Name: high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities
Uploaded: 2013-11-15T18:00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities at JoVE.com

Deze publicatie werd gefinancierd door de enzymen in de Environment Research Coordination Network Research gesteund door de Amerikaanse National Science Foundation (DEB # 1021559). Dit onderzoek werd gesteund door de Amerikaanse National Science Foundation (DEB # 1021559), en de US Department of Energy&#39;s Office of Science (biologische en milieu-onderzoek). Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal zijn die van de auteurs en komen niet noodzakelijk overeen met de standpunten van de Amerikaanse NSF.

1. Assay Set-up <ol><li> Label 3 diepe putjes: &quot;Voorbeeld&quot;, &quot;MUB standaard&quot;, en &quot;MUC standaard&quot;. </li><li> Voor elk standaard (MUB van 0, 2.5, 5, 10, 25, 50 en 100 uM) en het substraat (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) in afzonderlijke schoon, prelabeled reservoirs (georiënteerd in rijen) . </li><li> Pipetteer de juiste MUB standaard in overeenkomstige putjes van MUB standaard plaat (Tabel 1). <ol><li> Pipetteer 200 ul van 0 uM MUB in rij A van MUB standaard plaat. </li><li> Pipetteer 200 ul van 2,5 uM MUB in rij B van MUB standaard plaat. </li><li> Pipetteer 200 ul van 5 uM MUB in rij C van MUB standaard plaat. </li><li> Pipetteer 200 ul van 10 uM MUB in rij D van MUB standaard plaat. </li><li> Pipetteer 200 ul van 25 uM MUB in rij E van MUB standaard plaat. </li><li> Pipetteer 200 ul van 50 uM MUB in rij F van MUB standaard plaat. </li><li> Pipetteer 200 ul van 100 μM MUB in rij G van MUB standaard plaat. </li><li> Herhaal de stappen 1.3.1 - 1.3.8 voor MUC normen in overeenkomstige putjes van de MUC standaard plaat. </li></ol></li><li> Prep bodem slurries voor elk bodemmonster. <ol><li> Weeg 2,75 g van het veld vochtige grond in de blender. </li><li> Voeg 91 ml van 50 mM buffer. Blend op hoog voor 1 min. </li><li> Giet blender inhoud in een schone glazen schaal ten minste even breed als 8-kanaals pipet met een roerstaafje. </li><li> Plaats op roerplaat, mix bodem drijfmest op laag. </li><li> Pipetteer 800 ul van de bodem slurrie in de eerste kolom van het plaat van de steekproef (tabel 2). </li><li> Herhaal in 1 ste kolom van MUB norm en MUC standaard platen (Tabel 1). </li><li> Spoel blender, roerplaat en roerstaaf met DI-H 2 O of buffer tussen bodemmonsters. </li><li> Herhaal de stappen 1.4.1 - 1.4.7) voor elk monster, verhuizen naar de volgende kolom bij elk volgend grondmonster (tabellen 1 en2). </li></ol></li><li> Pipetteer de juiste substraat (in dit voorbeeld 200 uM concentraties) in overeenkomstige putjes van de plaat van de steekproef (tabel 2). <ol><li> Pipetteer 200 ul van BG substraat in rij A van de plaat van de steekproef. </li><li> Pipetteer 200 ul van CB substraat in rij B van de plaat van de steekproef. </li><li> Pipetteer 200 ul van NAG substraat in rij C van de plaat van de steekproef. </li><li> Pipetteer 200 ul van PHOS substraat in rij D van de plaat van de steekproef. </li><li> Pipetteer 200 ul van XYL substraat in rij E van plaat van de steekproef. </li><li> Pipetteer 200 ul van AG substraat in rij F van de plaat van de steekproef. </li><li> Pipetteer 200 ul van LAP substraat in rij G van de plaat van de steekproef. </li><li> Herhaal de stappen 1.5.1 - 1.5.7 voor elke incubatie temperatuur monster plaat. </li></ol></li></ol> 2. Incubatie van assayplaten <ol><li> Dicht de deep-well platen (&quot;Voorbeeld&quot;, &quot;MUB standaard&quot;, en &quot;MUC standaard4 ;) met plaat matten. </li><li> Inverteren elk (verzegeld) plaat met de hand tot de oplossing goed gemengd (~ 10x). </li><li> Plaats platen in geschikte incubator vereiste incubatietijd periode (Tabel 3). </li><li> Noteer de eerste keer als Time 0. Nemen ook de geschikte incubatietijd, zodat je weet wanneer je de plaat uit de incubator (tabel 3) te verwijderen. </li><li> Aan het einde van elke incubatieperiode gecentrifugeerd afgedichte platen gedurende 3 min bij ongeveer 2900 x g. </li><li> Na certificering, transfer 250 ul van elk putje van de bebroede diepe putjes in overeenkomstige putten in zwarte platte bodem 96-well platen (een zwarte plaat zal worden gebruikt voor elke bebroede deep well plaat). Het is belangrijk om monsters te brengen van de geïncubeerde diepe putjes in dezelfde putjes (bijvoorbeeld A1 ... A12, enz.) in de zwarte platte bodem 96-putjes platen (Tabel 1, 2). </li></ol> 3. Fluorescerende Metingen aaneen Microplaat Fluorometer <ol><li> Na instructies van de fabrikant voor de fluorometrische plaat lezer gebruikt, stelt u de excitatie golflengte 365 nm en emissie golflengte van 450 nm (of gebruik de juiste filters). </li><li> Lees de drie platen op de fluorometer. Belangrijk: samples en standaard platen (dwz MUB of MUC) moet worden gelezen met behulp van dezelfde winst. <ol><li> Stel de spectrofotometer om automatische versterking en lees de MUC en MUB Standaard platen. </li><li> Set winst op handmatig, en de waarde te verlagen van optimaal naar de volgende laagste aantal, afgerond op de dichtstbijzijnde vijf, voor elke standaard plaat. Herhaal 2x voor elke plaat. </li><li> Stel de gain automatisch en draaien de plaat van de steekproef. Voer de plaat van de steekproef handmatig naar de hoogste winst voor elk van de standaard platen (dwz MUB en MUC) overeenkomen. </li></ol></li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Voer