tidligere den eneste rapporten fra produksjon av GTT kaniner brukte også ZFN teknologi 18. Det foreliggende arbeidet bekreftet at ZFN er nyttig å effektivt målrette gener i kaniner. I den foreliggende studien, den transgene rate (positive kits / totalt født) is23.8% (5/21), som er sammenlignbar med den forrige ZFN rapport i kaniner (30.8%, 16/52) 18, og de ​​rapporterte for å bruke ZFN i andre dyrearter, inkludert zebrafisk 19, mus 20, rotter 21 og griser 17. Denne hastighet er i virkeligheten høyere enn tallene for mange konvensjonelle transgene kanin produksjons studier, som normalt faller i området fra 5-20%. For eksempel, i et forsøk på å Produktet ApoCIII transgene kaniner via konvensjonelle DNA-mikroinjeksjon, Ding et al. Erholdt 3 positive erne ut av 54 unger født (5,6%) 22. I samsvar med tidligere funn, de mutasjoner ved målretting nettsteder er variabel, inkludert joner eller innskudd som består forskjellig antall baser (spenner 1-21 i de fem KO kaniner). Basert på den spesifikke sekvens informasjon av grunnleggerne dyr, er det spådd at minst fire (ie. De som inneholder Δ1, 1, 1, eller Δ20 mutasjoner) ville ha funksjon tap av ApoCIII. Animal R-16 med Δ21 kan ikke vise funksjonelt tap, da denne mutasjon er spådd å bare føre til tap av syv aminosyrer, men ikke en leseramme skift. Til syvende og sist fenotype analyser er nødvendige for å bestemme om disse stifter dyrene virkelig viser tapet av ApoCIII funksjoner. Ingen av de fem KO kaniner som genereres i den foreliggende studie inneholde bialleliske modifikasjoner. Interessant, er dette også tilfellet i den forrige ZFN kanin rapport. I kontrast, ble da ZFNs målretting α1 ,3-galactosyltransferase brukes på grisceller, hyppigheten av målretting en enkelt allel varierte 7-46%, med omtrent en tredjedel av mutasjoner som skaper enkelt trinn bialleliske knockouts 23. I samsvar med dette, når TALEN ble påført på pig fibroblastceller ble bialleliske modifikasjoner som finnes i omtrent 15 til 40% av den totale positive kloner 14. Det er mulig at unnlatelse av å generere bialleliske KO kaniner i denne studien kan tyde på en art forskjell (dvs. kaniner vs griser) for en slik kapasitet på nuclease basert genet målretting. Det er imidlertid mer sannsynlig at dette er ganske enkelt fordi antall KO kaniner som genereres i dette prosjektet er relativt liten. Vi tror at ZFN er i stand til å generere bialleic mutasjoner i kaniner, som bør vurderes som en annen potensiell nytte av ZFN basert GTT kanin produksjon. Ytterligere eksperimenter for å bekrefte at en slik kapasitet ZFN hos kaniner. Som en konklusjon, viser den foreliggende arbeid som ZFN basert genet målretting tilnærming er effektive i å produsere KO kaniner. Spesielt genererte vi fem ApoCIII KO kaniner med en tilfredsstillende transgen sats på 23,8%. Disse dyrene er antatt å gi mer meningsfull informasjon om dette proteinet rolle på lipid metabolisme hos mennesker enn de tilsvarende musemodeller. Vi spår ZFN basert genet målretting, samt andre nuklease baserte teknologier som TALEN og rgen, vil i ikke-murint dyr betydelig rette for utvikling av nye dyremodeller for å studere ulike menneskelige sykdommer. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> Figur 1. Kanalisering av produksjon av knockout kaniner bruker ZFN teknologi. Produksjon av KO kaniner som bruker ZFN teknologi starter med valg av genet av interesse. Sekvensen informasjonen er gitt, ZFN sett er utformet, og subjected til gjær basert in-house validering. På sjekkpunkt (CP) 1 (CP-1), vil bare de settene gått in-house validering (50% eller høyere av den interne positiv kontroll) gis til brukerne for utvalget. Hvis ingen sett passerer CP-en, kan ytterligere sekvens være nødvendig for å utforme effektive ZFN sett. En in vitro-embryo validering blir fulgt for å sikre at det valgte ZFN settet kan indusere mutasjoner på utvalgte områder (CP-2). ZFN sett (s) vil kun bli brukt hvis det passerer CP-2 (&gt; = 10% mutasjonsrater i in vitro befruktede egg). Svikt på CP-2 vil kreve en redesign av de ZFN settene. Embryo givere vil bli utarbeidet og pronuclear scene embryo vil bli microinjected med validerte ZFN settene. Disse microinjected embryo vil bli overført til synkroniserte embryo mottakere. Etter en måned drektighetstid, vil nyfødte bli genotypede (CP-3). Hvis ingen av de nyfødte er positive, vil ytterligere mikroinjeksjon utføres. Det tar 2-3 måneder fra prosjektstart til CP-2, forutsatt no svikt i løpet av prosessen. Det tar ytterligere 2-3 måneder fra CP-2 til CP-3. Derfor er det mulig å generere en knockout kanin i en 4-6 måneders tidsramme bruker ZFN teknologien. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> Figur 2. ZFN design. Tre ZFN sett (Sett 1, 2, og 3) ble utformet målretting ulike sekvenser på Exon en eller Exon 2 av kanin ApoCIII (A). Alle tre sett ble utsatt for gjær MEL-1 reporter-analysen for å bestemme de ZFN aktiviteter. I henhold til produsentens protokoller, blir ZFNs som viser&gt; 50% virksomhet av den av fremstilling intern positiv kontroll ansett som nyttige for in vitro-og in vivo-genomet redigerings eksperimenter.De ZFN aktiviteter var 224,2% for Set 1, 196,9% for Set 2 og 177,8% for Set 3 (B), derfor ligger en ble valgt i denne studien. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> Figur 3. In vitro embryo validering av ZFN. Den mRNA (5 ug / ml) av Set 1 ble microinjected til cytoplasma av 35 pronuclear stadium kanin embryoer (A). Spyles embryoer uten mikroinjeksjon behandling (n = 31) ble anvendt som kontrollgruppe. Den BL utviklingshastighet var 77,4% i kontrollgruppen. I microinjected gruppen, BL Prosenten var 51,4%. Av 16 BLs utsatt for PCR-sekvensering, ble 8 (50%) identifisert som positiv, indikerer Set 1 er en effektiv ZFN settet for å indusere mutasjoner ved innsiktnting hotellet (B, apoc3wt.seq, svart-eske) av ApoCIII i kaniner. BLS inneholdende mutasjoner er BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, og 17 (B, red understreket). De resterende BLs (# apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 og 16) ikke har mutasjoner i målretting nettstedet. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> Figur 4. Produksjon av ApoCIII KO kaniner. Ett hundre og førtifem embryoer microinjected med ZFN Set 1 mRNA ble overført til syv pseudo-gravid mottaker kaniner (A). Ferskt spyles embryoer (n = 75) uten ZFN mikroinjeksjon ble overført til mottakere (n = 6) i kontrollgruppen. Begrepet rente beregnes som total sikt kits / total embryoer i eksperiment-gruppen er 140,5% (21/145), mens hastigheten er 29,3% (22/75) i kontroll-gruppen (A). Ut av 21 kits født i microinjected gruppen, fem (R1, R9, R11, R12 og R16) ble identifisert som positive KO kits etter PCR sekvensering (B). De indels på målretting nettstedet inkluderer to innsettinger (en for både R9 og R11) og tre strykninger (Δ1, Δ 20, Δ 21 for R1, R12 og R16, henholdsvis). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> .

