Name: high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities
Uploaded: 2013-11-15T18:00:00
Duration: 12 min 33 s
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Esta publicação foi financiada pelo Enzimas no ambiente de pesquisa Coordenação de Pesquisa Rede apoiado pela Fundação Nacional de Ciência dos EUA (DEB # 1021559). Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciência EUA (DEB # 1021559), eo Departamento de Gabinete do Energia de Ciências (Biológicas e Pesquisa Ambiental) dos EUA. Quaisquer opiniões, descobertas e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade dos autores e não refletem necessariamente as opiniões do NSF dos EUA.

1. Ensaio Set-up <ol><li> Etiqueta 3 placas de poços profundos: &quot;Amostra&quot;, &quot;padrão MUB&quot; e &quot;padrão MUC&quot;. </li><li> Despeje cada padrão (MUB de 0, 2,5, 5, 10, 25, 50 e 100 mM) e do substrato (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) para, reservatórios limpos separados prelabeled (orientada em linhas) . </li><li> Pipetar o padrão MUB apropriado em poços correspondentes da placa MUB padrão (Tabela 1). <ol><li> Pipetar 200 mL de 0 mM MUB em linha A do MUB placa padrão. </li><li> Pipetar 200 mL de 2,5 mM MUB em linha B do MUB placa padrão. </li><li> Pipetar 200 mL de 5 mM MUB em linha C do MUB placa padrão. </li><li> Pipeta 200 mL de 10 mM MUB em linha D da placa MUB padrão. </li><li> Pipeta 200 mL de 25 mM MUB em linha E de placa MUB padrão. </li><li> Pipeta 200 mL de 50 mM MUB em linha F de placa MUB padrão. </li><li> Pipetar 200 l de 100 μM MUB em linha G de placa MUB padrão. </li><li> Repita os passos 1.3.1 - 1.3.8 para os padrões correspondentes MUC em poços da placa padrão MUC. </li></ol></li><li> Suspensões de solo Prep para cada amostra de solo. <ol><li> Pesar 2,75 g de campo solo úmido em liquidificador. </li><li> Adicionar 91 ml de tampão de 50 mM. Misture em alta por 1 min. </li><li> Despeje o conteúdo liquidificador em uma tigela de vidro limpo, pelo menos, tão grande como pipeta de 8 canais com uma barra de agitação. </li><li> Coloque em placa de agitação, misture pasta do solo em baixa. </li><li> Pipete 800 pi da suspensão de solo na primeira coluna da placa de amostra (Tabela 2). </li><li> Repita em 1 º de coluna padrão MUB e placas MUC-padrão (Tabela 1). </li><li> Enxágüe liquidificador, placa de agitação e mexa bar com DI H2O ou buffer entre amostras de solo. </li><li> Repita os passos 1.4.1 - 1.4.7) para cada amostra, movendo-se para a próxima coluna com cada subseqüente amostra de solo (Tabelas 1 e2). </li></ol></li><li> Pipetar o substrato adequado (neste exemplo, a 200 uM concentração) em correspondentes cavidades da placa de amostra (Tabela 2). <ol><li> Pipeta 200 mL de substrato BG em linha A da placa de amostra. </li><li> Pipeta 200 mL de substrato CB em linha B da placa de amostra. </li><li> Pipeta 200 mL de substrato NAG na linha C da placa de amostra. </li><li> Pipeta 200 mL de substrato PHOS em linha D da placa de amostra. </li><li> Pipeta 200 mL de substrato XYL em linha E da placa de amostra. </li><li> Pipeta 200 mL de substrato AG em linha F da placa de amostra. </li><li> Pipeta 200 mL de substrato LAP em linha G da placa de amostra. </li><li> Repita os passos 1.5.1 - 1.5.7 para cada placa de amostra temperatura de incubação. </li></ol></li></ol> 2. Incubação das placas de ensaio <ol><li> Selar as placas Deep-well (&quot;amostra&quot;, &quot;padrão MUB&quot; e &quot;padrão MUC4 ;) com esteiras de placa. </li><li> Inverta cada (selado) placa com a mão até que a solução é bem misturado (~ 10x). </li><li> Colocar as placas na incubadora apropriado para requerido período de tempo de incubação (Quadro 3). </li><li> Grave tempo inicial como hora 0. Registre também os tempos de incubação adequados para que você saiba quando remover a placa da incubadora (Tabela 3). </li><li> No final de cada período de incubação, centrifuga as placas vedadas de 3 min a ~ 2900 x g. </li><li> Após certificação, transferir 250 ul de cada poço das placas de poços profundos incubadas em poços correspondentes nas placas de 96 poços negras de fundo liso (uma placa preta será usado para cada poço profundo placa incubada). É importante para transferir as amostras a partir das placas de poços profundos incubadas nas mesmas cavidades (isto é, ... A1 A12, etc) nas placas de 96 cavidades de fundo plano negra (Tabela 1, 2). </li></ol> 3. Medições de fluorescência emum Fluorometer