Name: high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities
Uploaded: 2013-11-15T18:00:00
Duration: 12 min 33 s
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Questa pubblicazione è stata finanziata dagli enzimi in ambiente coordinamento della ricerca Research Network sostenuta dalla National Science Foundation degli Stati Uniti (DEB # 1.021.559). Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Science Foundation degli Stati Uniti (DEB # 1021559), e il Dipartimento di Ufficio Energia della Scienza (Biological and Environmental Research) degli Stati Uniti. Le opinioni, i risultati e le conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della NSF statunitense.

1. Assay Set-up <ol><li> Label 3 piatti e profondi: &quot;esempio&quot;, &quot;standard MUB&quot;, e &quot;standard MUC&quot;. </li><li> Versare ogni standard (MUB di 0, 2,5, 5, 10, 25, 50 e 100 micron) e supporto (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) in serbatoi, prelabeled pulite separati (orientato in righe) . </li><li> Pipettare l&#39;appropriato livello MUB nei pozzetti corrispondenti della piastra standard MUB (Tabella 1). <ol><li> Dispensare 200 ml di 0 micron MUB nella riga A della piastra standard MUB. </li><li> Dispensare 200 ml di 2,5 micron MUB nella riga B della piastra standard MUB. </li><li> Dispensare 200 ml di 5 micron MUB in fila C di piastra standard MUB. </li><li> Pipettare 200 ml di 10 micron MUB in fila D della piastra standard MUB. </li><li> Pipettare 200 ml di 25 micron MUB in fila E di piastra standard MUB. </li><li> Pipettare 200 ml di 50 micron MUB in fila F della piastra standard MUB. </li><li> Pipettare 200 ml di 100 μM MUB in fila G della piastra standard MUB. </li><li> Ripetere i punti 1.3.1 - 1.3.8 delle norme MUC nei corrispondenti pozzetti della piastra standard MUC. </li></ol></li><li> Fanghi suolo Prep per ogni campione di suolo. <ol><li> Pesare 2,75 g di campo terreno umido nel frullatore. </li><li> Aggiungere 91 ml di tampone 50 mM. Frullare in alto per 1 min. </li><li> Versare il contenuto frullatore in una ciotola di vetro pulito, almeno così ampia come pipette a 8 canali con ancoretta. </li><li> Mettere sul piatto mescolare, mescolare liquami suolo su bassa. </li><li> Pipettare 800 ml di liquame nel terreno prima colonna del piatto del campione (Tabella 2). </li><li> Ripetere in 1 ° colonna della norma MUB e piastre standard MUC (Tabella 1). </li><li> Sciacquare frullatore, piastra di agitazione e mescolare con bar DI H 2 O o buffer tra campioni di terreno. </li><li> Ripetere i punti 1.4.1 - 1.4.7) per ogni campione, passare alla colonna successiva ad ogni campione di suolo successiva (Tabelle 1 e2). </li></ol></li><li> Pipettare il substrato (in questo esempio, 200 pM concentrazioni) in corrispondenti pozzetti della piastra campione (Tabella 2). <ol><li> Pipettare 200 ml di substrato BG nella riga A della piastra campione. </li><li> Pipettare 200 ml di CB substrato nella riga B della piastra del campione. </li><li> Pipettare 200 ml di substrato NAG in fila C della piastra del campione. </li><li> Pipettare 200 ml di substrato PHOS in fila D della piastra del campione. </li><li> Pipettare 200 ml di substrato XYL in fila e della piastra del campione. </li><li> Pipettare 200 ml di AG substrato in fila F della piastra del campione. </li><li> Pipettare 200 ml di substrato LAP in fila G della piastra del campione. </li><li> Ripetere i punti 1.5.1 - 1.5.7 per ogni piastra del campione temperatura di incubazione. </li></ol></li></ol> 2. L&#39;incubazione delle piastre di saggio <ol><li> Sigillare le piastre deep-e (&quot;esempio&quot;, &quot;standard MUB&quot;, e &quot;standard MUC4 ;) con placca stuoie. </li><li> Capovolgere ciascuno (sigillato) piastra a mano fino a che la soluzione sia ben mescolata (~ 10x). </li><li> Posizionare le piastre in incubatore adeguato per richieste periodo di incubazione (Tabella 3). </li><li> Registrare il tempo iniziale 0 Tempo. Registrare anche i tempi di incubazione adeguati in modo da sapere quando rimuovere la piastra dall&#39;incubatore (tabella 3). </li><li> Alla fine di ogni periodo di incubazione, centrifugare le piastre sigillate per 3 min a ~ 2.900 x g. </li><li> Dopo certificazione, trasferire 250 microlitri da ciascun pozzetto delle piastre e profonde incubate in corrispondenti pozzi neri in piastre da 96 pozzetti a fondo piatto (una piastra nera verrà utilizzato per ogni piastra pozzo profondo incubate). E &#39;importante per trasferire campioni dai pozzetti profondi incubati nelle stesse pozzetti (cioè A1 ... A12, ecc) in piastre a fondo