Name: high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities
Uploaded: 2013-11-15T18:00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities at JoVE.com

Denne udgivelse er finansieret af enzymer i Environment Research Coordination Network Research støttet af den amerikanske National Science Foundation (DEB # 1.021.559). Denne forskning blev støttet af den amerikanske National Science Foundation (DEB # 1.021.559) og US Department of Energy Office of Science (biologiske og miljømæssige Research). Eventuelle udtalelser, resultater og konklusioner eller anbefalinger er udtrykt i materialet, er dem af forfatterne og ikke nødvendigvis afspejler de synspunkter den amerikanske NSF.

1.. Analyse-opsætning <ol><li> Label 3 dybe brøndplader: &quot;prøve&quot;, &quot;MUB standard&quot; og &quot;MUC standard&quot;. </li><li> Hæld hver standard (MUB på 0, 2,5, 5, 10, 25, 50 og 100 uM) og substrat (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) i separate rene, prelabeled reservoirer (orienteret i rækker) . </li><li> Afpipetter den rette MUB standard, i tilsvarende brønde i MUB standard plade (tabel 1). <ol><li> Pipetter 200 ul 0 pM MUB i række A MUB standard plade. </li><li> Pipetter 200 ul af 2,5 uM MUB i række B i MUB standard plade. </li><li> Pipetter 200 ul af 5 uM MUB i række C i MUB standard plade. </li><li> Pipetter 200 pi 10 pM MUB i rækken D i MUB standard plade. </li><li> Pipetter 200 pi 25 uM MUB i rækken E af MUB standard plade. </li><li> Pipetter 200 pi 50 pM MUB i rækken F i MUB standard plade. </li><li> Pipetter 200 pi 100 μM MUB i rækken G MUB standard plade. </li><li> Gentag trin 1.3.1 - 1.3.8 til MUC standarder i tilsvarende brønde i MUC standard plade. </li></ol></li><li> Prep jord slam for hver jordprøve. <ol><li> 2,75 g af felt fugtig jord afvejes i blenderen. </li><li> Tilføj 91 ml 50 mM buffer. Blend på høj i 1 min. </li><li> Hæld Blender indholdet i en ren glasskål mindst lige så bred som 8-kanals pipette med en rørepind. </li><li> Placer på omrøringsplade, mix jord gylle på lav. </li><li> Pipetter 800 ul jord gylle til første kolonne af prøven plade (Tabel 2). </li><li> Gentag i 1. kolonne i MUB standard og MUC standard plader (tabel 1). </li><li> Skyl blender, omrøringsplade og rør bar med DI H 2 O eller buffer mellem jordprøver. </li><li> Gentag trin 1.4.1 - 1.4.7) for hver prøve, der flytter til den næste kolonne med hver efterfølgende jordprøve (tabel 1 og2). </li></ol></li><li> Pipette substrat (i dette eksempel, 200 uM-koncentrationer) i tilsvarende brønde i Sample plade (tabel 2). <ol><li> Pipetter 200 pi BG substrat i række A Sample plade. </li><li> Pipetter 200 pi CB substrat i række B i Sample plade. </li><li> Pipetter 200 pi NAG substrat i række C i Sample plade. </li><li> Pipetter 200 pi PHOS substrat i række D af prøve plade. </li><li> Pipetter 200 pi XYL substrat i rækken E af Sample plade. </li><li> Pipetter 200 pi AG substrat i rækken F Sample plade. </li><li> Pipetter 200 pi LAP substrat i rækken g prøve plade. </li><li> Gentag trin 1.5.1 - 1.5.7 for hver inkubationstemperatur prøveplade. </li></ol></li></ol> 2. Inkubation af assayplader <ol><li> Forsegl dybe brønde (&quot;prøve&quot;, &quot;MUB standard&quot; og &quot;MUC standard4 ;) med plade måtter. </li><li> Vend hver (tætnet) plade med hånden, indtil opløsningen blandes grundigt (~ 10x). </li><li> Placer pladerne i passende inkubator for påkrævet inkubationstid periode (tabel 3). </li><li> Optag indledende tid som tid 0. Også registrere de relevante inkubationstider, så du ved hvornår du skal fjerne pladen fra inkubator (tabel 3). </li><li> Ved afslutningen af ​​hver inkubationsperiode centrifuge de forseglede plader i 3 min ved ~ 2.900 x g.. </li><li> Efter certificeringen overføre 250 pi fra hver brønd af de inkuberede dybe brøndplader ind i tilsvarende brønde i sort fladbundede plader med 96 brønde (en sort plade vil blive anvendt for hver inkuberet dyb brønd plade). Det er vigtigt at overføre prøver fra de inkuberede dybe brøndplader i de samme brønde (dvs. A1 ... A12, osv.) i de sorte fladbundede 96-brønds plader (tabel 1, 2). </li></ol> 3. Fluorescerende Målinger påen Microplate Fluorometer <ol><li> Efter producentens anvisninger for fluorometriske pladelæseren anvendte, sæt excitationsbølgelængden til 365 nm og emission bølgelængde til 450 nm (eller bruge passende filtre). </li><li> Læs de tre plader på fluorometer. Vigtigt: prøver og standard plader (dvs. MUB eller MUC) skal læses ved hjælp af den samme gevinst. <ol><li> Indstil spektrofotometer til automatisk gain og læse MUC og MUB Standard plader. </li><li> Set gevinst til manuel, og formindske værdien fra optimal til den næste laveste antal, afrundet til nærmeste fem, for hver standard plade. Gentag 2x for hver plade. </li><li> Indstil forstærkningen til automatisk og køre Sample plade. Kør Sample pladen manuelt at matche den højeste gevinst for hver af de Standard plader (dvs. MUB og MUC). </li></ol></li></ol> 4.. Dataanalyse <ol><li> Indtast standard kurve fluorescens data i regneark til MUB (tabel 4a) Og MUC standard (tabel 4b) <ol><li> Konverter (mM) koncentrationer