Name: bone marrow-derived macrophage production
Uploaded: 2013-11-22T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow-derived Macrophage Production at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av CNRS (PICS 2012-2014 til EG) og ved en bevilgning fra Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 til Giovanna Mottola). Filippo Conti er en kar av Scientific Cooperation Foundation&#39;&#39; Infectiopole Sud.&#39;&#39; Nicola Boucherit er en kar av det franske departementet for forskning og teknologi. Finansieringskildene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling, dataanalyse, beslutningen om å publisere, eller manuskript forberedelse.

Etikk Erklæring Protokollen for dyr behandling ble godkjent av vår institusjonelle Animal Ethics Committee &quot;Conseil Scientifique du Centre de Dannelse et de Recherche Experimental Médico-Chirurgical&quot; (CFREMC, Prosjekt tillatelse 10-300122013 til Eric Ghigo) fra Aix-Marseille Universitet i samsvar med reglene av Décret N ° 87-848 av 10/19/1987. Forsøkene ble utført ved Faculté de Médecine de la Timone (Eksperimentering tillatelse nummer 13,385 til Eric Ghigo). <p class="jo...

<ol>
	<li>Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+generating+functionally+heterogeneous+macrophages:+chaos+revisited.">Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited.</a> J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).</li><li>Van Furth, R., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).</li><li>Adams, D., Halmiton, T., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).</li><li>Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+haemopoietic+and+other+tissues+of+the+developing+mouse+detected+by+the+monoclonal+antibody+F4/80.">Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80.</a> Development. 112, 517-526 (1991).</li><li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagosome:+compartment+with+a+license+to+kill.">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+microbes:+complexity+in+action.">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).</li><li>Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte/macrophage+proteomics:+recent+findings+and+biomedical+applications.">Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications.</a> Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).</li><li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+bacterial+infections.">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).</li><li>Barry, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+stimulation+of+p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS+by+LPS+from+pathogenic+Coxiella+burnetii+prevents+trafficking+to+microbicidal+phagolysosomes.">Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes.</a> Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).</li><li>Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uniformity+of+phagosome+maturation+in+macrophages.">The uniformity of phagosome maturation in macrophages.</a> J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).</li><li>Sundaramurthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Chemical+and+RNAi+Multiparametric+Profiles+Identifies+Triggers+of+Intracellular+Mycobacterial+Killing.">Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing.</a> Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant.">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).</li></ol>

Protokollen beskrevet heri detaljer en metode for å produsere et stort antall BMDMs. BMDM er primære celler og har den biologiske funksjon og egenskaper av makrofager skiller seg fra monocytter, fordi det er modent, i motsetning til makrofag-cellelinjer, som er umoden. BMDMs kan anvendes for genetisk screening (RNAi), medikamentscreening, funksjonelle studier, vert-patogen interaksjonsstudier og mange andre deler av undersøkelsen. Fremgangsmåten presentert heri er meget enkel og krever i...