standaard curve fluorescentie gegevens in spreadsheet voor MUB (tabel 4a) En MUC standaard (tabel 4b) <ol><li> Converteren (uM) concentraties (umol) (tabellen 4a en 4b). </li></ol></li><li> Voor standaard curve fluorescentiegegevens elk monster, het berekenen van de helling, de y-as, en R2-waarden voor MUB en MUC (umol) standaard concentraties. Acceptabel R 2 waarden hoger mag zijn dan 0,98 voor elk monster (tabellen 4a en 4b). Het kan nuttig zijn standaard curves visualiseren in een scatterplot zijn, met fluorescentie leest uitgezet als afhankelijke variabele (y-as) en standaardconcentratie (umol) uitgezet als de onafhankelijke variabele (x-as) (figuur 1). </li><li> U vindt de MUB en MUC standaard stooklijn en de y-as waarden gebruiken om het monster + substraat ruwe fluorescentie gegevens in potentiële EEA berekenen. U moet eerst het monster + substraat ruwe fluorescentie gegevens invoeren in een nieuwe spreadsheet (tabel 5a </strong&gt;). Je moet ook de incubatietijd (hr) en de bodem droog gewicht, voor elk monster (tabel 5b) in te voeren. Merk tijd-waarden in dit voorbeeld opgenomen zijn 3 uur, omdat de monsters werden geïncubeerd bij 25 ° C (tabel 3). <ol><li> Trek de standaard curve interceptwaarden van het overeenkomstige monster fluorescentie waarden en vervolgens delen door de helling van de overeenkomstige standaard curve (tabel 5c). Om dit te bereiken, herschikken standaard lijn vergelijking op te lossen voor het monster enzym concentratie (x), x = (yb) / m waarin: [y = monster fluorescentie rauwe lezen; b = onderscheppen van MUB of MUC Standard curve; m = helling van MUB of MUC Standard curve]. </li><li> Vermenigvuldig monster umol, uit stap 4.3.1 hierboven, met 91 ml (buffer volume gebruikt in de bodem suspensie) (tabel 5d). </li><li> Waarde kloof in stap 4.3.2 verkregen door het monster-specifieke incubatietijd en droge grond massa (Tabel 5e): [enzym amt. (&amp; #956; mol) x 91 ml x incubatie (hr) x droge grond (g) x 0,8 ml x 1.000] Opmerking: 0.8 ml = het volume van slurry in elk putje en 1000 corrigeert de eigenlijke bodem hoeveelheid in elk putje. </li><li> Vermenigvuldig de in stap 4.3.3 verkregen door 1000 om de gewenste eenheden (nmol activiteit / g droge grond / uur) (tabel 5f) krijgen waarde. </li></ol></li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het laboratorium op basis van meting van de potentiële bodem EEA kan belangrijke inzichten in microbiële antwoorden op hun abiotische milieu, en de gevolgen daarvan voor het functioneren van ecosystemen leveren. De resultaten van dit voorbeeld dataset suggereren dat minimale verschillen bestaan ​​in de bodem enzymactiviteit of kinetiek tussen klimaat behandeling percelen. Echter, inverse trends onder standplaatsen stimuleren verder onderzoek van covariaten dat de productie van microbiële EEA zoals bodemvochtigheid, bodem-pH of plantengroei beïnvloeden. Over het algemeen, het beoordelen van EEA in termen van (1) de totale EER in de bodem, (2) EER stoichiometric (3) Arrhenius percelen / activatie-energie, en (4) Q 10 biedt een breed spectrum aan benaderingen die indicatief zijn voor het ecosysteem-niveau processen kunnen worden van waaruit robuust karakteriseren bodemecosysteem functionele dynamiek. High-throughput-fluorescentie gebaseerde EER-testen zijn een nuttig instrument dat op grote schaal wordt gebruikt om potentiële EEA in de bodem te onderzoeken enandere omgevingen. Belangrijk, potentiële activiteiten weerspiegelen het enzym grootte van het zwembad, maar niet op zichzelf kwantificeren enzym productie of omzet tarieven 46. Hoewel de techniek is relatief eenvoudig, kunnen ogenschijnlijk kleine verschillen tussen laboratorium protocollen de vergelijkbaarheid van de resultaten 13 belemmeren. Helaas hebben we momenteel geen geschikte gestandaardiseerde positieve controles voor de EDEO. De stoichiometrische verhoudingen is een benadering voor het overwinnen van deze uitdagingen. Anders, de komst van high-throughput technieken gevorderd de studie van enzymen in de omgeving 4. Zorgvuldige interpretatie van de door deze assays gegevens kunnen belangrijke trends in microbiële activiteit helderen. De robuustheid van het protocol voort uit de mogelijkheid om te selecteren voor specifieke omstandigheden van afzonderlijke monsters, maar dit kan ook leiden tot beperkingen. Een reeks van aanpassingen nodig zijn om te waarborgen monsters nauwkeurig gemeten<html> afzonderlijk veld plaatsen: Buffer De geselecteerde buffer hangt af van de pH van de bodem. Buffering stabiliseert ook de fluorescentie-intensiteit van het fluorescerende normen, die sterk pH afhankelijk 27,47. De pH buffer die we gebruiken meestal de bodem slurry is een 50 mM natriumacetaat of Tris buffer die is gekozen voor de buffer bijzonder zuur dissociatie constante (pKa) naar beste match bodem - monster pH niveaus. Sodium acetate heeft een pKa van 4,76 en Tris heeft een pKa van 8,06, zodat de hoeveelheden van deze twee buffers variëren om de gewenste pKa bereiken voor de afzonderlijke monsters. Fosfaatbuffer (pKa = 7,2) is voorgesteld voor neutrale / licht basische bodems. Maar we waarschuwen om te testen op analytische variabiliteit in voorstudies voor het gebruik van deze buffer, zo hoog fosfaatgehalte kan interfereren met enzymactiviteit. Behandeling en opslag van fluorescerende substraten jove_content &quot;&gt; Fluorescentie assays kunnen last hebben van interferentie veroorzaakt door onzuiverheden en / of instabiliteit