microplacas <ol><li> Seguindo as instruções do fabricante para o leitor de placa fluorimétrico usado, defina o comprimento de onda de excitação de 365 nm e comprimento de onda de emissão de 450 nm (ou usam filtros apropriados). </li><li> Leia as três placas no fluorímetro. Importante: amostras e placas padrão (ou seja, MUB ou MUC) deve ser lido com o mesmo ganho. <ol><li> Defina o espectrofotômetro de ganho automático e ler as placas MUC e MUB Standard. </li><li> Set ganho para manual, e diminuir o valor de ser ideal para o próximo número menor, arredondado para o mais próximo de cinco, por cada placa padrão. Repetir 2x para cada placa. </li><li> Definir o ganho para automático e executar a placa de Amostra. Executar novamente a placa da amostra manualmente para coincidir com o maior ganho para cada uma das placas standard (ou seja, MUB e MUC). </li></ol></li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> Digite os dados da curva de fluorescência padrão em planilha para MUB (Tabela 4a) E padrão MUC (Tabela 4b) <ol><li> Converter (mm) para as concentrações (mol) (Tabelas 4a e 4b). </li></ol></li><li> Para os dados de curva de fluorescência padrão de cada amostra, calcular o declive, intercepção y, e R 2 valores para MUB e MUC (ol) concentrações padrão. Aceitáveis ​​valores de R 2 deve exceder 0,98 para cada amostra (Tabelas 4a e 4b). Pode ser útil para visualizar as curvas padrão em um gráfico de dispersão, com as leituras de fluorescência representados como a variável dependente (eixo dos y) e a concentração padrão (ol) traçada como a variável independente (eixo dos xx) (Figura 1). </li><li> Você vai usar a inclinação da curva padrão MUB e MUC e valores-interceptar y para calcular o substrato dados de fluorescência matéria-amostra + em potenciais SEAE. Primeiro, você deve inserir os dados de fluorescência de amostras de substrato + brutos em uma nova planilha (Tabela 5a </strong&gt;). Você também vai precisar para entrar no tempo de incubação (h) e peso seco de solo para cada amostra (Tabela 5b). Note-se, os valores de tempo introduzidos neste exemplo são 3 horas, porque as amostras foram incubadas a 25 ° C (Tabela 3). <ol><li> Subtrair os valores de intercepção da curva padrão a partir dos correspondentes valores da fluorescência da amostra e, em seguida, dividir por o declive da curva padrão correspondente (Tabela 5C). Para conseguir isso, reorganizar equação de linha padrão para resolver para amostra concentração de enzima (x); x = (yb) / m em que: [y = amostra de fluorescência leitura em bruto; b = intercepção de MUB ou curva MUC Padrão; m = inclinação do MUB ou MUC curva padrão]. </li><li> Multiplique amostra mol, a partir do passo 4.3.1, por 91 ml (volume de tampão usado na lama do solo) (Tabela 5d). </li><li> Divide o valor obtido na etapa 4.3.2 pelo tempo de incubação específicos de amostra e massa seca do solo (Tabela 5-E): [amt enzima. (&amp; #956; mol) x 91 ml x incubação (h) x solo seco (g) x 0,8 x 1,000 ml] Nota: 0,8 ml é o volume de suspensão usada em cada poço, e 1,000 corrige a quantidade real do solo em cada poço. </li><li> Multiplique o valor obtido na etapa 4.3.3 por 1.000 para obter as unidades desejadas (atividade nmol / g solo seco / h) (Tabela 5-F). </li></ol></li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A medição baseado em laboratório de potenciais SEAE solo pode fornecer importantes insights sobre as respostas microbianas ao seu ambiente abiótico, e suas consequências para o funcionamento do ecossistema. Os resultados deste exemplo de conjunto de dados sugerem que existem diferenças mínimas na actividade enzimática do solo ou cinética entre os lotes de tratamento do clima. No entanto, as tendências inversas entre parcelas incentivar ainda mais a investigação de co-variáveis ​​que podem influenciar a produção do SEAE microbianas, tais como umidade do solo, pH do solo ou crescimento da planta. Em geral, a avaliação SEAE em termos de (1) EEE global em solos, (2) EEE estequiometria (3) energia gráficos de Arrhenius / activação, e (4) Q 10 proporciona um amplo espectro de abordagens que podem ser indicativos dos processos de nível ecossistema de que para caracterizar robustamente dinâmica funcional dos ecossistemas do solo. De alto rendimento ensaios AEA baseadas em fluorescência são uma ferramenta útil que é amplamente utilizado para examinar potenciais SEAE, nos solos eoutros ambientes. É importante ressaltar que as atividades