til (pmol) (tabel 4a og 4b). </li></ol></li><li> For hver prøve standard-kurve fluorescens data, beregne hældningen, y-skæringspunkt, og R 2-værdier for MUB og MUC (pmol) standard koncentrationer. Acceptable R 2-værdier bør overstige 0,98 for hver prøve (tabel 4a og 4b). Det kan være nyttigt at visualisere standardkurver i et punktdiagram, med fluorescens læser afbildet som den afhængige variable (y-akse) og koncentration standard (gmol) afbildet som uafhængige variable (x-akse) (figur 1). </li><li> Du skal bruge MUB og MUC standardkurve hældning og y-aksen værdier til at beregne prøven + substrat rå fluorescens data til potentielle EU-Udenrigstjenesten. Du skal først indtaste prøve + substrat rå fluorescens data i et nyt regneark (tabel 5a </strong&gt;). Du vil også nødt til at indtaste inkubationstiden (HR) og jord tørvægt for hver prøve (tabel 5b). Bemærk de tidsværdier indtastet i dette eksempel er 3 timer, fordi prøverne blev inkuberet ved 25 ° C (tabel 3). <ol><li> Fratræk standardkurven skæringspunktet værdier fra de tilsvarende prøve fluorescens værdier og derefter dividere med hældningen af den tilsvarende standard-kurve (tabel 5c). For at opnå dette, omarrangere standard linje ligning til at løse for prøve enzymkoncentration (x), x = (yb) / m hvor [y = prøve fluorescens rå læse b = opsnappe fra MUB eller MUC Standard kurve m = hældningen fra MUB eller MUC Standardkurve]. </li><li> Multiplicer prøve pmol, fra trin 4.3.1, med 91 ml (buffer volumen bruges i jord gylle) (tabel 5d). </li><li> Divide opnåede værdi i trin 4.3.2 af sample-specifik inkubationstid og tør jord masse (tabel 5e): [enzym amt. (&amp; #956, mol) x 91 ml x inkubation (t) x tør jord (g) x 0,8 ml x 1.000] Bemærk: 0,8 ml er mængden af ​​gylle, der anvendes i hver brønd, og 1000 korrigerer for den faktiske jord beløb i hver brønd. </li><li> Gang den opnåede i trin 4.3.3 med 1.000 for at få de ønskede enheder (nmol aktivitet / g tør jord / h) (tabel 5f) værdi. </li></ol></li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Laboratoriet-baserede målinger af potentielle jord-Udenrigstjenesten kan give vigtig indsigt i mikrobielle reaktioner på deres abiotiske miljø, og deres konsekvenser for økosystemets funktion. Resultaterne af dette eksempel datasæt tyder på, at minimale forskelle i jord enzymaktivitet eller kinetik blandt klima behandling plots. Men omvendt tendenser blandt plots tilskynde til yderligere undersøgelse af kovariater, der kan påvirke produktionen af ​​mikrobielle Udenrigstjenesten såsom jordfugtighed, jordens pH eller plantevækst. Samlet set vurderer EU-Udenrigstjenesten med hensyn til (1) samlede EØS i jord, (2) EØS støkiometri (3) Arrhenius plots / aktivering energi, og (4) Q 10 giver et bredt spektrum af tilgange, der kan være tegn på økosystem-niveau processer hvorfra man håndfast karakterisere jordbundens økosystem funktionelle dynamik. High-throughput fluorescens-baserede EØS analyser er et nyttigt værktøj, der er almindeligt anvendt til at undersøge potentielle Udenrigstjenesten i jord ogandre miljøer. Vigtigere er det, mulige aktiviteter afspejler enzymet pulje størrelse, men ikke i sig selv kvantificere enzymproduktion eller omsætningshastighed 46. Selv om teknikken er forholdsvis ligetil, kan tilsyneladende mindre forskelle blandt lab protokoller hæmmer sammenligneligheden af resultater 13. Desværre har vi i øjeblikket ikke har egnede standardiserede positive kontroller for EU-Udenrigstjenesten. Brugen af ​​støkiometriske forhold er én tilgang til at overvinde disse udfordringer. Ellers har fremkomsten af high-throughput-teknikker avancerede undersøgelse af enzymer i miljøet 4.. Omhyggelig fortolkning af de data, der genereres af disse assays kan belyse vigtige tendenser i mikrobiel aktivitet. Robustheden af ​​protokollen stammer fra evnen til at vælge for forhold vedrørende de enkelte prøver, men det kan også resultere i begrænsninger. En række ændringer vil blive forpligtet til at sikre, at prøverne måles nøjagtigt til<html> individuelle felt brancher: Buffer Pufferen vælges vil afhænge af jordens pH-værdi. Buffering også stabiliserer fluorescensintensiteten af de fluorescerende standarder, som er meget pH-afhængig 27,47. PH buffer som vi typisk bruger til at gøre jorden gylle er en 50 mM natriumacetat eller Tris-buffer, der er valgt til bufferens især sur dissociationskonstant (pKa) til bedste match jord - prøve pH-niveauer. Natriumacetat har en pKa-værdi på 4,76, og Tris har en pKa på 8,06, så mængderne af de to buffere vil variere for at nå den ønskede pKa for den enkelte prøve. Phosphatpuffer (pKa = 7,2) er blevet foreslået til neutrale / lidt basisk jord. Men vi advarer at teste for analytisk variation i forundersøgelser, før du bruger denne buffer, så højt fosfat koncentrationer kan forstyrre enzymaktivitet. Håndtering og opbevaring af fluorescerende substrater jove_content &quot;&gt; fluorescensanalyser kan lide af interferens, der skyldes urenheder og / eller ustabilitet i mange fluorescerende forbindelser, når de udsættes for lys, så forsigtighed er påkrævet ved håndtering af fluorescerende substrater. Vi anbefaler