van veel fluorescerende verbindingen bij blootstelling aan licht, dus voorzichtigheid is vereist bij het hanteren fluorescerende substraten. We raden sterk aan het minimaliseren van eventuele blootstelling aan licht om fluorescent gelabelde substraten en MUB en MUC normen . behulp amberkleurige glazen flessen of afdekken van het glaswerk en containers gebruikt voor het maken en opslaan van fluorescerende substraten en normen wordt sterk aanbevolen; aluminiumfolie om glaswerk en containers wrap werkt goed Ook efficiënt inenten van borden en het overbrengen naar donker incubators is best practice Wij raden.. het opslaan van substraten en normen (-20 ° C) niet langer dan twee maanden (terwijl hen te beschermen tegen licht), en ontdooien substraten (5 ° C) ~ 24-48 uur voor het begin van het enzym assay (s). Ontwerp en replicatie Om zo goed mogelijk rekening te goed om goed monster variaties, implementeren negative assay controles en (indien mogelijk) test repliceert aanbevolen. Variatie is meestal het gevolg van verschillen in de hoeveelheid gronddeeltjes in elk putje en pipetteringsfouten. Daarom zal een sterke menging en goede pipetteertechniek substantieel goed minimaliseren om goed variatie. Verder raden we implementeren van een negatieve test controle (buffer + substraat oplossing) om substraat inconsistenties tijdig te signaleren. Dit kan gemakkelijk worden gevolgd bij het lezen van het enzym platen door vergelijking negatieve controle putjes (we meestal de laatste kolom van de 96-well platen). Negatieve controles substraat zijn meestal stabiel, dus het signaal stijgt ruim boven detectielimiet is indicatief voor verontreiniging of substraatinstabiliteit, die een vervanging van het substraat en / of standaardoplossingen. Om de doorvoer te maximaliseren, ons protocol bevat een aantal potentiële EDEO met een diepe putsmicroplaat, hoewel andere protocollen uit te voeren een soort vanassay per plaat (dwz een substraat per plaat), aangezien verschillende EEA optreden tegen verschillende tarieven. Ongeacht, moet enzym optimalisatie worden uitgevoerd op de bodem voordat u deze hoog gedurende aanpak of de enkele plaat aanpak. Meerdere substraten kunnen worden gebruikt op een enkele plaat als de reactiesnelheden relatief consistent zijn voor elk enzym binnen de periode van incubatie. Ons protocol raadt ~ 2,75 g bodem aan de suspensie oplossing te maken, terwijl ~ 1 gram wordt aanbevolen in andere protocollen 24. Wij stellen voor dat het gebruik van meer grond (indien mogelijk) is een effectieve aanpak van een betere weergave van binnen-monster bodem variatie in enzymactiviteit niveaus. In dit protocol incubeer we 800 ul bodem gesuspendeerd in 200 pi substraat, terwijl andere slechts incubeer 200 gl bodem gesuspendeerd in 50 ui substraten. Dit is gewoon een functie van schaalvergroting die uiteindelijk niet de gemeten activiteit veranderen. Er zijn ook praktische voordelenvoor het gebruik van grotere volumes. One, is het makkelijker om de bodem deeltjes te vermijden tijdens het pipetteren in corresponderende zwarte platte bodem 96-well platen voor de opname intensiteiten op de fluorometer. Ten tweede, het extra volume is nuttig in het geval van accidentele lozingen tijdens de overdracht van de zwarte platte bodem 96-well platen met de fluorometer vóór de opname-enzym gerelateerde fluorescentie-intensiteiten. Zelfs kleine afwijkingen in volume zal fluorescentie aanzienlijk dalen onder putten. Tenslotte vanwege de hoge doorvoer aard van dit protocol, we gewoonlijk verkiezen vertrouwen op experimentele replicatie variatie in enzymactiviteit niveaus plaats uitvoeren assay repliceert vertegenwoordigen. Het is altijd best practice analytische herhalingen omvatten, maar in de praktijk, voelen we ons protocol voorziet in een evenwichtige afweging tussen analytische en experimentele herhalingen gegeven beperkte middelen. Ook onze aanpak maakt gebruik van relatief meer goed gehomogeniseerd bodem (2,75 g) per test 25, die inherentntly vermindert binnen-bodemvariaties. De beslissing om analytische herhalingen te gebruiken moet zorgvuldig worden overwogen door het testen voor analytische fout in voorstudies 48. We raden echter aan dat experimentele ontwerpen met minder dan 4 behandeling-groep replica sterk moeten overwegen om assay replicaties. Bodem, Buffer Volumes en substraatconcentratie optimalisatie De bodem buffer: substraat concentratie ratio is een belangrijke variabele die sterk van invloed op de gemeten fluorescentie bij het uitvoeren enzymanalyses. De hoeveelheid grond in de suspensie toegevoegd assay of de concentratie van substraat moeten worden aangepast afhankelijk van de activiteit van enzymen in het bodemmonster. De voor dit voorbeeld bedragen waren gebaseerd op eerdere testen met deze gronden om ervoor te zorgen dat de beschikbaarheid van substraat werd beperkende, en dat we het meten van maximale potentieel tarieven onder de testomstandigheden (V max) 44,45. Voor grondmonsters die hoge concentraties van enzymen, de hoeveelheid grond of substraat concentratie moet worden verhoogd. We hebben gevonden dat stijgende concentraties substraat (en dienovereenkomstig aanpassend standaardcurve) beïnvloeden lineariteit van de curve. Daarom raden wij de bodem meer bedragen en / of proportioneel aanpassingen volumes als nodig bufferen. Ongeacht, is het belangrijk om substraatconcentratie optimaliseren voor elke grondsoort bepaald omdat gemeten EEA kunnen verschillen