potenciais reflete o tamanho do pool de enzimas, mas não por si só quantificar as taxas de produção ou volume de negócios de enzimas 46. Embora a técnica é relativamente simples, as diferenças aparentemente menores entre os protocolos de laboratório pode dificultar a comparabilidade dos resultados 13. Infelizmente, nós não possuímos controles positivos padronizados adequados para SEAE. O uso de razões estequiométricas é uma abordagem para superar esses desafios. Caso contrário, o advento das técnicas de alto rendimento tem avançado o estudo de enzimas no meio 4. Interpretação cuidadosa dos dados gerados por esses ensaios podem elucidar importantes tendências na atividade microbiana. A robustez do protocolo de deriva da capacidade de escolha para as condições específicas para amostras individuais, mas esta também pode resultar em limitações. Uma série de modificações será necessário para assegurar as amostras são medidas com precisão para<html> sites de campo individuais: Amortecedor O tampão de seleccionar dependerá do pH do solo. Buffer também estabiliza a intensidade de fluorescência dos padrões fluorescentes, que é altamente dependente do pH 27,47. O buffer de pH que normalmente usam para fazer a suspensão do solo é um acetato de sódio 50 mM Tris ou tampão que é escolhido para determinada constante de dissociação ácida do tampão (pKa) para melhor solo do jogo - os níveis de pH da amostra. O acetato de sódio tem um pKa de 4,76, e Tris tem um pKa de 8,06 de modo que os valores destes dois buffers irá variar, a fim de alcançar o desejado pKa para a amostra individual. Tampão de fosfato (pK = 7,2) tem sido sugerido para solos neutros / ligeiramente básicos. No entanto, alertamos para testar a variabilidade analítica em estudos preliminares antes de usar este buffer, como altas concentrações de fosfato pode interferir com a atividade da enzima. Manuseio e armazenamento de substratos fluorescentes jove_content &quot;&gt; ensaios de fluorescência pode sofrer interferência causada por impurezas e / ou instabilidade de muitos compostos fluorescentes quando expostos à luz, por isso é necessário cuidado ao manusear substratos fluorescentes. Recomendamos minimizando qualquer exposição à luz para substratos e MUB e padrões MUC fluorescente etiquetado . Usando garrafas de vidro âmbar ou cobrir o vidro e recipientes usados ​​para fazer e armazenar substratos e padrões fluorescentes é altamente recomendado; folha de alumínio para embrulhar copos e recipientes funciona bem Da mesma forma, a inoculação com eficiência placas e transferindo para incubadoras escuros é a melhor prática Recomendamos.. armazenar os substratos e padrões (-20 ° C) durante o período de dois meses (protegendo-os contra a luz), e substratos de descongelamento (5 ° C) ~ 24-48 h antes do início do ensaio (s) enzima. Projeto e replicação Para melhor conta para o bem de bem variações de amostra, implementando negative controlos do ensaio e (se possível) ensaio replica é recomendada. Variação ocorre tipicamente devido à diferenças na quantidade de partículas de terra em cada poço e os erros de pipetagem. Portanto, forte mistura e boa técnica de pipetagem irá minimizar substancialmente bem para bem variação. Além disso, sugerimos a implementação de um controle de teste negativo (solução tampão + substrato) para monitorar inconsistências substrato ao longo do tempo. Isto pode ser facilmente monitorizado durante a leitura das placas de enzimas por comparação poços de controlo negativo (que normalmente usar a última coluna sobre as placas de 96 poços). Controlos negativos substrato são tipicamente estáveis, portanto, o sinal aumenta bem acima do limite de detecção, é indicativo de contaminação ou instabilidade do substrato, exigindo a substituição do substrato e / ou soluções padrão. Para maximizar a taxa de transferência, o nosso protocolo inclui vários SEAE potenciais em um único poço profundo de microplacas, embora outros protocolos de realizar um tipo deensaio por placa (ou seja, um substrato por placa) uma vez que diferentes SEAE ocorrer em ritmos diferentes. Independentemente disso, a otimização da enzima deve ser realizado em solos antes de realizar esta alta ao longo abordagem ou a abordagem de chapa única. Vários substratos podem ser usadas numa única placa, se as velocidades de reacção são relativamente consistente para cada enzima durante o período de tempo de incubação. Nosso protocolo recomenda ~ 2,75 g