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) er en liten O-glykosylerte sekretoriske protein som syntetiseres hovedsakelig i leveren og tarmen. Den ligger på overflaten av plasma chylomikron (CM), veldig lav tetthet lipoprotein (VLDL) og høy tetthets lipoproteiner (HDL). ApoCIII har blitt anerkjent som en risikofaktor for hjerte-og karsykdommer en. Pasienter med arvelig mangel på ApoCIII har lav plasma triglyserider (TG) nivåer og redusert subklinisk koronar aterosklerose 2,3. Forhøyede plasma ApoCIII nivå, på den annen side samsvarer ofte med insulinresistens, fedme, hypertriglyseridemi, og (HTG) 4,5. Gene knockout (KO) er et kraftig middel for å studere funksjonen til et gen. I samsvar med observasjoner i menneskelige mutant populasjoner, knockout av ApoCIII genet i mus førte til en reduksjon av plasma TG og beskyttelse fra postprandial HTG seks. En slik positiv rolle ApoCIII dukket oppå være uavhengig av Apolipoprotein E (ApoE), som mus mangelfull av både ApoE og ApoCIII er også beskyttet fra postprandial hyperlipidemi 7.. Selv om disse ApoCIII KO musemodeller har gitt uvurderlig informasjon om mulige funksjoner av ApoCIII hos mennesker, er det bemerket at metabolismen av lipoprotein av mus er forskjellig fra det av mennesker i mange aspekter. For eksempel mangler mus plasma kolesteryl-ester overføringsprotein (CETP), en viktig enzym som er involvert i transport av VLDL, LDL, og HDL 8.. Derfor er det nødvendig å utvikle en egnet dyremodell for ytterligere å forstå den fysiologiske rollen til ApoCIII in vivo. Kaninen er en klassisk modell dyrearter 9-11. Den har en kort drektighetstid (30-31 dager), stor kullstørrelse (4-12/litter) og kan bli plassert beleilig i et innendørs anlegg. Sammenlignet med mus, kaniner er fylogenetisk nærmere mennesker 10. Viktigere, som humann, men i motsetning til mus, kaniner er LDL-rik pattedyr og har betydelige nivåer av CETP 10,12. Videre er de utsatt for kolesterol-rik diett-indusert aterosklerose med lesjoner lik dem man ser i menneskelig aterosklerose 13. For disse grunner, vi en hypotese om at ApoCIII KO kaniner kan tjene som en bedre modell enn sine muse kolleger for å undersøke rollene til ApoCIIIplay i lipid metabolisme og aterosklerose hos mennesker. Produksjon av genet målrettet transgen (GTT) kaniner har vært en utfordring. Dette er hovedsakelig på grunn av mangel på germline overføring embryonale stamceller (ESC), og den ekstremt lav effektivitet av somatisk cellekjerneoverføring (SCNT) i kaniner. ESC er det viktigste verktøyet for å generere GTT mus, mens og SCNT har blitt brukt til å generere KO dyr i arter mangler germline sender ESCs, inkludert griser, sauer og storfe, men ikke kaniner. Nylig Zinc Finger Nuclease (ZFN), Tranvelse Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) 14, og RNA Guidet Endonuklease (rgen) 15 dukket opp som kraftig middel for genom redigering. Disse nukleaser, såkalte &quot;molekyl saks&quot;, er effektiv i å generere dobbeltstrengbrudd (DSB) i genomet som kan føre til en funksjonell KO av målrettede gen eller som brukes for å integrere et DNA-sekvens på et bestemt geometrisk sted i genomet i en rekke arter 16. I 2011, blant de første tilpasse ZFN teknologi, genererte vi peroksisomproliferator-aktivert reseptor gamma (PPARγ) KO svin celler via denne tilnærmingen og hell generert PPARγ KO griser etter bruk av disse cellene for SCNT 17. I samme år, var effektiv immunoglobulin genet avbrudd og målrettet utskifting i kaniner også bruker ZFN rapportert 18. I denne studien ble fem ApoCIII KO kaniner generert som bekreftet ved PCR sekvensering, ved hjelp ZFN Set 1 (se figur 1 </strong&gt;. for flytdiagram illustrasjon). Disse dyrene er nye ressurser for å studere rollene til ApoCIII i lipid metabolisme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">APOC3-ZFN</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">CSTZFNY-1KT</td>
			<td style="width:167px;">Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344M</td>
			<td>mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAclear Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">AM1908M</td>
			<td>mRNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Bioniche Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">Folltropin-V</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Intervet</td>
			<td style="width:136px;">Chorulon</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gonadotropin-releasing hormone</td>
			<td>Prospecbio</td>
			<td>HOR-255</td>
			<td>Treating embryo recipient rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30029.02</td>
			<td>Embryo culture, base medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (nonessential amino acid)</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M7145</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BME AMINO ACIDS solution</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">B6766</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffered TCM 199&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td style="width:136px;">12350039</td>
			<td>Embryo manipulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Incubator</td>
			<td style="width:276px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Galaxy 170</td>
			<td>Embryo culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">TransferMan NK 2</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Inc.</td>
			<td style="width:136px;">P-1000</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td style="width:136px;">MINJ-D&#160;</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary tubes&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">TW100F-6</td>
			<td>Embryo manipulation supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Euthasol (pentobarbitol sodium)</td>
			<td style="width:276px;">Virbac AH, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">ANADA#200-071</td>
			<td>Euthanization of embryo donor rabbits</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) befinner seg på overflaten av plasma chylomikron (CM), veldig lav tetthet lipoprotein (VLDL) og høy tetthets lipoproteiner (HDL). Det har blitt anerkjent at høye nivåer av plasma ApoCIII constitutea risikofaktor for hjerte-og karsykdommer (CVD). Forhøyede plasma ApoCIII nivå ofte korrelerer med insulinresistens, fedme, hypertriglyseridemi og. Uvurderlig kunnskap om rollene til ApoCIIIin lipid metabolisme og hjerte-og karsykdom er innhentet fra transgene musemodeller inkludert ApoCIII knockout (KO) mus, men er det bemerket at metabolismen av lipoprotein hos mus er forskjellig fra det av mennesker i mange aspekter. Det er ikke kjent før nå om forhøyet plasma ApoCIII er direkte atherogenic. Vi jobbet med å utvikle ApoCIII KO kaniner i denne undersøkelsen basert på hypotesen om at kaniner kan tjene som en reasonablemodelfor studere menneskelig lipid metabolisme og åreforkalkning. Sink finger nuklease (ZFN) sett rettet kanin ApoCIIIgene ble utsatt for in vitro validering før embryo mikroinjeksjon. MRNA ble injisert til cytoplasma av 35 kanin pronuclear scene embryoer, og vurdert de mutasjon priser på blastocyst staten. Av seksten blastocyster som ble analysert, var en tilfredsstillende 50% mutasjonsfrekvens (8/16) ved målretting område oppnås, som støtter bruk av sett en for in vivo eksperimenter. Neste, vi microinjected 145 embryoer med Set 1 mRNA, og overført disse embryoene 7 mottaker kaniner. Etter 30 dager svangerskap, ble 21 kits født, hvorav fem ble bekreftet som ApoCIII KO kaniner etter PCR sekvense analyser. Den KO dyr rate (# KO kits / totalt født) var 23,8%. Den samlede produksjonseffektivitet er 3,4% (5 kits/145 embryo overføres). Foreliggende arbeid vist at ZFN er en svært effektiv metode for å produsere KO kaniner. Disse ApoCIII KO kaniner er nye ressurser for å studere rollene til ApoCIII i lipid metabolisme.