door een orde van grootte groter tussen verzadigde en sub-verzadigde concentraties substraat 26. Daarom verschillen tussen experimentele behandelingen (etc.) zijn gevoelig voor type II statistische fout en minder kans om te worden gedetecteerd op-sub verzadigende omstandigheden, en statistische fout 27,35. Om substraatconcentraties optimaliseren dient voorafgaande enzymbepalingen uitgevoerd op representatieve monsters met uiteenlopende substraatconcentraties. Naopnemen van de fluorescentie eenvoudig plotten de gegevens (vergelijkbaar met de standaardkromme voorbeeld, Figuur 1) op het substraat concentratie (x-as) die overeenkomt met de activiteit (y-as) enzym identificeren waar de helling vlakt (~ 0). Ook de substraatconcentratie overeenkomt met het punt waar de helling vlakt (~ 0) is een goede indicatie van de optimale substraatconcentratie voor die bodem. Deze assay meet uiteindelijk fluorescentie gedurende een bepaalde tijd door het fluorogene groep die wordt afgesplitst van het substraat als gevolg van enzym gemedieerde substraat depolymerisatie. Derhalve stap 5 (substraat toevoeging) is kritisch en moet zo efficiënt mogelijk om de tijd tussen wanneer het substraat wordt toegevoegd aan de bodem en wanneer de testen worden geïncubeerd minimaliseren worden uitgevoerd. Ook wanneer het substraat in contact komt met het monster, zal enzymatische reacties gaan optreden. Wij raden het gebruik van een multi-channelpipet om deze reden. Het wordt sterk aangeraden om efficiënter te worden met behulp van de multi-channel pipet voorafgaand aan de dag dat u het uitvoeren van uw enzymanalyses. Om dit te bereiken, kunt u pipetteren oefenen met water tot je gemakkelijk volumes kunt overschrijven naar de 96-well platen met je pipet. Bodem Quenching Afschrikken verwijst naar afnemende fluorescentie-intensiteit als gevolg van deeltjes en / of organisch materiaal in de bodem slurries-incubaties 26. Afschrikken kan worden beïnvloed door aanpassing van de bodem: buffer verhoudingen 25. Door de achtergrond fluorescentie van afzonderlijke monsters, is het essentieel om normen uitgevoerd met monsters vertegenwoordigen achtergrond (quenching) van fluorescentie. Hoewel sommige protocollen gebruiken een enkele concentratie na het testen dat het signaal lineair is, raden wij de implementatie van een standaard afschrik controle voor elk monster de beste controle voor de effecten van blussen. Doet u dit niet zal resulteren in een standard curve niet van toepassing op het monster, en een verkeerde inschatting van de enzymatische activiteit. De toevoeging van normen bodem slurries niet tijdgevoelig, als standaard toevoeging laat de achtergrond fluorescentie van het monster. NaOH toevoeging De toevoeging van NaOH wordt gebruikt in sommige protocollen fluorometrische enzymactiviteit metingen te optimaliseren omdat de fluorescerende kleurstof vrijgemaakt uit de synthetische substraten vertoont piekfluorescentie bij pH&gt; 9,0 26,49. Bij het ​​overwegen van dit voorstel wordt de NaOH-concentratie nodig om de bodem slurry pH (dwz tot pH&gt; 9) variëren afhankelijk van de bodem en de pH 26 buffer gebruikt. Maar anderen beweren dat NaOH niet nodig zijn omdat de signaalintensiteit het algemeen zeer hoog, zelfs bij lagere pH en omdat introduceert een extra bron van meetfouten. Bijvoorbeeld, het effect van NaOH aanvullingen slurry pH en daarmee MUB of MUC fluorescence veranderingen in de tijd 25. MUB verbonden substraten altijd constante verhoogde fluorescentie gedurende 20 min na toevoeging NaOH voordat niveaus taps tonen, terwijl MUC steady aangetoond afgenomen fluorescentie tot 60 min. 26. Daarom is het belangrijk om de tijd tussen NaOH toevoeging en fluorescentiemeting standaardiseren. Als alternatief, als fluorescentie niveaus voldoende detecteerbaar zonder toevoeging, voeren de testen zonder toevoeging van NaOH is voorgesteld als een even aanvaardbaar alternatief 26. Temperatuur Temperatuurgevoeligheid moet rekening worden gehouden bij de beslissing incubatie temperatuur. Als de primair belang is begrip enzymkinetiek, met drie of meer temperaturen zoals geïllustreerd middels Arrhenius plots (in het resultaat) is een robuuste benadering. Als de steekproef site heeft karakteristieke lage temperatuur zoals permafrost bodem, dan is de DUURn incubatie moet worden verruimd om de enzymen in de koudere incubatie temperaturen reageren. Terwijl de traditionele enzymkinetiek suggereert dat een temperatuurverhoging moeten leiden enzymactiviteit hebben wij gevonden dat enzymen plaatsspecifieke qua temperatuurgevoeligheid 50 kan zijn. Daarom naar site-specifieke enzymactiviteit potentieel begrijpen is het essentieel dat incubatie temperatuur en de duur worden aangepast aan terreinsite waarden weerspiegelen. Conclusie EE zijn essentieel blijken voor de biogeochemische processen in de bodem, en dus moeten we in staat zijn om hun activiteiten te meten. Er zijn veel uitdagingen voor het meten van EEA in de bodem, met inbegrip van interferentie en remming. Ondanks deze problemen kunnen gestandaardiseerde protocollen (zoals hier beschreven) universeel toegepast EEA maat voor diverse enzymen. Hoewel het vrij eenvoudig om de kwaliteit van gegevens te genereren na deze protocollen, het ininterpretatie van deze gegevens in een ecologische context vereist een zorgvuldige afweging van wat deze testen zijn echt te meten, en hoe EEA onder testomstandigheden kunnen verschillen van die onder in situ-omstandigheden.

