Name: use of galleria mellonella as a model organism to study legionella pneumophila infection
Uploaded: 2013-11-22T14:00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection at JoVE.com

CR הרדינג נתמכה על ידי מלגת לימודי WT086724 Wellcome Trust.

יש המחברים אין לחשוף.

מודל זחל mellonella הגלריה לזיהום הלגיונלה pneumophila הוא כלי שימושי עבור במחקרי vivo של פתוגנזה. כאן הוא הראה כי מספר ההיבטים של זיהום מקרופאג יכול להיות סכם בג מודל mellonella, כולל התפקיד של T4BSS דוט / ICM בארסיות ושכפול חיידקים והלוקליזציה של דוט / ICM-מפעיל SidC. בנוסף, אנו מדגימים כי מעכבי כימיים של פילמור אקטין מפחית באופן משמעותי את תמותת זחל, מחקה תוצאות שהתקבלו בmacophages 47 וראיות תומכות שהפנמה של החיידקים נדרשה לגרום לתמותת זחל. בעבר, זה כבר הוכיח כי הווריאציות בארסיות בין L. זני pneumophila ראו במודלים של זיהום אחרים ניתן לאמת בג mellonella ואינדוקציה של גורמים ארסי בשלב צמיחת פוסט מעריכי נדרשים לארסי חיידקים <sup&gt; 36, המאשר כי ג mellonella הוא מודל מתאים לL. זיהום pneumophila. קביעת CFU של L. pneumophila מזחלים נגוע גם ביחידים או בזיהומים מעורבים מגדיל מאוד את התועלת של המודל. בעבר, מספר גורמים כבר גילו שיש להם השפעות עדינות על שכפול חיידקים במודלים של אחד או יותר של זיהום 29,48-51. למרות שהזחלים אינם בעלי מערכת חיסונית אדפטיבית, הנוכחות של התגובה החיסונית המולדת מספקת מבחר חזק יותר בהשוואה למקרופאגים לבד, אשר עשוי לשמש כדי להגביר פנוטיפים עדינים. לכן, לא מן הנמנע כי, בעוד זנים אלה כנראה לא משפיעים על תמותת זחל באופן משמעותי, הם עשויים להפגין ירידת שכפול או כושר חיידקים בג מודל mellonella. כמו גם שכפול של L. pneumophila בזחלים, הראינו דלדול hemocyte משמעותי בשלב מאוחר בזיהום. כL.pneumophila צפוי lyse תאי מארח בסוף מחזור השכפול שלו, מדידת דלדול hemocyte גם יכול לשמש כמדידה עקיפה של שכפול בקטריאלי. דלדול Hemocyte כבר בעבר בקורלציה עם תמותת חרקים בזיהום 3,52, למרות התוצאות האחרונות מצביעות על כך שהתמונה הזאת היא יותר מורכבת מbelived 37 ראשון. לאחרונה, זה כבר הראה כי רעב של זחלים גורם לרגישות מוגברת לזיהום דרך דיכוי תגובות חיסוניים 53. במבחנים שתוארו כאן, זחלים לא האכילו במשך תקופת המחקר ולא ידוע כמה טוב זחלי הפד יגיבו