Name: bone marrow-derived macrophage production
Uploaded: 2013-11-22T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow-derived Macrophage Production at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal CNRS (PICS 2012-2014 a EG), e da una sovvenzione della Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 a Giovanna Mottola). Filippo Conti è un collega della Cooperazione Scientifica Fondazione&#39;&#39; Infectiopole Sud&#39;&#39;. Nicola Boucherit è un collega del Ministero francese per la Ricerca e la Tecnologia. Le fonti di finanziamento hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati, analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

Dichiarazione Etica Il protocollo per la gestione degli animali è stato approvato dal nostro Comitato Etico istituzionale Animal &quot;Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Sperimentale Médico-Chirurgical&quot; (CFREMC, permesso Progetto 10-300.122.013 a Eric Ghigo) da Aix-Marseille University in accordo con le regole di Décret N ° 87-848 del 1987/10/19. Gli esperimenti sono stati condotti presso la Faculté de Médecine de la Timone (permesso Sperimentazione numero 13...

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	<li>Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+generating+functionally+heterogeneous+macrophages:+chaos+revisited.">Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited.</a> J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).</li><li>Van Furth, R., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).</li><li>Adams, D., Halmiton, T., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).</li><li>Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+haemopoietic+and+other+tissues+of+the+developing+mouse+detected+by+the+monoclonal+antibody+F4/80.">Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80.</a> Development. 112, 517-526 (1991).</li><li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagosome:+compartment+with+a+license+to+kill.">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+microbes:+complexity+in+action.">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).</li><li>Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte/macrophage+proteomics:+recent+findings+and+biomedical+applications.">Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications.</a> Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).</li><li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+bacterial+infections.">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).</li><li>Barry, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+stimulation+of+p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS+by+LPS+from+pathogenic+Coxiella+burnetii+prevents+trafficking+to+microbicidal+phagolysosomes.">Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes.</a> Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).</li><li>Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uniformity+of+phagosome+maturation+in+macrophages.">The uniformity of phagosome maturation in macrophages.</a> J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).</li><li>Sundaramurthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Chemical+and+RNAi+Multiparametric+Profiles+Identifies+Triggers+of+Intracellular+Mycobacterial+Killing.">Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing.</a> Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant.">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).</li></ol>

Il protocollo qui descritto dettaglia un metodo per produrre un gran numero di BMDMs. BMDM sono cellule primarie e hanno la funzione e le proprietà dei macrofagi differenziati da monociti biologico perché ci sono maturo, in contrasto con linee cellulari di macrofagi, che sono immaturi. BMDMs possono essere utilizzati per lo screening genetico (RNAi), screening di farmaci, studi funzionali, studi di interazione ospite-patogeno e molte altre aree di indagine. La procedura qui presentata è m...