Extracellulaire enzymen (EWS), geproduceerd door bodembacteriën, schimmels, en archaea zijn betrokken bij talloze biogeochemische processen, en staan ​​centraal in de verwerking, stabilisatie en destabilisatie van organische stof en nutriënten cycli in terrestrische ecosystemen 1. Door het produceren van EE, bodemmicroben ontleden en transformeren polymeer organisch materiaal in kleinere oplosbare moleculen, waardoor het bevrijden eerder gebonden micro-en macronutriënten, waardoor planten en microben beschikbare voedingsstoffen te assimileren uit de bodem. EE werden onderzocht voor tientallen jaren, voornamelijk door het meten van hun activiteiten laboratoriumbepalingen 2-4, omdat het zeer moeilijk direct te detecteren en te kwantificeren enzymen. Extracellulaire enzymactiviteit (EEA) het sterkst geregeld door de concentratie van enzymen en overeenkomstige substraten. De overvloed van verschillende C-, N-en P-afbrekende enzymen in de bodem wordt bepaald door talrijke factoren including microbiële biomassa, gemeenschap, beschikbaarheid substraat, microklimaat en stoichiometrische eisen 5,6. Echter, in situ EEA in de bodem milieu worden ook beïnvloed door de temperatuur 7,8, de binding van enzymen om de bodem klei en humus eigenschappen 2 en diffusie beperkingen 9, die uiteindelijk regelen het actief enzym zwembad, in termen van grootte, beschikbaarheid substraat , en personeelsverloop 10-12. Daarom erkennen in situ bodemgesteldheid is van cruciaal belang bij het ​​gebruik van laboratorium enzymbepalingen naar bodem microbiële functie interpreteren over verschillende milieu-sites. Veel verschillende klassen van de EER kan worden gekwantificeerd in het laboratorium testen met behulp van een verscheidenheid van synthetische substraten (zie &quot;Lijst van reagentia Table&quot; voor meer details). Sommige protocollen gebruiken substraten in testen die zijn gekoppeld met een colorimetrische reactie die kan worden gedetecteerd met een spectrofotometer, while anderen, met inbegrip van het protocol beschrijven we hier gebruik maken van substraten die zijn gebonden aan een fluorescerende groep. Fluorescentie EE assays zijn meestal gevoeliger (door een orde van grootte) dan colorimetrische assays (die een chromogene groep verbonden met een synthetisch substraat gebruikt) 12-14. Gevoeligheid van detectie EER omvat twee aspecten: is gecorreleerd met de hoeveelheid van de verbinding van belang gedetecteerd en de andere de laagst mogelijke detecteerbare enzymactiviteit. Methoden voor colorimetrische P-nitrofenol (PNP)-gebaseerde testen is te vinden in het verleden werkt 15,16. Kortom, de bodem (typisch gezeefd &lt;2 mm en aan de lucht gedroogd) wordt geïncubeerd bij optimale of veld-relevante temperatuur en pH. De snelheid waarmee het reactieproduct model colorimetrisch bepaald met een spectrofotometer 14. De hogere gevoeligheid van de fluorescentie enzym assays is deels te wijten aan de meer gevoelige detectie van het fluorogene groep scheiding verbonden substrat afbraak plaats van opname absorptie na afscheiden van specifieke chromogene groep op een specifieke golflengte. De twee meest gebruikte synthetische fluorescente indicatoren 4-methylumbelliferon (MUB) 17 en 7-amino-4-methylcumarine (MUC) 18,19. MUC-gekoppelde substraten worden vaak geassocieerd met N-rijke synthetische substraten zoals eiwitten en / of aminozuren. Fluorescerende technieken werden voor het eerst ontwikkeld voor aquatische monsters 20,21, en ​​de toepassing ervan op de bodem vereist controles voor signaal afschrikken en interferentie 22,23. Testen kan zowel worden uitgevoerd met behulp van traditionele &quot;bench top&quot; chemie met grote volumes, of kan worden gebruikt in microplaat-protocollen, met verhoogde doorvoersnelheid maar mogelijk hogere meetfout. Terwijl er verscheidene veelvuldig geciteerd protocollen voor fluorescentiedetectie van EEA in de bodem 24 veel laboratoria gebruiken subtiele variaties op deze protocollen vaak per ongeluk of door verschils in het laboratorium apparatuur of reagentia. Ogenschijnlijk kleine verschillen in de details van de protocollen kan sterk van invloed zijn gemeten EEA 25,26 en het ontbreken van gestandaardiseerde enzymen maakt het een uitdaging om analyses tussen verschillende laboratoria te kalibreren. Er is dus een belangrijke behoefte voor de verspreiding van gedetailleerde protocollen aan de standaardisatie van de EER-testen aan te moedigen. In ons protocol worden grondmonsters bereid door grondmonsters met een pH-buffer en homogeniseren met een blender. De suspensies worden vervolgens geïnoculeerd met een beperkende hoeveelheid van fluorescent gelabelde C-, N-of P-rijke substraat gekozen afhankelijk van de specifieke vraagstelling plaats. Bodem-slurries in de enzymtesten dient als controle diffusie beperkingen substraat te minimaliseren. De fluorescerende resten geblust totdat ze gesplitst van hun respectievelijke substraten en dus enzymactiviteit kan worden gedetecteerd als de fluorescerende kleurstof wordt vrijgemaakt uit het substraat by een enzym gekatalyseerde reactie. De toenemende fluorescentie-intensiteit door de tijd geeft de snelheid van de enzym-gekatalyseerde reactie. Het algemene concept van de fluorescentie enzym assay is dat synthetische substraten gebonden met een fluorogene groep (fluorescente kleurstof), wordt toegevoegd aan bodemmonsters 27. Tijdens enzymgekatalyseerde substraat degradatie, de band breekt tussen de fluorescerende kleurstof en het substraat. De fluorescerende kleurstof vrijgemaakt uit het substraat wordt derhalve gebruikt als een indirecte evaluatie van enzymactiviteit en kan worden gekwantificeerd met behulp van een microplaat lezer naar de fluorescentie-intensiteit van de kleurstof te detecteren. In het kort wordt de fluorescentie kwantificering volbracht als de vrijgekomen kleurstof licht uitzendt van een golflengte na het absorberen van licht van een andere golflengte. De fluorescentie-intensiteit wordt geregistreerd door een plaatlezer staat om zowel excitatie en detectie. Enzymactiviteit