piatto da 96 pozzetti neri (Tabella 1, 2). </li></ol> 3. Misure fluorescenti suun Fluorometro micropiastre <ol><li> Seguendo le istruzioni del produttore per il lettore di piastre fluorimetrico utilizzato, impostare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione a 365 nm e lunghezza d&#39;onda di emissione a 450 nm (o utilizzare appositi filtri). </li><li> Leggere le tre piastre sul fluorimetro. Importante: campioni e piastre standard (cioè MUB o MUC) devono essere lette con lo stesso guadagno. <ol><li> Impostare lo spettrofotometro di guadagno automatico e leggere le piastre MUC e MUB standard. </li><li> Set guadagno manuale, e diminuire il valore ottimale per il prossimo numero più basso, arrotondati alle cinque, per ciascuna piastra standard. Ripetere 2 volte per ogni piatto. </li><li> Impostare il guadagno automatico ed eseguire la piastra di esempio. Eseguire nuovamente la piastra di esempio manualmente in modo che corrisponda il più alto guadagno per ciascuna delle piastre standard (cioè MUB e MUC). </li></ol></li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Inserire i dati della curva di fluorescenza standard nei foglio di calcolo per MUB (Tabella 4a) E dello standard MUC (Tabella 4b) <ol><li> Convertire (micron) concentrazioni (mmol) (tabelle 4a e 4b). </li></ol></li><li> Per i dati della curva di fluorescenza standard di ciascun campione, calcolare la pendenza, intercetta y, e R 2 valori per MUB e MUC (mmol) concentrazioni standard. Accettabile R 2 valori devono superare i 0,98 per ogni campione (tabelle 4a e 4b). Può essere utile per visualizzare le curve standard in un grafico a dispersione, con fluorescenza si legge tracciata come variabile dipendente (asse y) e la concentrazione standard (mol), tracciata come variabile indipendente (asse x) (Figura 1). </li><li> Si utilizzerà la pendenza della curva standard di MUB e MUC ei valori y-intercetta per calcolare il substrato dati grezzi di fluorescenza del campione + in potenziali EEA. È necessario prima inserire i + substrato dati grezzi di fluorescenza del campione in un nuovo foglio di calcolo (Tabella 5a </strong&gt;). Sarà inoltre necessario inserire il tempo di incubazione (hr) e nel suolo peso secco per ogni campione (Tabella 5b). Nota, i termini valori immessi in questo esempio sono 3 ore, perché i campioni sono stati incubati a 25 ° C (Tabella 3). <ol><li> Sottrarre i valori dell&#39;intercetta della curva standard dai corrispondenti valori di fluorescenza del campione e poi dividere per la pendenza della curva standard corrispondente (Tabella 5c). Per fare questo, riorganizzare equazione linea standard per risolvere per esempio la concentrazione dell&#39;enzima (x), x = (yb) / m dove: [y = campione fluorescenza lettura crudo; b = intercetta da MUB o curva MUC standard; m = pendenza da MUB o MUC curva standard]. </li><li> Moltiplicare campione micromol, a partire dal punto 4.3.1, da 91 ml (volume di buffer utilizzato in slurry suolo) (Tabella 5d). </li><li> Divide il valore ottenuto nel passo 4.3.2 il tempo di incubazione specifico del campione e massa secca del suolo (Tabella 5e): [amt enzima. (&amp; #956, mol) x 91 ml x incubazione (h) x suolo secco (g) x 0,8 ml x 1.000] Nota: 0,8 ml è il volume di liquami utilizzato in ciascun pozzetto, e 1.000 corregge la quantità effettiva suolo in ciascun pozzetto. </li><li> Moltiplicare il valore ottenuto nel passo 4.3.3 per 1000 per ottenere le unità desiderate (attività nmol / g terreno asciutto / hr) (Tabella 5f). </li></ol></li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La misurazione in laboratorio di potenziali EEA suolo può fornire importanti intuizioni risposte microbiche al loro ambiente abiotico, e le loro conseguenze per il funzionamento degli ecosistemi. I risultati di questo insieme di dati esempio suggeriscono che esistono differenze minime nella attività enzimatica del suolo o cinetiche tra trame trattamento clima. Tuttavia, le tendenze inverse tra trame incoraggiare ulteriori indagini di covariate che possono influenzare la produzione di EEA microbici quali umidità del suolo, pH del terreno o la crescita delle piante. Nel complesso, valutando EEA in termini di (1) SEE complessiva nei terreni, (2) stechiometria SEE (3) energia trame Arrhenius / attivazione, e (4) Q 10 fornisce un ampio spettro di approcci che possono essere indicativi di processi a livello di ecosistema da cui caratterizzare robusto ecosistema del suolo dinamiche funzionali. High-throughput basato sulla fluorescenza saggi SEE sono un utile strumento che è ampiamente utilizzato per esaminare i