לL. זיהום pneumophila. אחד היתרונות של ג mellonella כאורגניזם מודל הוא הקלות של מיצוי וכימות של hemocytes מזחלים נגועים. קטעי וידאו קודמים הראו שיטות שונות לhemocytes חילוץ מחרקים 54,55 לעומת זאת, פגשוהוד שהוצג כאן הוא פשוט ומתאים לעיבוד מיידי. חולצו ברגע, hemocytes ניתן לכמת בקלות, המשמש לimmunofluorescence, מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים 36 או cytometry זרימה 56 או מתורבת ונגוע לשעבר vivo 3 המאפשר את התגובה של התאים לזיהום להיחקר בפירוט. זה מגדיל באופן משמעותי את הגמישות של המודל. אזהרה אחת לImmunofluorescence בג mellonella הוא ההיצע המוגבל של נוגדנים תוקף נגד G. חלבוני mellonella. עם זאת, מחקרים הוכיחו את יצירת נוגדנים נגד חלבוני זחל 57 ונוגדנים כנגד חלבונים חיסוניים הקשורים אדם נמצאו להכיר G. חלבוני mellonella 11 מדגימים את הפוטנציאל לimmunofluorescence על G. hemocytes mellonella. קלות G. זיהום mellonella מאפשר למסכים מהירים, בינוניים תפוקה שיכוליםלהשתמש בהם כדי להשוות את הארסיות של מיני הלגיונלה שונים וזנים ויכולים לשמש כדי לנתח עוד גורמים ארסי זוהו בעבר כגון מולקולות הדבקות 58 או מערכת מהסוג 2 ההפרשה 59 אשר נדרשות לארסיות בדגמים אחרים. בנוסף, שימוש במודל זה יאפשר זיהוי ואפיון נוסף של גורמים ארסי רומן כוללים חלבונים מופרשים מפעיל וtranslocated. לאחרונה, זה כבר הראה כי פעילות C פוספוליפאז של L. יש pneumophila תפקיד בג ארסיות mellonella 60 וכי חלבון מפעיל דוט / ICM SdhA נדרש לארסיות 37. בנוסף, יש לנו הוכיחו לאחרונה כי קיים מתאם בין פנוטיפים נצפו בג mellonella ובזן העכבר / J 37. זה מדגיש את הערך של כלי זה כדי להשלים protozoan סביבתית ומארח וmuri חד תאייםמודלים זיהום ne. ג מודל mellonella יהיה עוד יותר יקר בעתיד, לאחר שהרצף הגנומי הזחל יהיה זמין וכלים גנטיים יותר מבוססים. צעדים בכיוון זה כוללים את הפרסום האחרון המפרט את transcriptome הקשורות לחיסון 61 וההיווצרות של יוזמה לקידום להשתקת גנים בspp הפרפרים 62. באמצעות ג זחלי mellonella, יש לנו מספר הקריאות פשוטות, מהירה של ארסי חיידקים שיכולים לשמש כדי לחקור פתוגנזה של L. pneumophila. הקמתה של מבחני אלה והקרנה רחבה יותר של L. זני pneumophila וserogroups יגדילו את התועלת של הכלי החדש הזה ויתרמו להבנה שלנו ל &#39; פתוגנזה pneumophila.