En betydelig del av makrofagfunksjonen er deres rolle i medfødt og adaptiv immunitet. På grunn av deres evne til å phagocytose inerte partikler, bakterier eller parasitter, makrofager er en første forsvarslinje mot fremmede inntrengere. Når internalisert, er mikrober degradert innen phagolysosomes. Makrofager også sende rekrutterings signaler for og presentere antigener til andre immunceller som T-lymfocytter. Makrofager er avledet fra monocytter. Oppstår monocytter i benmargen fra myeloid stamceller og migrere til perifert blod og ulike vev der de differensieres til makrofager. Det er anslått at en frisk voksen mus inneholder ca 10 8 makrofager som er fordelt over hele kroppen på forskjellige organer og vev (tabell 1) 1,2. Makrofager vise stor fenotypiske og funksjonelle mangfold på grunn av deres evne til å tilpasse seg deres mikromiljøet 3,4. Det viktigste macropHage egenskapen er deres cidiske aktivitet, som er definert ved deres evne til å phagocytose mikrober og ødelegge dem. Den fagocytisk respons er definert ved aktivering av komplekse signalnett som stimuleres av mikrobiell kontakt, derfor, makrofager modulere genekspresjon passende som respons på forskjellige stimuli. Etter fagocytose, er mikrober eliminert i en struktur kalt phagolysosome, men har mange sykdomsfremkallende mikrober utviklet strategier for å styrte den mikrobedrepende funksjon av makrofager fem. Mangfoldet av Subversion mekanismer som benyttes av ulike mikrobielle arter er et testament til kompleksiteten i phagocytic prosessen seks og phagolysosome biogenesis. Smittsomme sykdommer er store menneskelige helseproblemer, og mange mekanismer og molekyler delta i makrofager antimikrobielle aktiviteter. Videre er målene for de mikrobicide egenskaper som er kapret av mikroorganismer er imidlertid ukjent, og derfor er det en eXplosion av interesse i de evolusjonære, genetiske og biokjemiske aspekter av vert-patogen interaksjoner som har fornyet vitenskapelig oppmerksomhet om makrofager. For tiden blir størstedelen av den forskning på feltet gjøres på makrofager cellelinjer, som skiller seg fra primær-makrofager i den fagocytisk aktivitet av cytokiner produksjon og reguleringen av oksidativ brist. I tillegg er de mindre egnet for mikroskopi. For å undersøke samspillet makrofager-patogener, anbefales det å bruke primære makrofager, som for eksempel benmargen makrofager som stammer (BMDMs), som viser mer fysiologiske funksjoner. Videre er det mulig å arbeide på genetisk modifiserte BMDMs, fordi disse makrofagene kan bli isolert direkte fra transgene mus og med tilgjengeligheten av nye teknologier som lentiviral transfeksjon, deres genekspresjon profilen kan endres av genet overekspresjon eller RNA-interferens. Her beskriver vi en prosedyre for å skille murine bein marrow inn makrofager som vil gi et stort antall makrofager i 7 dager for ulike funksjonelle analyser som proteomikk 7, transcriptomics 8, studerer intracellulær trafficking 9, dynamiske studier 10, genetiske skjermer (RNAi) og narkotika screening 11.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>21969-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEM515F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#956;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#956;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100/20 mm)</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35/10 mm)</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow-derived macrophage production

Makrofager er kritiske komponenter i den medfødte og ervervede immunresponser, og de er de første forsvarslinje mot fremmede inntrengere på grunn av sine kraftige mikrobicide aktiviteter. Makrofager er vidt fordelt gjennom hele legemet, og er til stede i de lymfoide organer, lever, lunger, mage-og tarmkanalen, sentralnervesystemet, ben og hud. På grunn av deres partisjonere, deltar de i en rekke fysiologiske og patologiske prosesser. Makrofager er svært allsidige celler som er i stand til å gjenkjenne microenviron endringer og å opprettholde vev homeostase. Mange patogener har utviklet mekanismer for å bruke makrofager som trojanske hester for å overleve, gjenskape i, og infisere både mennesker og dyr, og for å forplante seg i hele kroppen. Den nylige eksplosjon av interesse i evolusjonære, genetiske og biokjemiske aspekter av host-patogen interaksjoner har fornyet vitenskapelig oppmerksomhet om makrofager. Her beskriver vi enFremgangsmåten for å isolere og dyrke makrofager fra murin benmarg som vil gi et stort antall makrofager for å studere host-patogen interaksjoner, så vel som andre prosesser.

Målet med denne fremgangsmåten var for enkelt å oppnå et stort antall makrofager i noen dager. Den benmargscelle preparatet er illustrert i figur 1.. Bones fra bakbenet ble samlet inn og knust i en morter. Når beboeren makrofager ble fjernet fra benmargen celleforberedelsen, ble benmargceller inkubert med GM-CSF (Dag 0). Etter 3 dager ble cellene, som var runde og ikke-adherente før kulturen, begynner å differensiere til makrofager, og holder seg (figur 1A). Cytometri analyse ved...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow-derived Macrophage Production at JoVE.com

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Makrofager har lenge vært anerkjent som en kritisk komponent i den medfødte og ervervede immunresponser. Den siste eksplosjonen av kunnskap knyttet til evolusjonære, genetiske og biokjemiske aspekter av samspillet mellom makrofager og mikrober har fornyet vitenskapelig oppmerksomhet til makrofager. Denne artikkelen beskriver en metode for å skille makrofager fra mus benmarg.

Bone Marrow-avledet Macrophage Produksjon

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Undersøkelse av Macrophage Polarisering Bruk Bone Marrow makrofager som stammer

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolasjon og intravenøs injeksjon av murine Bone Marrow Avledet Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Metabolsk Karakterisering av polarisert M1 og M2 benmargavledede Makrofager Bruke Sanntids Ekstracellulær Flux Analyse

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murine Hind Limb Long Bone Dissection og benmarg Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification fra intracellulært Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisere Macrophage ekstracellulære feller bruker AC Confocal mikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Vurdering av antistoff-baserte narkotika effekter på Murine benmargen og Peritoneal Macrophage aktivisering

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...