potenziali EEA nei suoli ealtri ambienti. Importante, potenziali attività riflettono la dimensione del pool enzima, ma non da soli quantificano i tassi di produzione o fatturato enzimi 46. Anche se la tecnica è relativamente semplice, differenze apparentemente minori tra i protocolli di laboratorio possono ostacolare la comparabilità dei risultati 13. Sfortunatamente, al momento non abbiamo controlli positivi standardizzati adatti per SEAE. L&#39;uso di rapporti stechiometrici è un approccio per superare queste sfide. Altrimenti, l&#39;avvento di tecniche high-throughput ha avanzato lo studio degli enzimi nell&#39;ambiente 4. Interpretazione attenta dei dati generati da questi test potrebbe chiarire importanti tendenze in attività microbica. La robustezza del protocollo deriva dalla capacità di selezionare per condizioni specifiche di singoli campioni, ma questo può anche causare limitazioni. Sarà necessaria una serie di modifiche per garantire campioni paragonando i<html> siti singoli campi: Buffer Il buffer selezionato dipenderà dal pH del terreno. Buffering stabilizza anche l&#39;intensità di fluorescenza delle norme fluorescenti, che è altamente dipendente dal pH 27,47. Il buffer pH che di solito usiamo per fare l&#39;impasto suolo è un acetato 50 mM di sodio o di tampone Tris che viene scelto per la particolare acido costante di dissociazione del tampone (pKa) per terreno migliore partita - i livelli di pH del campione. Acetato di sodio ha un pKa di 4,76, e Tris ha un pKa di 8,06 quindi le quantità di questi due buffer varia per raggiungere il pKa desiderata del campione individuale. Tampone fosfato (pKa = 7.2) è stato suggerito per terreni neutri / leggermente basica. Tuttavia, si avverte per verificare la variabilità analitica in studi preliminari prima di utilizzare questo buffer, come alte concentrazioni di fosfato possono interferire con l&#39;attività enzimatica. Manipolazione e stoccaggio dei substrati fluorescenti jove_content &quot;&gt; test di fluorescenza possono soffrire di disturbi causati da impurità e / o instabilità di molti composti fluorescenti se esposti alla luce, quindi è necessaria cautela nel maneggiare substrati fluorescenti. Consigliamo vivamente di ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce di etichetta fluorescente substrati e MUB e norme MUC . Utilizzando bottiglie di vetro ambra o copre il vetro e contenitori utilizzati per la preparazione ed il deposito substrati e standard fluorescenti è altamente raccomandato, fogli di alluminio per avvolgere oggetti in vetro e contenitori funziona bene Analogamente, inoculando in modo efficiente piatti e il trasferimento di incubatori scuro è migliore prassi Vi consigliamo.. memorizzazione substrati e gli standard (-20 ° C) per non più di due mesi (mentre li protegge dalla luce) e substrati scongelamento (5 ° C) ~ 24-48 ore prima di iniziare il dosaggio enzimatico (s). Progettazione e replica Per meglio conto per bene alle variazioni del campione e, di attuazione negative controlli per analisi e (se possibile) saggio replica è raccomandato. Variazione verifica in genere a causa di differenze nella quantità di particelle di suolo in ciascun pozzetto ed errori di pipettaggio. Pertanto, forte di miscelazione e buona tecnica di pipettaggio saranno sostanzialmente minimizzare bene a variazione bene. Inoltre, si consiglia vivamente l&#39;implementazione di un controllo test negativo (soluzione tampone del substrato +) per monitorare le incongruenze del substrato nel corso del tempo. Questo può essere facilmente monitorato durante la lettura delle piastre di enzimi confrontando pozzetti di controllo negativo (si utilizzano in genere l&#39;ultima colonna delle piastre a 96 pozzetti). Controlli substrato negativi sono generalmente stabili, quindi il segnale aumenta notevolmente superiori limite di rivelazione, è indicativo di contaminazione o substrato instabilità, richiedendo la sostituzione del substrato e / o soluzioni standard. Per massimizzare il throughput, il nostro protocollo prevede diversi potenziali EEA in una singola micropiastra pozzo profondo, anche se altri protocolli svolgono un tipo ditest per piastra (cioè un substrato per piastra) in quanto diversi EEA avviene a velocità diverse. Indipendentemente da ciò, l&#39;ottimizzazione enzima deve essere eseguita su terreni prima di eseguire questo alto per tutto l&#39;approccio o il metodo piatto unico. Substrati multipli possono essere utilizzati su una singola piastra se le velocità di reazione sono relativamente coerente per ciascun enzima entro il periodo di incubazione. Il