de solo para tornar a solução em suspensão, enquanto ~ 1 grama é recomendado em outros protocolos 24. Nós sugerimos que o uso de mais de solo (se possível) é uma abordagem eficaz para melhor captura dentro amostra variação do solo em níveis de atividade de enzimas. Neste protocolo, incubar 800 mL de suspensão de solo com 200 mL de substrato, enquanto outros só incubar 200 mL de suspensão de solo com 50 ul de substratos. Isto é simplesmente uma função de ampliação de que, finalmente, não altera a atividade medido. Há também vantagens práticaspara o uso de volumes maiores. Um, é mais fácil para evitar partículas do solo, enquanto pipetando em placas de 96 poços de fundo plano negra antes de gravar intensidades no fluorómetro correspondente. Em segundo lugar, o volume adicional é útil no caso de derramamentos acidentais durante a transferência das placas de 96 poços negras de fundo plano para o fluorómetro antes da gravação intensidades de fluorescência relacionadas com enzima. Mesmo pequenos desvios no volume irá diminuir significativamente a fluorescência entre os poços. Por último, devido à alta taxa de transferência de natureza deste protocolo, que comumente eleger a contar com replicação experimental para representar a variação nos níveis de atividade de enzimas em vez de executar ensaio replica. É sempre melhor prática incluir repetições analíticas, mas na prática, sentimos nosso protocolo fornece uma troca equilibrada entre repetições analíticas e experimentais dados os recursos limitados. Da mesma forma, nossa abordagem utiliza solo relativamente mais bem homogeneizado (2,75 g) por ensaio 25, que são inerentesntly diminui no interior do solo variações. A decisão de usar repetições analíticas devem ser cuidadosamente considerados testando erro analítico em estudos preliminares 48. No entanto, recomendamos que os projetos experimentais com menos de 4 repetições de tratamento do grupo deve considerar fortemente usando ensaio repetições. Solo, Volumes de buffer e otimização de concentração do substrato O buffer relação solo: concentração do substrato é uma variável importante que influencia fortemente a fluorescência medida ao realizar ensaios enzimáticos. A quantidade de solo na lama adicionada a ensaiar ou a concentração de substrato pode necessitar de ser ajustada em função da actividade de enzimas na amostra de solo. Os valores selecionados para este exemplo foram baseadas em testes anteriores destes solos para garantir que a disponibilidade de substrato foi não limitativa, e que estávamos medindo as taxas máximas possíveis de acordo com as condições de ensaio (V max) 44,45. No entanto, para as amostras de solo que tem altas concentrações de enzimas, a quantidade de terra ou a concentração do substrato deve ser aumentada. Verificou-se que o aumento das concentrações de substrato (e ajustar a curva padrão correspondente) pode afectar a linearidade da curva. Portanto, recomendamos reduzir a quantidade de solo e / ou ajustes proporcionais de buffer volumes conforme necessário. Independentemente disso, é importante para otimizar a concentração de substrato para cada tipo de solo analisadas porque SEAE medidos podem diferir por uma ordem de magnitude maior entre as concentrações de substrato saturadas e sub-saturadas 26. Portanto as diferenças entre os tratamentos experimentais (etc.) são susceptíveis de tipo II erro estatístico e menos susceptível de ser detectado em condições de sub-saturação e o erro estatístico 27,35. Para optimizar as concentrações de substrato, ensaios preliminares de enzimas deveriam realizada em amostras representativas do solo utilizando uma ampla gama de concentrações de substrato. Depoisgravar a fluorescência, simplesmente graficamente os dados (de modo semelhante ao exemplo da curva padrão e a figura 1) para identificar a concentração de substrato (eixo x) que corresponde à actividade da enzima (eixo y), onde os níveis de inclinação de folga (~ 0). Da mesma forma, a concentração de substrato que corresponde ao ponto em que os níveis de declive fora (~ 0) é uma boa indicação da concentração de substrato ideal para que o solo em particular. Este ensaio mede a fluorescência em última análise, ao longo de um determinado tempo produzida pela porção fluorogénico que é clivada a partir do substrato como resultado da mediada por enzima substrato despolimerização. Portanto, o passo 5 (adição de substrato) é crítica e deve ser realizado de forma tão