kan vervolgens gekwantificeerd op basis van de bekende fluorescerende kleurstof concentrations van het substraat (dwz bekend hoeveelheden synthetisch substraat toegevoegd grondmonsters) met verwijzing naar een standaard verdunningscurve van fluorescentie-intensiteiten voor de specifieke fluorogene groep van het substraat in de test (bijvoorbeeld 4-methylumbelliferon (MUB) of 7-amino -4-methylcumarine (MUC)). (Zie de sectie protocol voor specifieke details over enzymactiviteit kwantificering). Laboratorium bodem enzym assays zijn nuttig voor de beoordeling microbiële functie, maar er zijn verschillende technische beperkingen die gebruikers moeten erkennen 10. Fluorescentie-assays kunnen last hebben van interferentie veroorzaakt door onzuiverheden en / of instabiliteit van veel fluorescerende verbindingen bij blootstelling aan licht, dus voorzichtigheid is vereist bij het ​​hanteren fluorescerende substraten 25. Bodem deeltjes en / of organisch materiaal in de bodem suspensies kunnen ook interfereren met fluorescentie-intensiteiten, bekend als het quenching effect 26.Bovendien laboratorium enzymassays beoordeelt enige potentiële EEA onder laboratoriumomstandigheden. In vitro testen meten EEA onder omstandigheden waarbij substraat diffusie en overvloed is niet beperkend. Daarom kan de door deze assays gegevens geen goede proxy voor EDEO onder in situ bodemgesteldheid 10. Kortom, enzymactiviteit is zeer nuttig voor relatieve vergelijkingen waarbij bodemtypes soortgelijk. Echter, bij het gebruik van deze methode om activiteiten te vergelijken tussen verschillende bodems die verschillen in fysische of chemische eigenschappen, moet voorzichtigheid worden betracht. Dit komt door het feit dat verschillen in grondsoort en temperatuur drastisch de staat kan veranderen in situ enzymkinetiek. Een andere beperking is dat relatief weinig substraten zijn commercieel verkrijgbaar (vergeleken met de natuurlijke omgeving). Bovendien is de synthetische substraten gebruikt voor enzymbepalingen zijn relatief eenvoudig (gemakkelijk oplosbaar) kan niet nauwkeurig de bodem aanwezige substraten of beschik vertegenwoordigene in situ. Een andere factor die meespeelt is dat het gebruik van de bodem slurry zal de activiteit van sommige gestabiliseerde enzymen (dwz geïmmobiliseerd door organische stof of klei) die niet actief kunnen zijn onder in situ-omstandigheden 2 op te nemen. Laboratorium enzymassays ook geen informatie verstrekken over de persistentie van enzymen in de bodem (enzym omzet tarieven) of informatie over het specifieke microbiële soorten die produceren bodem enzymen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents: </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#945;-D-glucopyranoside (AG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9766</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-glucopyranoside (BG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3633</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside (CB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6018</td>
			<td>Cellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2145</td>
			<td>Protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl N-acetyl-&#946;-D-glucosaminide (NAG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2133</td>
			<td>Chitin degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8883</td>
			<td>Phosphorus mineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl-&#946;-D-xylopyranoside (XYL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7008</td>
			<td>Hemicellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferone (MUB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-4-methylcoumarin (MUC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Sodium acetate anhydrous buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>acidic and neutral soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris base buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td>basic soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-65</td>
			<td>pipetting reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-684-265</td>
			<td>8-channel pipette, range: 50-1,200 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 101-1,250 &#956;l extended length natural tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1112 - 1720</td>
			<td>10 racks of 96 tips (960 tips)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-100SH</td>
			<td>Lab disc magnetic stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring blender</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-509-7P</td>
			<td>Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Dispensette III bottle-top dispensers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-688-231</td>
			<td>Dispenser; range: 5-50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Unispense &#956;P peristaltic pumps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683-7</td>
			<td>Optional dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1451363SIX</td>
			<td>Used to stirr soil slurry afer blending</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass bowls</td>
			<td>World Kitchen</td>
			<td>5304218</td>
			<td>Pyrex 10 oz rimmed custard cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well black solid plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-590</td>
			<td>Used for plate reader step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well assay blocks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-700</td>
			<td>V-bottom; 2 ml; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-387-93</td>
			<td>Sterile 96-well cap mat for square wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge equipped with holders for deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3121</td>
			<td>Centra-GP8 (this model is no longer available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30016058</td>
			<td>Plate reader (this model is no longer available)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities

Microben in de bodem en andere omgevingen produceren extracellulaire enzymen depolymeriseren en hydrolyseren biologische macromoleculen zodat deze kan worden opgenomen energie en voedingsstoffen. Meten bodem microbiële enzymactiviteit is cruciaal in het begrijpen bodemecosysteem functionele dynamiek. Het algemene concept van de fluorescentie enzym assay is dat synthetische C-, N-of P-rijke substraten gebonden met een fluorescente kleurstof worden toegevoegd aan bodemmonsters. Wanneer intact, niet de gelabelde substraten niet fluoresceren. De enzymactiviteit wordt gemeten als de toename in fluorescentie als het fluorescente kleurstoffen zijn gesplitst van de substraten, waardoor ze fluoresceren. Enzym metingen kunnen worden uitgedrukt in eenheden van molariteit of activiteit. Om deze analyse uit te voeren, worden de bodem slurries bereid door aarde met een pH buffer. De pH buffer (gewoonlijk 50 mM natriumacetaat of 50 mM Tris-buffer), wordt gekozen voor bepaalde zure dissociatie constante (pKa) van de buffer te passen aan de bodem sample pH. De bodem slurries worden geïnoculeerd met een beperkende hoeveelheid van fluorescent gelabelde (bijvoorbeeld C-, N-of P-rijk) substraat. Bodem-slurries in de test dient om beperkingen enzym en substraat diffusie minimaliseren. Daarom is deze test controles voor verschillen in substraat beperking diffusiesnelheden en pH-omstandigheden, dus detecteren potentiële enzymactiviteit tarieven als functie van het verschil in enzymconcentraties (per monster). Fluorescentie enzymassays zijn meestal gevoeliger dan spectrofotometrische (dwz colorimetrische) assays, maar kunnen last hebben van interferentie veroorzaakt door onzuiverheden en de instabiliteit van vele fluorescente verbindingen bij blootstelling aan licht, dus voorzichtigheid is geboden bij het ​​hanteren van fluorescerende substraten. Ook deze methode beoordeelt enige potentiële enzym activiteiten onder laboratoriumomstandigheden als substraten niet beperkend zijn. Voorzichtigheid moet worden betracht bij de interpretatie van de gegevens die kruisTer plaatse vergelijkingen met verschillende temperaturen of grondsoorten, zoals in situ grondsoort en temperatuur enzymkinetiek beïnvloeden.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities at JoVE.com