nostro protocollo raccomanda ~ 2,75 g di terreno per rendere la soluzione liquami, mentre ~ 1 grammo è raccomandato in altri protocolli 24. Ti consigliamo di utilizzare più suolo (se possibile) è un approccio efficace per una migliore cattura all&#39;interno del campione la variazione del suolo nei livelli di attività enzimatica. In questo protocollo, abbiamo incubare 800 ml di liquame terreno con 200 ml di substrato, mentre altri incubare solo 200 ml di liquame terreno con 50 ml di substrati. Questa è semplicemente una funzione di scaling up che alla fine non cambia l&#39;attività misurata. Ci sono anche vantaggi praticiper l&#39;utilizzo di volumi maggiori. Uno, è più facile evitare particolato soil durante il pipettaggio in corrispondenti lastre nere a 96 pozzetti a fondo piatto prima di registrare intensità sul fluorometro. In secondo luogo, il volume supplementare è utile in caso di perdite accidentali durante il trasferimento delle piastre a 96 pozzetti a fondo piatto nero al fluorimetro prima di registrare intensità di fluorescenza enzimi correlati. Anche lievi scostamenti in termini di volume diminuiranno in modo significativo fluorescenza tra i pozzetti. Infine, a causa della elevata velocità natura di questo protocollo, che comunemente eleggiamo a fare affidamento sulla replica sperimentale per rappresentare la variazione dei livelli di attività enzimatica, invece di effettuare test replica. E &#39;sempre consigliabile inserire repliche analitiche, ma in pratica, ci sentiamo il nostro protocollo prevede un compromesso equilibrato tra le repliche analitici e sperimentali date le risorse limitate. Allo stesso modo, il nostro approccio utilizza suolo relativamente più ben omogeneizzato (2,75 g) per dosaggio 25, che inerirediminuisce nte all&#39;interno del suolo variazioni. La decisione di utilizzare repliche di analisi deve essere attentamente considerato da test per errore analitico in studi preliminari 48. Tuttavia, si consiglia di disegni sperimentali con meno di 4 repliche di trattamento del gruppo dovrebbe fortemente considerare l&#39;utilizzo di analisi di repliche. Suolo, volumi buffer, e ottimizzazione concentrazione del substrato Il tampone del suolo: substrato tasso di concentrazione è una variabile importante che influenza fortemente la fluorescenza misurata durante l&#39;esecuzione di saggi enzimatici. La quantità di suolo nello slurry aggiunto per eseguire il test o la concentrazione di substrato può essere necessario regolare a seconda dell&#39;attività degli enzimi nel campione di suolo. Gli importi scelti per questo esempio si basavano su precedenti test di questi terreni al fine di garantire che la disponibilità di substrato è stato limitativo, e che stavamo misurando i tassi massimi possibili nelle condizioni di saggio (V max) 44,45. Tuttavia, per i campioni di terreno che hanno alte concentrazioni di enzimi, il grado di sporco o concentrazione del substrato deve essere aumentata. Abbiamo trovato che l&#39;aumento concentrazioni di substrato (e regolando la curva standard conseguenza) può influenzare linearità della curva. Pertanto, si consiglia di ridurre gli importi del suolo e / o adeguamenti proporzionali al buffer volumi, se necessario. Indipendentemente da ciò, è importante ottimizzare la concentrazione del substrato per ogni tipo di terreno analizzati perché EEA misurate possono differire da un ordine di grandezza maggiore tra le concentrazioni di substrato saturi e sub-saturi 26. Pertanto, le differenze tra i trattamenti sperimentali (ecc) sono suscettibili di tipo II errore statistico e meno probabilità di essere rilevato in condizioni sub-saturazione, e l&#39;errore statistico 27,35. Per ottimizzare concentrazioni di substrato, saggi preliminari enzimi dovrebbero eseguite su campioni rappresentativi di terreno utilizzando una vasta gamma di concentrazioni di substrato. Doporegistrazione della fluorescenza, è sufficiente tracciare i dati (analogamente all&#39;esempio curva standard; la figura 1) per identificare la concentrazione del substrato (asse x) che corrisponde ad attività enzimatica (asse y) dove i livelli di pendenza OFF (~ 0). Analogamente, la concentrazione del substrato corrispondente al punto in cui i livelli di pendenza OFF (~ 0) è una buona indicazione della concentrazione del substrato ottimale per quel particolare terreno. Questo saggio misura definitiva fluorescenza in un dato tempo prodotta dalla porzione fluorogenico che viene scisso dal substrato per effetto di enzima-substrato mediata depolimerizzazione. Pertanto, il passaggio 5 (aggiunta del substrato) è