kraftigt at minimere enhver lys eksponering for fluorescens-mærkede substrater og MUB og MUC standarder . Brug rav glasflasker eller dækker glas og beholdere, der anvendes til fremstilling og lagring af fluorescerende substrater og standarder er stærkt anbefales, aluminiumsfolie til wrap glasvarer og containere fungerer godt Ligeledes effektivt pode plader og overførsel til mørke kuvøser er bedst praksis Vi anbefaler.. lagring substrater og standarder (-20 ° C) ikke længere end to måneder (og samtidig beskytte dem mod lys) og optøning substrater (5 ° C) ~ 24-48 hr forud for begyndelsen enzymassayet (r). Design og replikering For bedst konto for godt til såvel prøve variationer, gennemføre negative assay kontrol og (hvis muligt) assay replikater anbefales. Variation opstår typisk på grund af forskelle i mængden af ​​jordpartikler i hver brønd og pipetteringsfejl. Derfor vil den stærke blanding og god pipetteringsteknik væsentlige minimere brønd til brønd variation. Desuden anbefaler vi at gennemføre en negativ assay kontrol (buffer + substrat opløsning) til at overvåge substrat uoverensstemmelser over tid. Dette kan nemt overvåges, når man læser enzym pladerne ved at sammenligne negative kontrol brønde (vi bruger typisk den sidste kolonne på 96-brønds plader). Negative substrat kontroller er typisk stabile, derfor signalet stiger langt over detektionsgrænsen, er det tegn på forurening eller substrat ustabilitet, kræver udskiftning af underlaget og / eller standardløsninger. For at maksimere throughput, vores protokol omfatter flere potentielle Udenrigstjenesten i en enkelt dyb brønd mikroplade, selv om andre protokoller udføre én typeassay per plade (dvs. en substrat pr plade), da forskellige Udenrigstjenesten opstår på forskellige satser. Uanset, skal enzym optimering udføres på jord, før du udfører denne høj i hele tilgang eller den enkelt plade tilgang. Flere underlag kan bruges på en enkelt plade, hvis reaktionen er relativt konsekvent for hvert enzym inden for den tidsperiode af inkubationen. Vores protokol anbefaler ~ 2,75 g jord at gøre slamopløsningen, mens ~ 1 gram anbefales andre protokoller 24. Vi foreslår at bruge mere jord (hvis muligt) er en effektiv tilgang til bedre indfangning inden-jordprøve variation i enzym aktivitetsniveau. I denne protokol, vi inkuberes 800 pi jord gylle med 200 ul substrat, mens andre kun udruge 200 pi jord gylle med 50 pi substrater. Dette er simpelthen en funktion af opskalering der i sidste ende ikke ændrer den målte aktivitet. Der er også praktiske fordelefor at bruge større mængder. One, er det lettere at undgå jord partikler, mens pipettering tilsvarende sort fladbundede 96-brønds plader, før du optager intensiteter på fluorometer. For det andet, den ekstra volumen er nyttig i tilfælde af utilsigtet spild, mens overføre de sorte fladbundede plader med 96 brønde til fluorometret før optagelse enzym-relaterede fluorescensintensiteter. Selv små afvigelser i volumen vil falde betydeligt fluorescens blandt brønde. Endelig, på grund af den høje overførselshastighed karakter af denne protokol, vi almindeligvis vælger at stole på eksperimentel replikering til at repræsentere variationer i enzym aktivitet snarere end at udføre analysen replikeres. Det er altid bedst praksis til at omfatte analytiske gentagelser, men i praksis, føler vi vores protokol giver en afbalanceret afvejning mellem analytiske og eksperimentelle gentagelser givet begrænsede ressourcer. Ligeledes bruger vores tilgang relativt mere godt homogeniseret jord (2,75 g) pr assay 25, som inherently falder inden-jord variationer. Beslutningen om at bruge analytiske replikater bør overvejes nøje ved at teste for analytisk fejl i indledende undersøgelser 48. Vi anbefaler dog, at eksperimentelle design med færre end 4 behandling koncerninterne replikater kraftigt bør overveje at bruge assay replikater. Jord, buffervolumener og Substratkoncentration optimering Jordbunden buffer: substratkoncentration ratio er en vigtig variabel, som har stor indflydelse på målte fluorescens, når du udfører enzymassays. Mængden af ​​jord i gyllen tilføjede at analysere eller koncentrationen af ​​substrat kan være nødvendigt at justere afhængigt af aktiviteten af ​​enzymer i jordprøven. De udvalgte til dette eksempel beløb var baseret på tidligere afprøvning af disse jord for at sikre, at underlaget tilgængelighed var begrænsende, og at vi måler maksimale potentielle satser under assaybetingelserne (V max) 44,45.. Men for jordprøver, der har høje koncentrationer af enzymer, mængden af ​​jord eller substratkoncentration skal øges. Vi har fundet, at stigende substratkoncentrationer (og justering af standardkurven tilsvarende) kan påvirke lineariteten af ​​kurven. Derfor anbefaler vi at reducere jord mængder og / eller proportionale justeringer til buffer mængder, som det er nødvendigt. Uanset hvad, er det vigtigt at optimere substrat koncentration for hver jordtype analyseret fordi målte Udenrigstjenesten kan afvige med en størrelsesorden større mellem mættede og sub-mættede substratkoncentrationer 26. Derfor forskelle blandt eksperimentelle behandlinger (osv.) er modtagelige for type II statistiske fejl og mindre tilbøjelige til at blive opdaget på sub-mættende forhold og statistiske fejl 27,35. For at optimere substratkoncentrationer bør foreløbige enzymanalyser udføres på jord repræsentative prøver ved hjælp af en bred vifte af substratkoncentrationer. Efterregistrering af fluorescens, bare plotte data (i lighed med standardkurven eksempel, figur 1) for at identificere koncentrationen substrat (x-aksen), der svarer til enzym aktivitet (y-aksen), hvor hældningen niveauer off (~ 0). Ligeledes substrat koncentration svarende til det punkt, hvor hældningen niveauer off (~ 0) er en god indikation af den optimale substratkoncentration for den pågældende jord. Dette assay sidst måler fluorescens over en given produceret af det fluorogene del, spaltes fra substratet som et resultat af enzymmedieret substrat depolymerisation. Derfor trin 5 (substrattilsætning) er kritisk og skal udføres så effektivt som muligt for at minimere den tid mellem, når substratet tilsættes til jord, og når assays inkuberes. Ligeledes, når substratet kommer i kontakt med prøven, enzymatiske reaktioner begynder at opstå. Vi anbefaler at bruge en multi-kanalpipettere af denne grund. Det er stærkt foreslået at blive effektive ved hjælp af multi-kanal pipette før den dag, du udfører dine enzymassays. For at opnå dette, kan du øve pipettering med vand, indtil du nemt kan overføre mængder ind i de 96-brønds plader med din pipette. Jord Quenching Quenching refererer til faldende fluorescensintensitet forårsaget af partikler og / eller organisk materiale i jorden slam-inkubationer 26. Quenching kan påvirkes ved at justere jord: buffer forhold 25. På grund af baggrunden fluorescens fra individuelle prøver, er det afgørende at køre standarder med prøver at tage højde for baggrunden (quenching) fluorescens. Selv om nogle protokoller bruge en enkelt koncentration efter testning, at signalet er lineær, anbefaler vi kraftigt at gennemføre en standard quench kontrol for hver prøve til bedste kontrol for effekten af ​​quenching. Undladelse af dette vil resultere i en standard kurve ikke anvendelig til prøven, og en forkert vurdering af enzymatisk aktivitet. Tilføjelsen af ​​standarder til jord slam er ikke tidsfølsomme, som standard tilføjelse ikke påvirker baggrundsfluorescensen af ​​prøven. NaOH tilføjelse Tilsætningen af NaOH anvendt i nogle protokoller for at optimere fluorometriske enzymaktivitet målinger, fordi det fluorescerende farvestof er frigivet fra de syntetiske substrater udviser maksimal fluorescens ved pH&gt; 9,0 26,49. Når man overvejer dette forslag, vil NaOH koncentrationen nødvendig for jordens gylle pH (dvs. pH&gt; 9) variere afhængigt af den særlige jordbund og pH buffer, der bruges 26. Men andre hævder, at NaOH ikke kan være nødvendigt, fordi signal intensitet er generelt meget høj, selv ved lavere pH, og fordi det indfører en ekstra kilde til målefejl. For eksempel virkningen af ​​NaOH tilføjelser tilsatsopslæmningen pH og dermed MUB eller MUC fluorescence ændringer over tid 25. MUB forbundne substrater har vist sig at vise ensartet forøget fluorescens i 20 minutter efter NaOH tilføjelser inden niveauer konus, mens MUC har vist stabil reduceret fluorescens op til 60 min 26. Derfor er det vigtigt at standardisere tiden mellem NaOH tilsætning og fluorescens-måling. Alternativt, hvis niveauer af fluorescens er tilstrækkeligt detekterbart uden tilsætning, forestår assays uden tilsætning af NaOH er blevet foreslået som en lige så acceptabelt alternativ 26. Temperatur Temperatur følsomhed bør tages i betragtning, når der træffes beslutning inkubationstemperaturen. Hvis den primære interesse er at forstå enzymkinetik ved hjælp af tre eller flere temperaturer som illustreret ved hjælp af Arrhenius plots (i afsnittet om resultater) er en robust tilgang. Hvis prøven webstedet har karakteristisk lav temperatur såsom permafrost jord, så duration inkubationstid kan være nødvendigt at blive udvidet til at give mulighed for enzymer til at reagere i de koldere inkubationstemperaturer. Mens traditionelle enzymkinetik tyder på, at en stigning i temperaturen bør resultere i øget enzymaktivitet, har vi fundet, at enzymer kan være stedsspecifikke i form af temperaturfølsomhed 50. Derfor at forstå stedspecifik enzymaktivitet potentialet er det afgørende, at inkubationstemperaturen og varighed tilpasses for at afspejle mark værdier. Afslutning EES er kritiske førere af biogeokemiske processer i jord, og derfor skal vi være i stand til at måle deres aktiviteter. Der er mange udfordringer til måling af Udenrigstjenesten i jord, herunder interferens og hæmning. På trods af disse udfordringer, kan standardiserede protokoller (som beskrevet her) anvendes generelt, til at måle EU-Udenrigstjenesten til en bred vifte af enzymer. Selv om det er forholdsvis nemt at generere kvalitetsdata følge disse protokoller, er ifortolkning af disse data i en økologisk sammenhæng kræver nøje overvejelse af, hvad disse analyser er virkelig måle, og hvordan EU-Udenrigstjenesten under assaybetingelser kan afvige fra dem under in situ-betingelser.