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Om mogelijke tarieven van de bodem extracellulair enzym activiteiten te meten, zijn synthetische substraten die zijn gebonden aan een fluorescerende kleurstof toegevoegd aan bodemmonsters. De enzymactiviteit wordt gemeten als de fluorescerende kleurstof wordt vrijgemaakt uit het substraat door een enzym gekatalyseerde reactie, waarbij hoger fluorescentie geeft meer substraat afbraak.

High-throughput Fluorometrische Meting van Potentiële Soil Extracellular Enzyme Activiteiten

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Opzet en werking van een continue<sup&gt; 13</sup&gt; C<sup&gt; 15</sup&gt; N Labeling Kamer voor Uniform of Differentieel, Metabole en structurele, Plant isotooplabelen

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Meting van Greenhouse Gas Flux uit landbouwgrond met statisch Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

Semi-high throughput screening voor Potentiële Droogte-tolerantie in Sla (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) Kiemplasmacollecties

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Een Gusseted Thermogradient Tabel naar grondtemperaturen controle voor het evalueren van Plant Groei en Monitoring bodemprocessen

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Protocols for Quantifying Transferable Pesticide Residues in Turfgrass Systems

Protocollen voor het kwantificeren van Overdraagbare residuen van bestrijdingsmiddelen in Turfgrass Systems

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Meten en in kaart brengen van patronen van bodemerosie en afzetting aan de bodem carbonaat concentraties onder beheer van de landbouw gerelateerde

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Een 3-dimensionale (3D)-sjabloon voor High Throughput Zebrafish Embryo Arraying afgedrukt

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Use of Principal Components for Scaling Up Topographic Models to Map Soil Redistribution and Soil Organic Carbon

Gebruik van Principal Components voor schaalvergroting van modellen van de topografische kaart van herverdeling van de bodem en bodemverontreiniging organische koolstof

Landscape topography is a critical factor affecting soil formation and plays an important role in determining soil properties on the earth surface, as it ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderofoor High-throughput Screening van milieu monsters: plantaardige weefsels, Bulk bodems en rhizosfeer bodems

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...