critica e deve essere eseguita nel modo più efficiente possibile al fine di minimizzare il tempo tra quando il substrato viene aggiunto ai terreni e quando i saggi vengono incubati. Analogamente, quando il substrato viene a contatto con il campione, reazioni enzimatiche inizieranno a verificarsi. Si consiglia di utilizzare un multi-canalepipetta per questo motivo. E &#39;fortemente consigliato a diventare efficiente utilizzando la pipetta multicanale prima del giorno si sta eseguendo i vostri saggi enzimatici. Per fare questo, si può praticare pipettaggio con l&#39;acqua fino a quando si può facilmente trasferire volumi nelle piastre a 96 pozzetti con la pipetta. Suolo Tempra Tempra si riferisce a diminuire l&#39;intensità di fluorescenza causata da particelle e / o materiale organico nel suolo fanghi-incubazione 26. Tempra può essere influenzata regolando il terreno: rapporti di buffer 25. A causa fluorescenza di fondo da singoli campioni, è fondamentale eseguire standard con campioni per tenere conto di sfondo (quenching) fluorescenza. Anche se alcuni protocolli utilizzano un&#39;unica concentrazione dopo la prova che il segnale è lineare, si consiglia vivamente di attuare un controllo tempra standard per ogni campione al meglio il controllo per gli effetti della tempra. In caso contrario, si tradurrà in uno standcurva ard non applicabile al campione, e una stima errata di attività enzimatica. L&#39;aggiunta di standard per boiacche suolo non è time-sensitive, come l&#39;aggiunta dello standard non influisce sulla fluorescenza di fondo di campione. NaOH aggiunta L&#39;aggiunta di NaOH viene utilizzato in alcuni protocolli per ottimizzare fluorimetrica misurazione dell&#39;attività enzimatica perché il colorante fluorescente rilasciato dai substrati sintetici presenta picco di fluorescenza a pH&gt; 9.0 26,49. Quando si considera questo suggerimento, la concentrazione di NaOH necessaria per il pH slurry terreno (cioè a pH&gt; 9) varierà a seconda del terreno particolare e il tampone pH utilizzato 26. Tuttavia, altri sostengono che NaOH non potrebbe essere indispensabile perché l&#39;intensità del segnale è generalmente molto elevata anche a basso pH, e perché introduce un&#39;ulteriore fonte di errore di misura. Per esempio, l&#39;effetto di aggiunte di NaOH in slurry pH e fluore quindi MUB o MUCcambia scence nel tempo 25. Substrati MUB collegati hanno dimostrato di dimostrare maggiore fluorescenza costante per 20 min seguito aggiunte di NaOH prima livelli cono, mentre MUC ha dimostrato costante diminuzione fluorescenza fino a 60 min 26. Pertanto, è importante standardizzare il tempo tra NaOH aggiunta e la misurazione della fluorescenza. In alternativa, se i livelli di fluorescenza sono sufficientemente rilevabili senza Inoltre, condurre i saggi senza aggiungere NaOH è stata suggerita come alternativa ugualmente accettabili 26. Temperatura Sensibilità alla temperatura dovrebbe essere preso in considerazione al momento di decidere temperatura di incubazione. Se l&#39;interesse primario è la comprensione cinetica enzimatica, con tre o più temperature come illustrato utilizzando trame Arrhenius (nella sezione risultati) è un approccio robusto. Se il sito di esempio presenta caratteristicamente bassa temperatura, come terreno permafrost, poi il duration di incubazione può dover essere estesa per consentire gli enzimi di reagire nelle temperature di incubazione più fredde. Mentre cinetica enzimatica tradizionali suggerisce che un aumento della temperatura, deve aumentare l&#39;attività enzimatica, abbiamo trovato che gli enzimi possono essere luogo specifico in termini di sensibilità alla temperatura 50. Quindi per capire il potenziale attività enzimatica sito-specifica è fondamentale che la temperatura di incubazione e la durata essere regolati per riflettere i valori del sito campo. Conclusione Straordinari sono i motori fondamentali processi biogeochimici dei suoli, e quindi abbiamo bisogno di essere in grado di misurare le loro attività. Ci sono molte sfide per EEA nei suoli, comprese le interferenze e l&#39;inibizione di misurazione. Nonostante queste sfide, protocolli standardizzati (come quello qui descritto) possono essere applicate universalmente per misurare EEA per una vasta gamma di enzimi. Mentre è abbastanza facile da generare dati di qualità seguendo questi protocolli, l&#39;ininterpretazione di questi dati in un contesto ecologico richiede un&#39;attenta considerazione di ciò che questi test siano realmente misurando, e come EEA in condizioni di saggio possono differire da quelli in condizioni in situ.