eficiente quanto possível, a fim de minimizar o tempo entre o momento em que o substrato é adicionado ao solo e em que os ensaios são incubadas. Da mesma forma, uma vez que o substrato entra em contacto com a amostra, reacções enzimáticas vai começar a ocorrer. Recomendamos a utilização de um sistema multi-canalpipeta por este motivo. É altamente recomendável para se tornar eficiente o uso da pipeta multi-canal antes do dia em que você está realizando seus ensaios enzimáticos. Para conseguir isso, você pode praticar pipeta com água até que você pode facilmente transferir volumes para as placas de 96 poços com sua pipeta. Solo Têmpera Têmpera refere-se a diminuição da intensidade de fluorescência causada por partículas e / ou material orgânico no solo lamas-incubações 26. A têmpera pode ser influenciada através do ajuste do solo: índices de amortecimento 25. Devido a fluorescência de fundo, a partir de amostras individuais, é crítico para executar padrões com amostras para contabilizar fundo (têmpera) da fluorescência. Apesar de alguns protocolos de usar uma única concentração depois de testar que o sinal é linear, recomendamos a implementação de um controle de têmpera padrão para cada amostra para melhor controle para os efeitos da extinção. Não fazer isso irá resultar em uma posiçãocurva ard não aplicável à amostra e uma estimativa incorreta da atividade enzimática. A adição de padrões para suspensões de solo não é sensível ao tempo, como a adição de um padrão não afecta a fluorescência de fundo da amostra. Adição de NaOH A adição de NaOH é utilizado em alguns protocolos a optimizar as medições da actividade da enzima fluorométricos porque o corante fluorescente libertado a partir dos substratos sintéticos exibe fluorescência pico a um pH&gt; 9,0 26,49. Ao considerar esta sugestão, a concentração de NaOH necessária para o pH da lama de solo (ou seja, a um pH&gt; 9) irá variar, dependendo do solo e em particular o pH usado 26. No entanto, outros argumentam que NaOH pode não ser necessário porque a intensidade do sinal é geralmente muito alta, mesmo com menor pH, e porque introduz uma fonte adicional de erro de medição. Por exemplo, o efeito da adição de NaOH no pH da lama e assim fluore MUB ou MUCscence alterações ao longo do tempo 25. MUB substratos ligados foram mostrados para demonstrar o aumento de fluorescência consistente durante 20 minutos após a incorporação de NaOH antes de níveis de cone, ao passo que MUC demonstrou constante diminuição da fluorescência para até 60 minutos 26. Portanto, é importante para padronizar o tempo entre a adição de NaOH e medição da fluorescência. Alternativamente, se os níveis de fluorescência são suficientemente detectável sem a adição, a realização de ensaios, sem adição de NaOH tem sido sugerida como uma alternativa igualmente aceitável 26. Temperatura Sensibilidade à temperatura deve ser levado em conta no momento de decidir a temperatura de incubação. Se o principal interesse é a compreensão cinética enzimática, utilizando três ou mais temperaturas, como ilustrado com gráficos de Arrhenius (na seção de resultados) é uma abordagem robusta. Se o site de exemplo tem caracteristicamente baixa temperatura, tais como solo permafrost, então o DURAÇÃOn de incubação pode ter de ser alargada para permitir que as enzimas reagem nas temperaturas de incubação mais baixas. Enquanto cinética enzimática tradicionais sugere que um aumento de temperatura deve resultar num aumento da actividade da enzima, verificou-se que as enzimas podem ser local específico em termos de sensibilidade à temperatura de 50. Portanto, para entender o potencial de atividade da enzima específica do site, é fundamental que a temperatura de incubação e duração ser ajustado para refletir os valores do site de campo. Conclusão EEs são fatores críticos de processos biogeoquímicos dos solos e, portanto, precisamos ser capazes de medir suas atividades. Há muitos desafios para medir SEAE, nos solos, incluindo interferência e inibição. Apesar destes desafios, protocolos padronizados (como a descrita aqui) pode ser universalmente aplicado para medir a SEAE para uma ampla gama de enzimas. Embora seja bastante fácil de gerar dados de qualidade seguindo estes protocolos, o eminterpretação destes dados em um contexto ecológico exige uma análise cuidadosa do que esses ensaios são realmente medir e como SEAE em condições de ensaio podem ser diferentes daqueles em condições in situ.