In vitro validering av ZFN parene Sixteen ZFN parene ble opprinnelig designet. Den målrettede avbrudd sekvens av Set 1 er plassert på Exon 2 av kanin ApoCIII (figur 2A). Tre par (sett 1, 2 og 3, figur 2A) ble tatt ut og utsatt for gjæren MEL-1 reporter-analysen for å bestemme de ZFN aktiviteter (figur 2B). Sett 1 har en ZFN score på 224.2%, høyere enn Set 2 (196,9%) og sett 3 (177,8%), og mye høyere enn det merkede terskel (dvs. 50% av det indre positiv kontroll). Derfor Set 1 ble valgt for in vitro valideringsforsøk. Et spesielt sett må resultere i en positiv rater i embryoene på 10% eller høyere for å passere in vitro embryo validering, basert på de interne validerings kriterier. Den mRNA (5 ug / ml) av Set 1 ble microinjected til cytoplasma av 35 pronuclear stadium kanin embryoer (figur 3A &lt;/ Strong&gt;). Spyles embryoer uten mikroinjeksjon behandling (n = 31) ble anvendt som kontrollgruppe. Atten embryoer av microinjected gruppen utviklet for å BL stadium på D5, av hvilke seksten ble sekvensert, og åtte (BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, figur 3B, red understreket) viste mutert sekvenser på målretting hotellet (svart-eske, Figur 2B, øverste rad, apoC3wt.seq). Den BL, beregnes etter microinjected gruppen (51,4%) er lavere enn den til kontrollgruppen (77,4%), noe som indikerer litt nedsatt utviklings kompetanse microinjected embryoer. Den positive mutasjonsfrekvensen av de microinjected embryoer er 50.0% (8/16), mye høyere enn det merkede terskel (dvs. 10%). Disse resultatene viste at Set 1 er en effektiv ZFN satt til å indusere mutasjoner på målretting stedet kanin ApoCIII. Derfor Set 1 ble valgt for in vivo produksjon av ApoCIII KO kaniner. Produksjon av ApoCIII KO kaniner Den mRNA of ZFN Set 1 ble microinjected til cytoplasma av kanin pronuclear scene embryoer, og overførte 145 microinjected embryoer til 7 pseudo-gravid mottaker kaniner (Figur 4A). Ferskt spyles embryoer (n = 75) uten ZFN mikroinjeksjon ble overført til mottakere (n = 6) i kontrollgruppen. Etter 30 dager av svangerskapet, ble 21 kits født i microinjected gruppen. PCR sekvense identifisert fem (apoC3-R1, R9, R11, R12 og R16) som positive KO kits (Figur 4B). Betegnelsen hastighet beregnet som total sikt-sett / total embryoer er 14.5% (21/145), mens hastigheten er 29,3% (22/75) i kontrollgruppen. Den KO rente beregnes som totale KO kits / totalt sikt er 23,8% (5/21). En KO kit (Apoc-R16) døde fem dager etter fødsel (20,0%, 1/5). Den indelsat målretting nettstedet inkluderer to innsettinger og tre slettinger, de areΔ1, 1, 1, Δ20 og Δ21, for Rabbits # R1, R9, R11, R12 og R16, henholdsvis (Figur 4B). Bioinformatics analyse ble brukt for å identifisere potensielle ZFN off-mål med 7 eller færre uoverensstemmelser for å stille en sekvens, som tidligere beskrevet 17. Bare én spådd mulig off-target området, som ligger på kromosom 14, ble identifisert med 7 umake bps. PCR assay oppdaget ingen off-target hendelser i noen av grunnleggerne dyr.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases at JoVE.com