Enzimi extracellulari (SEO) prodotte dai batteri del suolo, funghi, e di archeobatteri sono coinvolti in processi biogeochimici innumerevoli, e sono al centro della trasformazione, stabilizzazione e destabilizzazione di materia organica del suolo e il ciclo dei nutrienti negli ecosistemi terrestri 1. Producendo Straordinari, microbi del suolo decompongono e trasformano la materia organica polimerica in molecole solubili più piccole, liberando in tal modo precedentemente legati micro e macronutrienti, che permette alle piante e microbi per assimilare nutrienti disponibili dal suolo. VE sono stati studiati per decenni, principalmente misurando le loro attività in saggi di laboratorio 2-4, dato che è molto difficile da rilevare e quantificare direttamente enzimi. Attività enzimatica extracellulare (EEA) è più fortemente controllata dalla concentrazione di enzimi e substrati corrispondenti. L&#39;abbondanza di diversi C-, N-, e gli enzimi P di degradazione nei suoli sono controllati da numerosi fattori including biomassa microbica, composizione della comunità, la disponibilità di substrato, microclima, e le richieste stechiometrico 5,6. Tuttavia, in EEA situ all&#39;interno dell&#39;ambiente suolo sono anche influenzata dalla temperatura 7,8, l&#39;associazione di enzimi per argille suolo e dalle proprietà umici 2, e vincoli di diffusione 9, che in ultima analisi regolano la piscina enzima attivo, in termini di dimensioni, disponibilità substrato e tassi di turnover 10-12. Pertanto, riconoscendo in condizioni di terreno in situ è fondamentale quando si utilizzano dosaggi enzimatici laboratorio di interpretare la funzione microbica del terreno in diversi siti ambientali. Molte classi diverse di SEE possono essere quantificabili in test di laboratorio utilizzando una varietà di substrati sintetici (fare riferimento a &quot;Elenco dei reagenti Table&quot; per maggiori dettagli). Alcuni protocolli utilizzano substrati in saggi che sono accoppiati ad una reazione colorimetrica che può essere rilevato con uno spettrofotometro, wentre gli altri, compreso il protocollo che descriviamo qui, utilizzare substrati che sono destinate a una frazione fluorescente. Saggi fluorescenza EE sono tipicamente più sensibili (da un ordine di grandezza) di test colorimetrici (che usa una frazione cromogenico collegato con un substrato sintetico) 12-14. Sensibilità nella rilevazione SEE comprende due aspetti: uno è legato alla quantità del composto di interesse identificati e l&#39;altra correlate al minimo rilevabile potenziale attività enzimatica. Metodi per colorimetrico P-nitrofenolo saggi basati (PNP) possono essere trovati in passato fabbrica 15,16. In breve, il suolo (tipicamente setacciata a &lt;2 mm ed essiccati) viene incubata a ottimale o campo rilevanti temperatura e pH. La velocità con cui il prodotto di reazione rilasciato è determinato colorimetricamente con uno spettrofotometro 14. La maggiore sensibilità dei saggi enzimatici fluorescenza è dovuto in parte al rilevamento più sensibile della separazione porzione fluorogenico associato substrate degradazione piuttosto che assorbanza registrazione dopo la separazione di una specifica porzione cromogenico ad una lunghezza d&#39;onda specifica. I due indicatori fluorescenti sintetici più comunemente utilizzati sono 4-metilumbelliferone (MUB) 17 e 7-ammino-4-metil (MUC) 18,19. Substrati MUC-legati sono comunemente associati con N-ricchi substrati sintetici quali proteine ​​e / o amminoacidi. Tecniche di fluorescenza sono stati sviluppati per i campioni acquatici 20,21, e la loro applicazione ai terreni richiede controlli per la tempra segnale e le interferenze 22,23. I saggi possono essere condotti con i tradizionali &quot;da banco&quot; la chimica con grandi volumi, o possono essere impiegati nei protocolli basato sulle micropiastre, con maggiore velocità, ma forse errore di misura superiore. Mentre ci sono diversi protocolli ampiamente citati per il rilevamento fluorescente EEA nei suoli 24, molti laboratori utilizzano sottili variazioni su questi protocolli, spesso involontariamente o per differenzas in attrezzature di laboratorio e reagenti. Apparentemente piccole differenze nei dettagli di protocolli possono fortemente incidere misurato EEA 25,26 e la mancanza di enzimi standardizzati rende difficile calibrare saggi tra laboratori diversi. Quindi, vi è un bisogno importante per la diffusione di protocolli dettagliati per favorire la standardizzazione dei test SEE. Nel nostro protocollo, campioni di terreno vengono preparate combinando campioni di suolo con un tampone pH e omogeneizzando con un frullatore. I fanghi vengono poi inoculate con una quantità non limitante di fluorescente C-, N-, o substrato ricco-P, scelto in funzione della domanda di ricerca specifica di interesse. Utilizzo di fanghi suolo nei saggi enzimatici serve da controllo per minimizzare limitazioni substrato di diffusione. Le frazioni fluorescenti sono state spente finchè sono spaccati dai rispettivi substrati, e quindi l&#39;attività enzimatica può essere rilevato come il colorante fluorescente viene rilasciato