Ekstracellulære enzymer (EBS) produceret af jordbakterier, svampe og archaea er involveret i utallige biogeokemiske processer, og er centrale for forarbejdning, stabilisering og destabilisering af organisk stof og næringsstofkredsløb i terrestriske økosystemer 1. Ved at producere EBS jordens mikroorganismer nedbrydes og omdanne polymere organisk stof i mindre opløselige molekyler, og dermed befriende tidligere bundet mikro-og makronæringsstoffer, som giver planter og mikrober til at assimilere tilgængelige næringsstoffer fra jorden. EBS er blevet undersøgt i årtier, primært ved at måle deres aktiviteter i laboratorieassays 2-4, da det er meget vanskeligt direkte at påvise og kvantificere enzymer. Ekstracellulært enzymaktivitet (EØS) er stærkest styret af koncentrationen af ​​enzymer og tilsvarende underlag. Den overflod af forskellige C-, N-og P-nedbrydende enzymer i jord styres af en lang række faktorer including mikrobielle biomasse, samfund sammensætning, underlag tilgængelighed, mikroklima, og støkiometriske krav 5,6. Men in situ Udenrigstjenesten i jordmiljøet også påvirket af temperatur 7,8, binding af enzymer til jord ler og humus ejendomme 2, og diffusion begrænsninger 9, som i sidste ende regulerer det aktive enzym pulje, med hensyn til størrelse, underlag tilgængelighed og omsætning satser 10-12. Derfor anerkender in situ jordbundsforhold er kritisk, når du bruger laboratorium enzymassays at fortolke jordens mikrobielle funktion på tværs af forskellige miljømæssige steder. Mange forskellige klasser af EØS kan kvantificeres i laboratorieassays hjælp af en række syntetiske substrater (se venligst &quot;Liste af reagenser Table&quot; for flere detaljer). Visse protokoller benytter substrater i assays, som er koblet til en kolorimetrisk reaktion, der kan detekteres med et spektrofotometer, wHile andre, herunder protokollen, vi beskriver her, udnytte substrater, der er bundet til et fluorescerende del. Fluorescens EE analyser er typisk mere følsomme (ved en størrelsesorden) end kolorimetriske assays (som bruger et kromogent del er forbundet med et syntetisk substrat) 12-14. Følsomhed i EØS-detektion omfatter to aspekter: den ene er relateret til mængden af ​​forbindelsen af ​​interesse opdages og det andet i relation til den laveste påviselige potentielle enzymaktivitet. Metoder til kolorimetrisk p-nitrophenol (PNP)-baserede assays kan findes i tidligere arbejder 15,16. Kort sagt, jord (typisk sigtet til &lt;2 mm og lufttørret) inkuberes ved optimal eller felt-relevant temperatur og pH. Den hastighed, hvormed reaktionsproduktet frigivet bestemmes kolorimetrisk med et spektrofotometer 14. Jo højere følsomhed fluorescens enzymassays skyldes til dels mere følsom påvisning af det fluorogene del separation forbundet med substrspiste nedbrydning snarere end optagelsen absorbans efter adskillelsen af ​​et specifikt chromogent del ved en bestemt bølgelængde. De to mest almindeligt anvendte syntetiske fluorescerende indikatorer er 4-methylumbelliferon (MUB) 17 og 7-amino-4-methylcoumarin (MUC) 18,19. MUC-bundne substrater er almindeligvis forbundet med N-rige syntetiske substrater, såsom proteiner og / eller aminosyrer. Fluorescerende teknikker blev først udviklet til akvatiske prøver 20,21, og deres anvendelse på jord kræver kontrol for signal quenching og interferens 22,23. Analyser kan enten udføres ved anvendelse af traditionelle &quot;bænk top&quot; kemi med store mængder, eller kan anvendes i mikroplade baserede protokoller, med øget gennemløb, men muligvis højere målefejl. Mens der er flere bredt citeret protokoller til fluorescerende detektion af Udenrigstjenesten i jord 24, mange laboratorier anvender subtile variationer på disse protokoller, ofte uforvarende eller på grund af forskels i laboratorieudstyr eller reagenser. Kan stærkt påvirke måles tilsyneladende små forskelle i detaljerne i protokoller Udenrigstjenesten 25,26 og manglen på standardiserede enzymer der gør det udfordrende at kalibrere analyser mellem forskellige laboratorier. Således er der et stort behov for formidling af detaljerede protokoller for at fremme standardisering af EØS-analyser. I vores protokol jordprøver fremstillet ved at kombinere jordprøver med en pH-puffer og homogenisering med en blender. Opslæmningerne inokuleres derefter med en begrænsende mængde af fluorescens-mærket C-, N-eller P-rige substrat vælges afhængigt af den specifikke forskning spørgsmål af interesse. Brug jord opslæmninger i enzymassays tjener som en kontrol for at minimere substrat diffusionsbegrænsninger. De fluorescerende dele er standset, indtil de spaltes fra deres respektive substrater og således enzymaktivitet kan påvises som det fluorescerende farvestof er frigivet fra substratet by en enzym-katalyseret reaktion. Den stigende fluorescensintensitet gennem tiden afspejler hastigheden af ​​enzym-katalyseret reaktion. Det overordnede begreb fluorescens Enzymassayet at syntetiske substrater bundet med en fluorogen del (fluorescerende farvestof), der tilsættes til jordprøver 27. Under enzymkatalyseret substrat nedbrydning bindingen bryder mellem det fluorescerende farvestof og substratet. Det fluorescerende farvestof frigjort fra substratet følgelig anvendes som en indirekte vurdering af enzymaktivitet, og kan kvantificeres ved hjælp af en mikropladelæser at detektere fluorescens intensitet af farvestoffet. I korte træk er fluorescens kvantificering opnås som den frigjorte farvestof udsender lys af en bølgelængde, efter at absorbere lys af en anden bølgelængde. Fluorescensintensiteten registreres af en pladelæser i stand til både excitation og detektion. Enzym aktivitet kan efterfølgende kvantificeres baseret på den kendte fluorescerende farvestof koncentrations af substratet (dvs. kendte mængder af syntetisk substrat tilsættes til jordprøver) langs med henvisning til en standard fortyndingskurve af fluorescensintensiteter for specifikke fluorogene del af substratet anvendt i assayet (dvs. 4-methylumbelliferon (MUB) eller 7-amino- -4-methylcoumarin (MUC)). (Der henvises til protokol sektion for specifikke detaljer om enzymaktivitet kvantificering). Laboratorium jord enzymassays er nyttige ved vurdering mikrobielle samfund funktion, men der er flere tekniske begrænsninger, som brugerne skal opfange 10. Fluorescensanalyser kan lide af interferens, der skyldes urenheder og / eller ustabilitet i mange fluorescerende forbindelser, når de udsættes for lys, så forsigtighed er påkrævet ved håndtering fluorescenssubstrater 25. Jord partikler og / eller organisk materiale i jorden slam kan også forstyrre fluorescensintensiteter, kendt som quenching effekt 26.Desuden laboratorium enzymassays kun vurderer potentielle Udenrigstjenesten under laboratorieforhold. In vitro assays måler Udenrigstjenesten under forhold, hvor underlaget diffusion og overflod er begrænsende. Derfor kan de data, som disse analyser ikke være en god proxy for Udenrigstjenesten i henhold til in situ jordforhold 10. Samlet enzymaktivitet er meget nyttigt for relative sammenligninger, hvor jordtyper er ens. Men når du bruger denne metode til at sammenligne aktiviteter blandt jord, der adskiller sig i fysiske eller kemiske egenskaber, der bør udvises forsigtighed. Dette skyldes den kendsgerning, at forskelle i jordtype og temperatur kan drastisk ændre tilstand af in situ enzymkinetik. En anden begrænsning er, at relativt få substrater er kommercielt tilgængelige (sammenlignet med det naturlige miljø). Endvidere er de syntetiske substrater anvendes til enzymassays er relativt simple (letopløseligt), kan ikke præcist repræsentere jord substrater nuværende eller tilrådighede in situ. En anden faktor til at overveje, er, at bruge jord slam vil indarbejde aktiviteten af nogle stabiliserede enzymer (dvs. immobiliserede af organisk stof eller ler), der kan ikke være aktive under in situ-betingelser 2. Laboratorium enzymassays heller ikke give oplysninger om persistens af enzymer i jorden (enzym omsætning satser) eller oplysninger om de specifikke mikrobielle arter, der producerer jord enzymer.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents: </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#945;-D-glucopyranoside (AG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9766</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-glucopyranoside (BG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3633</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside (CB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6018</td>
			<td>Cellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2145</td>
			<td>Protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl N-acetyl-&#946;-D-glucosaminide (NAG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2133</td>
			<td>Chitin degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8883</td>
			<td>Phosphorus mineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl-&#946;-D-xylopyranoside (XYL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7008</td>
			<td>Hemicellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferone (MUB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-4-methylcoumarin (MUC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Sodium acetate anhydrous buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>acidic and neutral soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris base buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td>basic soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-65</td>
			<td>pipetting reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-684-265</td>
			<td>8-channel pipette, range: 50-1,200 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 101-1,250 &#956;l extended length natural tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1112 - 1720</td>
			<td>10 racks of 96 tips (960 tips)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-100SH</td>
			<td>Lab disc magnetic stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring blender</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-509-7P</td>
			<td>Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Dispensette III bottle-top dispensers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-688-231</td>
			<td>Dispenser; range: 5-50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Unispense &#956;P peristaltic pumps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683-7</td>
			<td>Optional dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1451363SIX</td>
			<td>Used to stirr soil slurry afer blending</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass bowls</td>
			<td>World Kitchen</td>
			<td>5304218</td>
			<td>Pyrex 10 oz rimmed custard cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well black solid plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-590</td>
			<td>Used for plate reader step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well assay blocks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-700</td>
			<td>V-bottom; 2 ml; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-387-93</td>
			<td>Sterile 96-well cap mat for square wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge equipped with holders for deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3121</td>
			<td>Centra-GP8 (this model is no longer available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30016058</td>
			<td>Plate reader (this model is no longer available)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities

Mikrober i jorden og andre miljøer producerer ekstracellulære enzymer til depolymerisere og hydrolyserer organiske makromolekyler så de kan sidestilles for energi og næringsstoffer. Måling jordens mikrobielle enzym aktivitet er afgørende i forståelsen af ​​jordens økosystemtjenester funktionelle dynamik. Det overordnede begreb fluorescens Enzymassayet at syntetisk C-, N-eller P-rige substrater bundet med et fluorescerende farvestof tilsættes til jordprøver. Når intakt, behøver de mærkede substrater ikke fluorescerer. Enzym aktivitet måles som stigningen i fluorescens som de fluorescerende farvestoffer spaltes fra deres substrater, der tillader dem at fluorescerer. Enzym-målinger kan udtrykkes i enheder af molariteten eller aktivitet. For at udføre dette assay er jord opslæmninger fremstillet ved at kombinere jord med en pH-buffer. PH buffer (typisk en 50 mM natriumacetat eller 50 mM Tris-buffer), er valgt til bufferens især sur dissociationskonstant (pKa), der bedst passer til jordbunden sample pH. De jord opslæmninger inokuleres med en begrænsende mængde af fluorescens-mærket (dvs. C-, N-eller P-rige) substrat. Brug jord opslæmninger i assayet tjener til at minimere begrænsninger enzym og substrat diffusion. Derfor er denne assay kontrol for forskelle i substrat begrænsning, diffusionshastigheder og jordens pH betingelser, og således afsløre potentielle enzym erhvervsfrekvenser som en funktion af forskellen i enzymkoncentrationer (pr. prøve). Fluorescens enzymassays er typisk mere følsomme end spektrofotometriske (dvs. kolorimetriske) analyser, men kan lide af forstyrrelser forårsaget af urenheder og ustabilitet i mange fluorescerende forbindelser, når de udsættes for lys, så forsigtighed er påkrævet ved håndtering fluorescenssubstrater. Ligeledes denne metode kun vurderer potentielle enzymaktiviteter under laboratorieforhold, når substrater er ikke begrænsende. Der bør udvises forsigtighed i tolkningen af ​​data, der repræsenterer cross-Site sammenligninger med forskellige temperaturer eller jordtyper, som in situ jordtype og temperatur kan påvirke enzymkinetik.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities at JoVE.com