Enzimas extracelulares (EEE) produzidos por bactérias do solo, fungos e archaea estão envolvidos em inúmeros processos biogeoquímicos, e são fundamentais para o processamento, estabilização e desestabilização da matéria orgânica do solo e ciclagem de nutrientes em ecossistemas terrestres 1. Ao produzir EEE, os micróbios do solo decompor e transformar a matéria orgânica polimérica em moléculas solúveis menores, libertando assim previamente ligados micro e macronutrientes, o que permite que as plantas e micróbios para assimilar os nutrientes disponíveis no solo. EEs têm sido estudados ao longo de décadas, principalmente através da medição das suas actividades em ensaios laboratoriais, de 2-4, uma vez que é muito difícil de detectar e quantificar directamente enzimas. Actividade da enzima extracelular (EEE) é mais fortemente controlada pela concentração de enzimas e os substratos correspondentes. A abundância de diferentes relações C-, P-enzimas degradantes em solos N-, e é controlado por vários factores including biomassa microbiana, composição da comunidade, a disponibilidade de substrato, microclima e demandas estequiométrico 5,6. No entanto, em SEAE in situ dentro do ambiente do solo, também são afectadas pela temperatura 7,8, a ligação de enzimas de argilas e propriedades do solo húmicas 2, e limitações de difusão 9, que em última instância regulam a piscina de enzima activa, em termos de tamanho, a disponibilidade do substrato , e as taxas de rotatividade 10-12. Portanto, reconhecendo em condições de solo in situ é fundamental quando se utiliza ensaios enzimáticos laboratório para interpretar função microbiana do solo em diferentes sites ambientais. Muitas classes diferentes de EEE pode ser quantificado em ensaios de laboratório, usando uma variedade de substratos sintéticos (por favor consulte a &quot;Lista de Reagentes Table&quot; para mais detalhes). Alguns protocolos utilizam substratos em ensaios que são acoplados a uma reacção colorimétrica, que pode ser detectada com um espectrofotómetro, woutros hile, incluindo o protocolo, descrevemos aqui, utilizar substratos que estão vinculados a uma porção fluorescente. Os ensaios de fluorescência de EE são geralmente mais sensíveis (por uma ordem de grandeza) do que os ensaios colorimétricos (que utilizam uma porção cromogénico ligada com um substrato sintético) 12-14. Sensibilidade na detecção EEE inclui dois aspectos: um está relacionado com a quantidade do composto de interesse detectados e outra relacionada com a atividade da enzima detectável menor potencial. Métodos para colorimétrico P-nitrofenol ensaios baseados em (PNP) pode ser encontrado no passado funciona 15,16. Em breve, o solo (tipicamente peneirados para &lt;2 mm e secou-se ao ar) é incubado a uma temperatura e pH ideal ou relevantes para o campo. A taxa à qual o produto de reacção libertado é determinada colorimetricamente com um espectrofotômetro 14. A maior sensibilidade dos ensaios de fluorescência da enzima é devido, em parte, para a detecção mais sensível do separação porção fluorogénico associada com substrComeram a degradação em vez de absorvância a gravação após a separação de uma porção cromogénico específico para um comprimento de onda específico. Os dois indicadores fluorescentes sintéticos mais vulgarmente utilizados são 4-metilumbeliferona (MUB) 17 e 7-amino-4-metilcumarina (MUC) 18,19. Substratos MUC-ligados estão normalmente associados com N-ricos substratos sintéticos, tais como proteínas e / ou aminoácidos. Técnicas fluorescentes foram inicialmente desenvolvidos para amostras aquáticos 20,21, e sua aplicação em solos requer controles para têmpera e interferência 22,23 sinal. Ensaios podem ser conduzidas utilizando tradicional &quot;bancada&quot; química com grandes volumes, ou pode ser empregado em protocolos de microplacas, com o aumento da taxa de transferência, mas possivelmente erro de medição superior. Embora existam vários protocolos amplamente citados para a detecção fluorescente da SEAE em solos 24, muitos laboratórios empregam variações sutis sobre estes protocolos, muitas vezes, inadvertidamente ou devido a diferenças em equipamentos de laboratório ou reagentes. Aparentemente pequenas diferenças nos detalhes de protocolos pode afetar fortemente medido SEAE 25,26 ea falta de enzimas padronizados torna-se um desafio para calibrar os ensaios entre diferentes laboratórios. Assim, há uma necessidade importante para a divulgação dos protocolos detalhados para incentivar a padronização dos ensaios do EEE. No nosso protocolo, as amostras de solo são preparadas através da combinação de amostras de solo com um tampão de pH e homogeneizando com um misturador. As lamas são então inoculados com uma quantidade não limitativa de marcado por fluorescência-C, N-, ou um substrato rico em P, escolhidos de acordo com a pergunta de pesquisa específico de interesse. Utilizando suspensões de solo nos ensaios de enzima serve como um controlo para minimizar as limitações de difusão de substrato. As porções fluorescentes são extinta até que eles são cortados a partir dos respectivos substratos, e, assim, a actividade