מודלים של בעלי החיים של זיהום הוכיחו לא יסולא בפז בקביעת גורמים ארסי חיידקים. עם זאת, מודלים של חסרי חוליות שזכו לתשומת לב מוגברת כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים של זיהום. הזחלים של עש השעווה, הוא יותר ויותר משמשים mellonella Galleria ללמוד מספר פתוגנים אנושיים חשובים, ובם חיידקים גראם חיוביים 1 וגראם שליליים 2,3 וכמה פטריות פתוגניים 4,5. באמצעות מודל חרקים יש מספר היתרונות על פני דגמים של יונקים מסורתיים, כחוליות, ג mellonella אינו כפוף למגבלות האתיות של מודלים של יונקים. בנוסף, ניתן לשמור את הזחלים בקלות, נגועים בהזרקה ללא הרדמה, לעבור טיפול מקדים עם מעכבים כימיים 6 ולקיים דגירה על 37 C ° 7. מעניין לציין, כי קשר טוב בין פתוגניות של כמה מיקרואורגניזמים בג מלlonella ומודלים של יונקים של זיהום כבר נקבעו 2,8. ההבנה המוגברת של המערכת החיסונית של ג mellonella גם סייע באפיון של אורגניזם מודל זה. למרות שאין לי חרקים מערכת חיסונית אדפטיבית כפי שנמצאו ביונקים, יש לי ההגנות סלולריות וההומרוס מתוחכמים הכוללים הייצור של פפטידים מיקרוביאלית 9 שהם. Hemocytes הוא המתווך העיקרי של ההגנות סלולריות והוא סוג התא רב ביותר נמצא בhemolymph (או בדם) של ג mellonella 10, תאים אלה הם phagocytes המקצועי ולבצע פעולות דומות למקרופאגים ונויטרופילים אדם על ידי שני תופסים ומשפילים חיידקים בתא phago-lysosomal 10,11 ויוצרים גושים סביב חיידקים פולשים, המגבילים את שכפול חיידקי 12 פיזי. הלגיונלה pneumophila הוא הפתוגן בדרכי הנשימה שגורם pneumoni החמור(מחלת הליגיונרים) באוכלוסיות רגישות כגון קשישים או מדוכאי חיסון 13. הלגיונלה נמצאת כל מקום בגוף במקורות מים הן סביבתיים ומעשה ידי אדם, שבו הוא הפתוגן של מינים שונים של אמבות מים מתוקים 14,15. הלגיונלה שורדת ו משכפל בתוך phagocytes המקצועי אלה על ידי שימוש בקומפלקס רב חלבון המכונה Dot / ICM (פגום בסחר אברון כפל תאיים /) הקלד מערכת 4 הפרשה (T4SS) לtranslocate מעל 275 חלבוני מפעיל לתא המארח 16-20. חלבונים אלו משמשים לערער את מסלולי phagocytic התא מארח הרגילים, מה שמוביל ליצירתו של הלגיונלה המכיל vacuole (LCV). LCV מונע התמזגות עם lysosomes ובמקום מגייס reticulum endoplasmic (ER) שמקורם בשלפוחית, וכתוצאה מתא מיוחד שדומה ER מחוספס 21,22. L. pneumophila נחשב נתיב אדם בשוגגעוגן; את אותן אסטרטגיות שתאפשרנה לה לשכפל בתוך אמבות, גם לאפשר שכפול במקרופאגים מכתשיים אדם 23. מארחים של יונקים היו מאופיינים כמודלים לזיהום הלגיונלה אדם כוללים עכברים וחזירי ים 24,25. עם זאת, הרוב המכריע של זני עכבר עמיד לזיהום הלגיונלה 26 למעט העכבר המולד בקן / J, מפתחת זיהום 24 מתון, מעצמם. למרות שמודל שפן הניסיונות דומה יותר למחלות בבני אדם 25, חוסר מוטנטים והתייקרות מרתיעה את השימוש בם 27. בנוסף, מספר דגמים חסרי חוליות פותחו עבור זיהום הלגיונלה pneumophila כולל Caenorhabditis elegans 28, דרוזופילה melanogaster 29 וכמה מינים של אמבות 30-32. עם זאת, יש מודלים אלה חולשות, ארסיות בג elegans </em&gt; המערכת אינה דוט / ICM תלוי 28, להגביל את השירות של מודל זה. מודל דרוזופילה הוכיח עצם כיעיל בחקירה ארסית חיידקי גורמי 29 ונראה מבטיח עם זאת, מודל זה לא מאופיין במלואו. אמבות חד תאיות הם המארחים הסביבתיים של L. pneumophila והם אידיאליים לחקירת הפעולה של גורמים ארסי ברמה מולקולרית 33 עם זאת חסרים כמה מתווכים חשובים של תגובת התא המארח של יונקים לזיהום כגון caspases 34. החולשות של המודלים קיימים, יחד עם העלות הגבוהה ודאגות אתיות הקשורות לניסויים יונקים, הובילו לחיפוש אחר אורגניזמים מודל מתאימים אחרים 29,35. אנחנו הוכיחו לאחרונה כי ג mellonella הוא מודל מתאים לL. pneumophila פתוגנזה 36,37. פרוטוקול זה מפרט את ניסיוני בטכניקות המשמשות ללהדביקing G. זחלי mellonella, ניתוח מוסר זחל, חילוץ hemocytes לספירה וimmunofluorescence וקביעת שכפול על ידי CFU קיימא סופרים מזחלים נגועים.