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

For at måle potentielle satser for jord ekstracellulære enzymaktiviteter er syntetiske substrater, der er bundet til et fluorescerende farvestof tilsættes til jordprøver. Enzymaktivitet måles som det fluorescerende farvestof er frigivet fra substratet ved en enzym-katalyseret reaktion, hvor højere fluorescens indikerer mere substrat nedbrydning.

High-throughput Fluorometric Måling af Potentiel Jord Ekstracellulære enzymaktiviteter

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bestemmelse af Mikrobiel Extracellular enzymaktivitet i Vand, Jord og sediment ved hjælp af High Throughput Mikropladekrav Analyser

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Design og drift af en kontinuerlig<sup&gt; 13</sup&gt; C og<sup&gt; 15</sup&gt; N Mærkning Afdeling for Uniform eller differentiale, Metabolisk og Konstruktioner, Plant isotopmærkning

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Måling af Greenhouse Gas Flux fra landbrugsjorde Brug Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

Semi-højkapacitetsscreening for Potentiel tørke-tolerance i salat (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) kimplasmasamlinger

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

En gusseted Thermogradient Table at styre Jord Temperaturer for Evaluering plantevækst og jordbundsovervågning Processer

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Protocols for Quantifying Transferable Pesticide Residues in Turfgrass Systems

Protokoller til Kvantificering Omsættelige pesticidrester i slider mere på græsset Systems

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Måling og kortlægning mønstre af jorderosion og Deposition relateret til jordbunden karbonat koncentrationer Under landbrugsdrift

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

En 3-dimensionel (3D)-trykt skabelon for High Throughput zebrafisk Embryo opstilling

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Use of Principal Components for Scaling Up Topographic Models to Map Soil Redistribution and Soil Organic Carbon

Brug af Principal komponenter for optrapning topografisk modeller til kort jord omfordeling og jordbundens organiske kulstof

Landscape topography is a critical factor affecting soil formation and plays an important role in determining soil properties on the earth surface, as it ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Høj overførselshastighed Siderophore Screening fra miljøprøver: plante væv, Bulk jord og rhizosfære jord

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...