da enzima pode ser detectada como o corante fluorescente é libertado do substrato by de uma reacção catalisada por enzima. O aumento da intensidade de fluorescência ao longo do tempo reflecte a velocidade da reacção catalisada pela enzima. O conceito geral do ensaio da enzima de fluorescência é que os substratos sintéticos ligados com uma porção fluorogénico (corante fluorescente), são adicionadas a amostras de solo 27. Durante a degradação de substrato catalisada por enzima, a ligação de quebra entre o corante fluorescente e o substrato. O corante fluorescente libertado do substrato é, por conseguinte, utilizada como uma avaliação indirecta da actividade da enzima, e pode ser quantificada utilizando um leitor de microplacas para detectar a intensidade de fluorescência do corante. Em breve, a fluorescência quantificação é realizada como o corante libertado emite luz de um comprimento de onda, depois da absorção de luz de um comprimento de onda diferente. A intensidade de fluorescência é registada por um leitor de placas capaz de tanto de excitação e detecção. A atividade da enzima pode ser posteriormente quantificada com base no conhecido conce-corante fluorescententrations do substrato (ou seja, quantidades conhecidas de substrato sintético adicionado a amostras de solo), juntamente com a referência a uma curva de diluição padrão de intensidade de fluorescência para o radical fluorogénico específicos do substrato utilizado no ensaio (ou seja, 4-metilumbeliferona (MUB) ou 7-amino -4-metilcumarina (MUC)). (Por favor, consulte a seção de protocolo para obter detalhes específicos sobre a atividade da enzima quantificação). Ensaios enzimáticos solo laboratório são úteis para avaliar a função da comunidade microbiana, mas existem várias limitações técnicas que os usuários devem reconhecer 10. Os ensaios de fluorescência pode sofrer interferência causada por impurezas e / ou instabilidade de muitos compostos fluorescentes quando expostos à luz, de modo que é necessário ter cuidado no manuseamento de substratos fluorescentes 25. As partículas de solo e / ou material orgânico nas suspensões de solo também pode interferir com intensidades de fluorescência, conhecido como o efeito de extinção 26.Além disso, ensaios enzimáticos laboratório só avalia potenciais SEAE em condições de laboratório. Ensaios in vitro medir SEAE em condições onde a difusão do substrato e abundância é limitativos. Portanto, os dados fornecidos por estes ensaios pode não ser uma boa proxy para o SEAE sob em condições de solo in situ 10. No geral, a atividade enzimática é muito útil para comparações relativas em que os tipos de solo são semelhantes. No entanto, quando se utiliza este método para comparar as actividades entre solos que diferem nas propriedades físicas ou químicas, deve ser tomada precaução. Isto é devido ao facto de as diferenças no tipo e temperatura do solo pode alterar drasticamente o estado de cinética da enzima in situ. Outra limitação é que relativamente poucas substratos estão comercialmente disponíveis (em comparação com o ambiente natural). Além disso, os substratos sintéticos utilizados para ensaios enzimáticos são relativamente simples (facilmente solúvel) pode não representar com precisão os substratos solo presentes ou available in situ. Outro fator a considerar é que o uso de suspensões de solo irá incorporar a atividade de algumas enzimas estabilizados (ou seja, imobilizadas por matéria orgânica ou argila) que podem não estar ativo em condição in situ 2. Ensaios enzimáticos Laboratório também não fornecer informações sobre a persistência de enzimas no solo (taxas de rotatividade enzima) ou informações sobre as espécies microbianas específicas que estão produzindo enzimas de solo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents: </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#945;-D-glucopyranoside (AG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9766</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-glucopyranoside (BG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3633</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside (CB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6018</td>
			<td>Cellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2145</td>
			<td>Protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl N-acetyl-&#946;-D-glucosaminide (NAG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2133</td>
			<td>Chitin degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8883</td>
			<td>Phosphorus mineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl-&#946;-D-xylopyranoside (XYL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7008</td>
			<td>Hemicellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferone (MUB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-4-methylcoumarin (MUC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Sodium acetate anhydrous buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>acidic and neutral soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris base buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td>basic soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-65</td>
			<td>pipetting reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-684-265</td>
			<td>8-channel pipette, range: 50-1,200 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 101-1,250 &#956;l extended length natural tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1112 - 1720</td>
			<td>10 racks of 96 tips (960 tips)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-100SH</td>
			<td>Lab disc magnetic stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring blender</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-509-7P</td>
			<td>Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Dispensette III bottle-top dispensers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-688-231</td>
			<td>Dispenser; range: 5-50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Unispense &#956;P peristaltic pumps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683-7</td>
			<td>Optional dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1451363SIX</td>
			<td>Used to stirr soil slurry afer blending</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass bowls</td>
			<td>World Kitchen</td>
			<td>5304218</td>
			<td>Pyrex 10 oz rimmed custard cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well black solid plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-590</td>
			<td>Used for plate reader step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well assay blocks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-700</td>
			<td>V-bottom; 2 ml; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-387-93</td>
			<td>Sterile 96-well cap mat for square wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge equipped with holders for deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3121</td>
			<td>Centra-GP8 (this model is no longer available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30016058</td>
			<td>Plate reader (this model is no longer available)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities

Micróbios em solos e outros ambientes de produzir enzimas extracelulares para despolimerizar e hidrolisar macromoléculas orgânicas, para que possam ser assimilados por energia e nutrientes. Medindo a atividade enzimática microbiana do solo é crucial para a compreensão da dinâmica funcional do ecossistema do solo. O conceito geral do ensaio da enzima de fluorescência é que a C-, N-sintética, ou substratos ricos em P ligados a um corante fluorescente são adicionados às amostras de solo. Quando intacta, os substratos marcados não fluoresce. A actividade enzimática é medida como o aumento na fluorescência dos corantes fluorescentes que são clivados dos seus substratos, o que lhes permite fluorescência. Medições de enzima pode ser expresso em unidades de molar idade ou actividade. Para realizar este ensaio, suspensões de solo são preparadas por combinação do solo com um tampão de pH. O tampão de pH (tipicamente, um acetato de sódio 50 mM ou 50 mM de tampão Tris), é escolhido para especial constante do tampão de dissociação de ácido (pKa) de melhor corresponder ao solo sapH mple. As suspensões de solo são inoculadas com uma quantidade não limitativa de marcado por fluorescência (por exemplo C-, N-, ou ricas em P) substrato. Utilizando suspensões de solo no ensaio serve para minimizar as limitações de enzima e substrato de difusão. Portanto, este controles de análise para as diferenças de limitação de substrato, taxas de difusão e condições de pH do solo; detectando, assim, potenciais taxas de atividade enzimática em função da diferença de concentração de enzimas (por amostra). Os ensaios enzimáticos de fluorescência são tipicamente mais sensível do que espectrofotométricos (isto é, ensaios colorimétricos), mas pode sofrer de interferências causadas por impurezas e instabilidade de muitos compostos fluorescentes quando expostos à luz, por isso é necessário ter cuidado no manuseamento de substratos fluorescentes. Da mesma forma, este método só avalia as atividades potenciais de enzimas em condições de laboratório, quando os substratos não são limitantes. O cuidado deve ser usado na interpretação dos dados que representa cruz-Site comparações com diferentes temperaturas ou tipos de solo, como in situ tipo e temperatura do solo pode influenciar a cinética enzimática.

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High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Para medir as taxas potenciais de atividade das enzimas extracelulares de solo, substratos sintéticos que são obrigados a um corante fluorescente são adicionados a amostras de solo. A actividade enzimática é medida como o corante fluorescente é libertado do substrato por meio de uma reacção catalisada por enzimas, onde mais elevado de fluorescência indica mais a degradação do substrato.

De alta capacidade Fluorometric Medição do Potencial dos Solos extracelulares atividades enzimáticas

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

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Ambiente

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