dal substrato by una reazione enzimatica catalizzata. L&#39;intensità di fluorescenza crescente nel tempo riflette la velocità della reazione enzimatica catalizzata. Il concetto generale del saggio di fluorescenza enzima è che substrati sintetici legati con una porzione fluorogenica (colorante fluorescente), vengono aggiunte a campioni di terreno 27. Durante enzima-substrato catalizzata degradazione, rompe il legame tra il colorante fluorescente ed il substrato. Il colorante fluorescente liberato dal substrato viene quindi utilizzato come valutazione indiretta dell&#39;attività enzimatica, e può essere quantificato utilizzando un lettore di micropiastre a rilevare l&#39;intensità di fluorescenza del colorante. In breve, la fluorescenza quantificazione si attua come colorante liberato emette luce di una lunghezza d&#39;onda dopo l&#39;assorbimento luce di una lunghezza d&#39;onda diversa. L&#39;intensità di fluorescenza è registrata da un lettore di piastre in grado sia di eccitazione e rilevamento. L&#39;attività enzimatica può essere poi quantificato sulla base della nota conce fluorescente-dyentrations del substrato (ovvero quantità note di substrato sintetico aggiunte a campioni di terreno) con riferimento a una curva di diluizione standard di intensità di fluorescenza per la frazione fluorogenico specifico del substrato usato nel saggio (cioè 4-metilumbelliferone (MUB) o 7-ammino -4-metilcumarina (MUC)). (Si prega di fare riferimento alla sezione protocollo per dettagli specifici sulle attività enzimatica quantificazione). Suolo Laboratorio saggi enzimatici sono utili per valutare la funzione della comunità microbica, ma ci sono diverse limitazioni tecniche che gli utenti dovrebbero riconoscere 10. Saggi di fluorescenza possono soffrire di disturbi causati da impurità e / o instabilità di molti composti fluorescenti se esposti alla luce, quindi è necessaria cautela nel maneggiare substrati fluorescenti 25. Particelle del terreno e / o materiale organico nei fanghi del suolo possono anche interferire con intensità di fluorescenza, noto come l&#39;effetto quenching 26.Inoltre, saggi enzimatici laboratorio ne valuta solo potenziali EEA in condizioni di laboratorio. Saggi in vitro misurano EEA in condizioni in cui la diffusione del substrato e abbondanza è limitativo. Pertanto, i dati forniti da questi test non può essere una buona proxy EEA sotto condizioni del terreno in situ 10. Nel complesso, l&#39;attività enzimatica è molto utile per i confronti relativi a quali tipi di suolo sono simili. Tuttavia, quando si utilizza questo metodo per confrontare le attività tra i terreni che si differenziano per caratteristiche fisiche o chimiche, deve essere usata cautela. Ciò è dovuto al fatto che le differenze di tipo di suolo e la temperatura possono drasticamente alterare lo stato di cinetica enzimatica in situ. Un&#39;altra limitazione è che relativamente pochi substrati sono disponibili in commercio (rispetto all&#39;ambiente naturale). Inoltre, i substrati sintetici utilizzati per saggi enzimatici sono relativamente semplici (facilmente solubile) può non rappresentare esattamente i substrati presenti o disponi suoloe in situ. Un altro fattore da considerare è che l&#39;utilizzo di fanghi di terreno di integrare l&#39;attività di alcuni enzimi stabilizzati (cioè immobilizzati da materia organica o argille) che non possono essere attivi in condizioni in situ 2. Saggi di laboratorio enzimatici inoltre non forniscono informazioni per quanto riguarda la persistenza degli enzimi nel suolo (tassi di turnover enzima) o informazioni riguardanti le specie microbiche specifiche che producono gli enzimi del suolo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents: </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#945;-D-glucopyranoside (AG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9766</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-glucopyranoside (BG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3633</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside (CB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6018</td>
			<td>Cellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2145</td>
			<td>Protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl N-acetyl-&#946;-D-glucosaminide (NAG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2133</td>
			<td>Chitin degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8883</td>
			<td>Phosphorus mineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl-&#946;-D-xylopyranoside (XYL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7008</td>
			<td>Hemicellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferone (MUB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-4-methylcoumarin (MUC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Sodium acetate anhydrous buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>acidic and neutral soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris base buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td>basic soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-65</td>