Un aspetto significativo della funzione dei macrofagi è il loro ruolo nella immunità innata e adattativa. A causa della loro capacità di fagocitare particelle inerti, batteri o parassiti, i macrofagi sono una prima linea di difesa contro gli invasori stranieri. Una volta interiorizzato, i microbi sono degradati all&#39;interno phagolysosomes. I macrofagi anche inviare segnali di reclutamento per e gli antigeni presenti di altre cellule immunitarie come i linfociti T. I macrofagi sono derivati ​​da monociti. Monociti sorgono nel midollo osseo da cellule staminali mieloidi e migrano sangue periferico e vari tessuti dove si differenziano in macrofagi. Si stima che un topo adulto sana contiene circa 10 8 macrofagi che sono distribuiti in tutto il corpo in vari organi e tessuti (Tabella 1) 1,2. I macrofagi mostrano grande fenotipica e diversità funzionale a causa della loro capacità di adattarsi al loro 3,4 microambiente. Il MACROP più importantestruttura hage è la loro attività microbicida, che è definito dalla capacità di fagocitare i microbi e distruggerli. La risposta fagocitaria è definita mediante l&#39;attivazione di reti di segnalazione complesse che vengono stimolati dal contatto microbica, quindi, macrofagi modulano l&#39;espressione genica in modo appropriato in risposta a diversi stimoli. Dopo la fagocitosi, i microbi vengono eliminati in una struttura chiamata fagolisosoma, tuttavia, molti microbi patogeni hanno sviluppato strategie per sovvertire la funzione microbicida dei macrofagi 5. La diversità dei meccanismi di sovversione che sono utilizzati da diverse specie microbiche è un testamento alla complessità del processo di fagocitosi 6 e fagolisosoma biogenesi. Le malattie infettive sono i principali problemi di salute umana, e numerosi meccanismi e molecole partecipano alle attività antimicrobiche macrofagi. Inoltre, gli obiettivi delle proprietà microbicida che vengono dirottati da microbi rimangono sconosciute, quindi, vi è una notificaxplosion di interesse per gli aspetti evolutivi, genetici e biochimici delle interazioni ospite-patogeno che ha rinnovato l&#39;attenzione scientifiche per quanto riguarda i macrofagi. Attualmente, la maggior parte della ricerca nel campo viene fatta su macrofagi linee cellulari, che differiscono da macrofagi primari dell&#39;attività fagocitaria, la produzione di citochine e la regolazione del burst ossidativo. Inoltre, sono meno adatti per microscopia. Per studiare l&#39;interazione macrofagi-agenti patogeni si consiglia di utilizzare i macrofagi primari, come il midollo osseo macrofagi derivati ​​(BMDMs), che presentano caratteristiche più fisiologiche. Inoltre, è possibile lavorare su BMDMs geneticamente modificati, perché questi macrofagi possono essere isolati direttamente da topi transgenici e, con la disponibilità di nuove tecnologie come transfezione lentivirale, il loro profilo di espressione genica può essere alterato da sovraespressione del gene o RNA interferenza. Qui, si descrive un procedimento per differenziare murino osso mfreccia in macrofagi che forniranno un gran numero di macrofagi in 7 giorni per varie analisi funzionale, come la proteomica 7, trascrittomica 8, traffico intracellulare studia 9, studi dinamici 10, schermi genetiche (RNAi) e lo screening di stupefacenti 11.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>21969-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEM515F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#956;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#956;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100/20 mm)</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35/10 mm)</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow-derived macrophage production

I macrofagi sono componenti critici delle risposte immunitarie innate e adattative, e sono la prima linea di difesa contro gli invasori stranieri a causa delle loro potenti attività microbicida. I macrofagi sono ampiamente distribuiti in tutto il corpo e sono presenti negli organi linfoidi, fegato, polmoni, tratto gastrointestinale, sistema nervoso centrale, le ossa e la pelle. A causa della loro ripartizione, partecipano in un&#39;ampia gamma di processi fisiologici e patologici. I macrofagi sono cellule altamente versatile in grado di riconoscere alterazioni microambientali e per mantenere l&#39;omeostasi tissutale. Numerosi agenti patogeni si sono evoluti meccanismi per utilizzare i macrofagi come cavalli di Troia per sopravvivere, replicarsi in, e infettare sia gli esseri umani e gli animali e per diffondere in tutto il corpo. La recente esplosione di interesse per gli aspetti evolutivi, genetici e biochimici delle interazioni ospite-patogeno ha rinnovato l&#39;attenzione scientifiche per quanto riguarda i macrofagi. Qui, descriviamo unprocedura per isolare e coltivare macrofagi da midollo osseo murino che fornirà un gran numero di macrofagi per studiare le interazioni ospite-patogeno nonché altri processi.

Lo scopo di questo metodo era di ottenere facilmente un gran numero di macrofagi in pochi giorni. La preparazione di cellule di midollo osseo è illustrato in Figura 1. Le ossa della zampa posteriore sono stati raccolti e fracassato in un mortaio. Una volta che i macrofagi residenti sono stati rimossi dalla preparazione di cellule di midollo osseo, cellule del midollo osseo sono state incubate con GM-CSF (giorno 0). Dopo 3 giorni, le cellule, che erano intorno e nonadherent prima cultura, iniziano a dif...

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Bone Marrow-derived Macrophage Production

I macrofagi sono da tempo riconosciuti come una componente critica delle risposte immunitarie innate e adattative. La recente esplosione di conoscenze relative agli aspetti evolutivi, genetici e biochimici dell&#39;interazione tra macrofagi e microbi ha rinnovato l&#39;attenzione scientifica ai macrofagi. Questo articolo descrive un metodo per differenziare macrofagi da midollo osseo di topo.

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Research

JoVE Journal

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Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii parete formazione di cisti in attivo dal midollo osseo macrofagi e condizioni Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

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Generazione e l&#39;etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

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Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

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As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

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Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

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RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

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Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale

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