<table border="1">
 <tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material/ Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ACES yeast extract (AYE) broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g &alpha;-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* 
		 *add sterile ingredients after autoclaving</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6526 </td>
			<td>0.6 mM solution, sterile filtered</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile cysteine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td>3.3 mM solution, sterile filtered</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>G. mellonella (waxworms)</td>
			<td>Livefood UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9037</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Legionella LPS</td>
			<td>Cambridge Biosciences</td>
			<td>PA1-7227 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG Alexa488</td>
			<td>Jackson Immunoreach</td>
			<td>711-485-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1026</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Biomol International</td>
			<td>BML-T109-0001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td>[header]</td>
 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microtiter Syringe</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24544</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell counter, double, Improved Neubauer </td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0926</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For centrifuging plates </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For viable cell counting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puncture-proof glove</td>
			<td>Turtleskin </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
 </tbody>
 </table>

use of galleria mellonella as a model organism to study legionella pneumophila infection

הלגיונלה pneumophila, הסוכן סיבתי של דלקת ריאות חמורות בשם מחלת הליגיונרים, הוא הפתוגן אנושי חשוב שמדביק ומשכפל בתוך מקרופאגים מכתשיים. הארסיות שלה תלויה במערכת דוט / ICM הפרשת הסוג IV (T4SS), שהוא חיוני להקמת vacuole מתירנית שכפול המכונה הלגיונלה המכיל vacuole (LCV). L. זיהום pneumophila יכול להיות מודל בעכברי אולם רוב זני עכבר אינם מתירנית, מה שמוביל לחיפוש אחר מודלים זיהום רומן. הראינו לאחרונה כי הזחלים של mellonella Galleria עש השעווה מתאימים לחקירתו של ל &#39; זיהום pneumophila. ג mellonella משמש יותר ויותר כמודל זיהום לפתוגנים אנושיים ומתאם טוב בין הארסיות של כמה מיני חיידקים בחרקים ובמודלים של יונקים. מרכיב מרכזי של ההגנה החיסונית של הזחלים הוא hemocytes, מקצועphagocytes אל, אשר תופס ולהשמיד פולשים. L. pneumophila הוא מסוגל להדביק, בצורת LCV ולשכפל בתוך תאים אלה. כאן אנו מדגימים פרוטוקולים לניתוח ל &#39; ארסיות pneumophila בג מודל mellonella, כולל איך לגדל L. זיהומיות pneumophila, pretreat הזחלים עם מעכבים, להדביק את הזחלים וכיצד לחלץ תאים נגועים לכימות ומיקרוסקופיה immunofluorescence. אנו גם מתארים כיצד לכמת שכפול וכושר חיידקים במבחני תחרות. גישות אלו מאפשרות הסינון המהיר של מוטציות כדי לקבוע גורמים חשובים בL. ארסיות pneumophila, המתארת ​​את כלי חדש כדי לסייע להבנה של הפתוגן המורכב זו שלנו.

הנה הוא הוכיח כי ג mellonella הוא מודל מתאים, קל לשימוש ללימודי L. זיהום pneumophila. בעבר זה כבר הראה כי L. ארסיות pneumophila במקרופאגים, אמבות ומודלים של יונקים תלויה בנוכחות של מערכת הפרשת דוט / ICM 41-43. ג זחלי mellonella נדבקו כפי שתוארו לעיל והארסיות של הסוג בר (WT) ומתח דוט / ICM לקוי בהשוואה. זיהום עם 10 7 CFU של L. 130b מתח pneumophila הביא לתמותת 100% בתוך 24 הודעה hr זיהום (PI). עם זאת, ל &#39; זן pneumophila Δ Dota, שאין לה מערכת הפרשת דוט / ICM T4SS פונקציונלית, היה לא אלים בassay זה (איור 1). זה מוכיח כי ל &#39; ארסיות pneumophila בג mellonella תלויה בטרנסלוקציה של effectors דוט / ICM, מה שהופך את המודל הזה מתאים לאפיון שלתפקודם של החלבונים האלה. לאחרונה, זה היה הראה כי עיכוב של phagocytosis על ידי טיפול cytochalasin מוגבר susceptibly של הזחלים לזיהום על ידי קנדידה אלביקנס שמרים 6. כL. pneumophila הוא פתוגן תאיים, הוחלט לקבוע אם ספיגה של החיידקים היא מכרעת בפתוגנזה שלה במודל זה. הזחלים טופלו קודם לכן ב10 μl של 100 מיקרומטר Cytochalasin D (סיד) במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס, אז נדבק ב10 7 CFU של WT ל 130b pneumophila והתמותה במעקב ב24 טיפול pi שעה עם המעכב לבד לא השפיעו על הישרדות זחל. עם זאת, זחלי pretreated, נגועים מוצג הישרדות גבוהה יותר באופן משמעותי (P = 0.0066, מבחן t מזווג) בהשוואה ל, חרקים נגועים טופלו DMSO (איור 2). ההשפעה של טיפול סיד בוטלה על ידי pi 48 שעה (תוצאות לא מוצגות), זה יכול להיות בגלל זמן מחצית החיים של התרופה בגmellonella. זה מוכיח שספיגתו של ל &#39; pneumophila לג hemocytes mellonella הוא היבט חיוני של ארסיות בקטריאלי. על מנת לאמת את הביטוי ולקבוע את לוקליזציה subcellular של חלבון מפעיל בג mellonella, hemocytes הופק ועובד למיקרוסקופיה immunofluorescence. זחלים היו נגועים בWT וΔ Dota ל 130b pneumophila לבטא שבר של מפעיל המוגדר היטב T4SS, SidC 41-918, התמזגו 4 תגי HA N-מסוף. מפעיל זה הודגם להיקשר LCV באמצעות תחום phosphoinositide-4-מחייב פוספט 44. שימוש באנטי HA (אדום) ואנטי הלגיונלה נוגדנים (ירוקים), 4HA-SidC 41-918 מקומי לLCV בhemocytes הנגוע (איור 3). לוקליזציה זו יש בעבר הוכח בdiscoideum האמבות Dictyostelium ובמקרופאגים יונקים 44,45 מאשרים את גomparability של מודל זה. החשיבות של חלבונים לארסיות נקבעה בדרך כלל על ידי השוואת קינטיקה הצמיחה של סוג בר וחיידקים שעברו מוטציה. על מנת לעקוב קינטיקה שכפול החיידקים במהלך הזיהום, שלושה זחלים הוקרבו בכל נקודת זמן (0, 5, 18, ו24 pi hr), hemolymph שנאסף ונקווה וCFU/0.1g של hemolymph חולץ נקבע. לאחר טבילה ראשונית ב5 pi שעה, CFU של חיידקי WT מגדילה עד 24 pi שעה לעומת זאת, מתח Δ Dota עובר שום שכפול ומנוקה ב18 pi שעה (איור 4). היכולת של L. pneumophila לגרום תמוגה של מקרופאגים באופן T4SS תלוי תועד ארוך 46, עם זאת אין מחקרים דומים בוצעו in vivo. הריכוז של hemocytes במחזור נקבע בבית 5, 18, ו24 pi שעה זחלים היו נגועים בWT או Δ <eמ &#39;&gt; 130b pneumophila Dota ל&#39;, hemocytes מופק חרקים נגועים ותאי קיימא נספרים בשיטת הרחקת trypan הכחולה. בשעת 5 pi שעה אין הבדל בספירת hemocyte בין הזנים ניתן היה לראות (איור 5). עם זאת, ב18 pi שעה חלה ירידה משמעותית בריכוז hemocyte ב WT, אבל לא Δ Dota, זחלים נגועים. הבדל זה נמשך ב24 pi שעה הירידה במספר hemocyte, בשילוב עם הנוכחות של חיידקים תאיים כפי שניתן לראות על ידי immunofluorescence, עולה כי ל &#39; pneumophila משכפל בתוך hemocytes אז lyses, ומאפשר לחיידקים לעבור כמה סיבובים של שכפול. <img alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig1.jpg" /> איור 1. זיהום עם L. pneumophila גורם דוט / ICM תלוי תמותת זחל. 10 זחלים היו נגועים עם PBS לבד או 10 <sעד&gt; 7 CFU של סוג בר (WT) או 130b pneumophila Δ Dota ל &#39;, טופח על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 72 וזמן מוות של הזחלים שנרשמו. כל הזחלים נגועים בWT נכנעו לזיהום תוך 24 הודעה hr זיהום (PI), עם זאת אין תמותה הייתה לראות בזחלים מחוסן עם PBS לבד או זן Δ Dota. תוצאות הן הממוצעים של שלושה ניסויים נפרדים, ± סטיית תקן. <img alt="איור 2" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig2.jpg" /> איור 2. תמותה היא תלויה בהפנמת חיידקים. 10 L. pneumophila זחלים טופלו קודם לכן ב10 μl של 100 מיקרומטר Cytochalasin D (סיד) במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס ואז נדבקו ב10 7 WT ותמותה במעקב בזחלי pretreated 24 pi שעה הפגינו באופן משמעותי (P = 0.0066, מבחן t מזווג) מופחת תמותה. תוצאות מייצגות את מאהn של בארבעה ניסויים עצמאיים ± סטיות תקן עם 10 זחלים לכל מצב. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig3.jpg" /> איור 3. ההדמיה Immunofluorescence של חלבוני מפעיל בhemocytes חילוץ. hemocytes הוצאו מזחלים נגועים בL. pneumophila 130b WT או Δ Dota להביע 4HA-SidC 41-918 ב5 תאי pi שעה הוכתמו באמצעות אנטי HA (אדום) ואנטי הלגיונלה נוגדנים (ירוקים) וכתם DAPI ה-DNA (כחול) כדי להמחיש את הגרעינים. 4HA-SidC 41-918 נצפו WT שמסביב, אך לא Δ Dota, חיידקים. בר סולם 5 מיקרומטר. <img alt="איור 4" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig4.jpg" /> איור 4. L. pneumophila משכפל בתוך ג מלונלה באופן דוט / ICM תלוי. זחלים היו נגוע בpneumophila WT או Δ Dota ל &#39;ו ב 0, 5, 18, ​​ו24 pi שעה hemolymph משלושה חרקים נגועים יקוו, מצופות על צלחות CYE ו CFU נחוש ו מנורמל לבידוד ולמשקל של hemolymph חילוץ. WT L. pneumophila המשוכפל במהלך הניסוי ואילו זן Δ Dota נוקה בתוך 18 תוצאות pi hr הם הממוצע של שלושה ניסויים נפרדים ± סטיית תקן. <img alt="איור 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig5.jpg" /> איור 5. זיהום עם WT L. תוצאות pneumophila בהרס hemocyte משמעותי. hemocytes חולצו בשעה 5, 18, ​​ו24 pi שעות מזחלים נגוע בpneumophila WT או Δ Dota ל &#39;ותאי קיימא נספרים באמצעות hemocytometer. לא נמצא הבדל במספר התאים נתפס בשעה 5 pi שעה בין הזנים עם זאת ב18 pi שעה רק כ 15% מhemocytes להישאר בזחלים נגועים בזן WT בהשוואה לזן Δ Dota. תוצאות הן הממוצעים של שלושה ניסויים נפרדים, ± סטיית תקן.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection at JoVE.com

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

הזחל של עש mellonella Galleria שעווה הוקם לאחרונה כמודל vivo בללמוד זיהום pneumophila הלגיונלה. הנה, אנחנו מדגימים טכניקות בסיסיות לאפיין את הפתוגנזה של הלגיונלה בזחלים, כוללים חיסון, מדידה של אלימות ושכפול חיידקים, כמו גם הפקה וניתוח של hemocytes הנגוע.

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

החרקים<em&gt; גלרית mellonella</em&gt; כדגם זיהום רב עצמה כדי לחקור פתוגנזה קטריאלי

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Cecal קשירת ונקר-Induced אלח דם כמודל ללמוד Autophagy בעכברים

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

דג הזברה כמודל להעריך את הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...