			<td>pipetting reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-684-265</td>
			<td>8-channel pipette, range: 50-1,200 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 101-1,250 &#956;l extended length natural tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1112 - 1720</td>
			<td>10 racks of 96 tips (960 tips)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-100SH</td>
			<td>Lab disc magnetic stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring blender</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-509-7P</td>
			<td>Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Dispensette III bottle-top dispensers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-688-231</td>
			<td>Dispenser; range: 5-50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Unispense &#956;P peristaltic pumps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683-7</td>
			<td>Optional dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1451363SIX</td>
			<td>Used to stirr soil slurry afer blending</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass bowls</td>
			<td>World Kitchen</td>
			<td>5304218</td>
			<td>Pyrex 10 oz rimmed custard cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well black solid plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-590</td>
			<td>Used for plate reader step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well assay blocks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-700</td>
			<td>V-bottom; 2 ml; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-387-93</td>
			<td>Sterile 96-well cap mat for square wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge equipped with holders for deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3121</td>
			<td>Centra-GP8 (this model is no longer available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30016058</td>
			<td>Plate reader (this model is no longer available)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities

Microbi nel suolo e altri ambienti producono enzimi extracellulari di depolimerizzano e idrolizzare macromolecole organiche in modo che possano essere assimilate di energia e sostanze nutritive. Misurazione del suolo microbica attività dell&#39;enzima è fondamentale per capire l&#39;ecosistema del suolo dinamiche funzionali. Il concetto generale del saggio di fluorescenza enzima che è sintetico C-, N-, o substrati ricchi di P legato con un colorante fluorescente vengono aggiunte a campioni di terreno. Quando intatto, i substrati marcati non reagiscono. L&#39;attività enzimatica è misurata come aumento della fluorescenza come i coloranti fluorescenti vengono scissi dalla loro substrati, che consente loro di fluorescenza. Misurazioni enzimatici possono essere espressi in unità di molarità o attività. Per eseguire questo test, fanghi di terreno vengono preparate combinando terreno con un tampone pH. Il tampone pH (tipicamente un acetato di sodio 50 mM o 50 mM di tampone Tris), viene scelto per particolare costante del tampone acido dissociazione (pKa) per abbinare meglio il sa suolomple pH. I fanghi di terreno vengono inoculati con una quantità non limitante di fluorescente (cioè C-, N-, o ricco-P) substrato. Utilizzo di fanghi sul suolo nel saggio serve a minimizzare limitazioni enzima e substrato diffusione. Pertanto, questo controlli del saggio per le differenze di limitazione del substrato, i tassi di diffusione, e le condizioni di pH del suolo; rilevamento così potenziali tassi di attività enzimatica in funzione della differenza di concentrazioni enzimatiche (per esempio). Saggi di fluorescenza enzimatici sono in genere più sensibili di spettrofotometriche (cioè colorimetrici) saggi, ma possono soffrire di disturbi causati da impurità e l&#39;instabilità di molti composti fluorescenti se esposti alla luce, in modo cautela è necessaria nel maneggiare substrati fluorescenti. Allo stesso modo, questo metodo valuta solo potenziali attività enzimatiche in condizioni di laboratorio, quando i substrati non sono limitanti. Deve essere usata cautela quando si interpretano i dati che rappresentano croceconfronto-sito con temperature diverse o tipi di suolo, come nel tipo di suolo in situ e la temperatura possono influenzare la cinetica enzimatica.

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High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Per misurare i potenziali tassi di suolo attività enzimatiche extracellulari, supporti sintetici che sono destinate a un colorante fluorescente sono aggiunte a campioni di terreno. L&#39;attività enzimatica è misurata come il colorante fluorescente viene rilasciato dal substrato mediante una reazione enzimatica catalizzata, se superiore fluorescenza indica più la degradazione del substrato.

High-throughput fluorometrica misura del potenziale di suolo extracellulari enzimi Attività

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Determinazione del microbica extracellulare Enzyme Activity in Acque, Suoli e sedimenti utilizzando High Throughput micropiastre saggi

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