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Produksjon av Apolipoprotein C-III Knockout Kaniner bruker sink finger nukleaser

Ny utvikling i genet målretting verktøy som gjør produksjonen av knockout (KO) kaniner mulig. I dette arbeidet, genererte vi fem Apolipoprotein (Apo) C-III KO kaniner som bruker sink finger nukleaser (ZFN). Dette arbeidet viser at ZFN er en svært effektiv metode for å produsere KO kaniner.

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Isolere og bruke Deler av Bovine mesenteriske arterie og vene som en biologisk metode for å teste for vasoactivity i tynntarmen

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

En trinnvis protokoll for subretinal Surgery i kaniner

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

En høy gjennomstrømning, multiplekset og målrettet proteomikk CSF-analyse for å kvantifisere nevrodegenerative Biomarkører og apolipoprotein E-isoformer Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Induksjon av aterosklerotisk plaketter gjennom aktivering av Mineralocorticoid reseptorer i Apolipoprotein E-mangelfull mus

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Prekliniske modell av hind lem iskemi i diabetiker kaniner

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Etablering av en alvorlig tørr øye modell bruke komplett Dacryoadenectomy i kaniner

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Blind Endotracheal Intubation in Neonatal Rabbits

Blind endotrakeal intubasjon i neonatal kaniner

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical ...

Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits

Multi-system overvåking for identifisering av anfall, arytmier og apné i bevisste beherskede kaniner

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease ...

Three-Dimensional Finger Motion Tracking during Needling: A Solution for the Kinematic Analysis of Acupuncture Manipulation

Tredimensjonal fingerbevegelsessporing under needling: En løsning for kinematisk analyse av akupunkturmanipulering

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D ...

A Modified Technique for Arteriovenous Fistula Construction in Rabbits

En modifisert teknikk for arteriovenøs fistelkonstruksjon hos kaniner

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury ...