Name: detection of live escherichia coli o157:h7 cells by pma-qpcr
Uploaded: 2014-02-01T14:00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR at JoVE.com

אנו מודים למחלקה לביטחון מולדת של ארה&quot;ב לאספקת חלק מהמימון.

1. זני חיידקים ו-DNA תבנית הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול זני חיידקים של E. coli O157: H7, שאינו O157, ומינים אחרים פתוגניים, כגון סלמונלה וShigella, ב37 מעלות צלזיוס לילה עם הרעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ה-DNA מתרבויות חיידקים באמצעות הערכה המתאימה (ראה טבלה של חומרים) ובעקבות הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד צפיפות אופטית (OD 260) לקבוע ריכוזי DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. </li></ol> 2. פריימר ובדיקת עיצוב עבור assay qPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> E. coli O157: H7 רצפים הם מAE00517411 מספר הצטרפות GenBank. פריימרים עיצוב ובדיקה באמצעות תוכנה מתאימה לפריימר ועיצוב בדיקה בזמן אמת PCR (ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים). הרצפים של צבעי יסוד ובדיקה הם כדלקמן: Z3276-קדמי (F) &#39;5&#39;-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 Z3276-הפוך (R) 5&#39;-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 &quot; Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את אבקת פריימר עם מים, וכתוצאה מכך ריכוז של 10 מיקרומטר כפתרון עבודת פריימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הבדיקות ל10 מיקרומטר כפתרונות עבודת בדיקה. בדיקות שכותרתו להשתנות בעצמה עם קבוצות. לכן, לכיל כל אצווה של בדיקות שכותרתו לפני השימוש לביצועי qPCR אופטימליים. </li></ol> 3. הגדרת תנאי Assay qPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת תגובה, המורכב מ25.0 μl של תמהיל אב PCR בזמן אמת 2x, 200 ננומטר של פריימר קדימה, 200 ננומטר של פריימר ההפוך, ושל חללית 100 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של DNA המדגם (100 pg) ונפח מתאים של מים כדי להגיע לנפח סופי של μl 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבקרת nontemplate, השתמש 5 μl מים להחליף דגימת DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תנאי qPCR כדלקמן: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להפעלה של TaqMan; אחריו 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות לdenaturation ו60 &amp;# 176; C עבור 1 דקות לחישול / ארכה. </li></ol> 4. מבחן רגישות qPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דילול סדרה פי 10 מתרבות של שלב אמצע מעריכי (OD 600 = 0.5; על 1.5 x 10 8 CFU / מיליליטר על ידי ציפוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של דילולים תא 100 מיליליטר על צלחת 96 היטב בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב 2,500 XG 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מיליליטר של תמיסת מיצוי DNA היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי תא גלול עם טפטפת רב ערוצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת עם סרט, להרתיח את הצלחת באמבט מים במשך 10 דקות, ו צנטריפוגות ב 2,500 XG במשך 2 דקות. </li></ol> 5. הכנת תערובות של תא חי ומלח לטיפול PMA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 10 מיליליטר של E. coli O157: H7 ב 37 מעלות צלזיוס עד שלב אמצע מעריכי ולחלק את התרבות לשני aliquots. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים אחד aliquot של תאים עבור 10 דקות באמבט מים לתאים מתים ולהשאיר את aliquot האחר לתאים חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאמחדש לא תאי חיים מaliquot-נהרג בחום על ידי ציפוי התאים על צלחות אגר LB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 2 מיליליטר של תאי חיים והרג את החום ולהתאים את הריכוז עד 8 ​​x 10 6 CFU / מיליליטר עם מדיום LB. יצירת ארבע קבוצות של דילולים תא נעות בין 8 x 10 0 עד 8 ​​x 6 10 CFU / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשני הסטים הראשונים של דילולים תא לתאי חיים שטופלו בPMA או שלא טופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוצות שלישי והרביעית של דילולים תא, להוסיף 8 x 10 6 תאים מתים לדילול כל תא (8 x 10 8 - 0 x 10 6) כדי להפוך את תערובות תא חיות ומתות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את הקבוצה השלישית של דילול עם PMA והשתמש בסט הרביעי של דילול לשליטה. </li></ol> 6. טיפול בתאים עם PMA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים PMA בsulfoxide דימתיל (או מים) כדי להפוך את פתרון מניות 10 מ&quot;מ ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 400 μl של תאי חיים, תאים מתים, ותערובת של תאים חיים ומתים בשלושה microtubes הנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 2.0 מיליליטר של 10 מ&quot;מ PMA לaliquot כל תא לריכוז סופי של 50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות בטמפרטורת הסביבה במשך 5 דקות בחושך, לוחצת בעדינות כמה פעמים, 3 שניות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של דגימות 100 μl על צלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת עם סרט אופטי ולשים את הצלחת על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הצלחת 20 סנטימטר ממקור אור 650 W הלוגן ולחשוף עבור 2 דקות לחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב 2,500 XG עבור 10 דקות, בעדינות זורקי supernatant וזהירות לנקז את הצלחת על פיסת נייר סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי תא גלול ב50 μl של פתרון מיצוי DNA על ידי pipetting למעלה ולמטה עשרים פעמים עם Pipetman רב ערוצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת עם סרט, להרתיח במשך 10 דקות באמבט מים, ו צנטריפוגות ב 2,500 XG במשך 2 דקות. Supernatant בצלחת הוא את ה-DNA מהתאים שטופלו עם PMA ומוכן לqPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע qPCR כdescriמיטה לעיל, באמצעות 5 μl של ה-DNA. </li></ol>

<ol>
	<li>Barletta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+five-colony+pool+analysis+using+multiplex+real-time+PCR+for+detection+of+diarrheagenic+Escherichia+coli.">Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).</li><li>Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+method+for+detection+of+Shiga-like+toxin-producing+Escherichia+coli+in+ground+beef+using+the+polymerase+chain+reaction.">Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).</li><li>Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+strains+of+Escherichia+coli+serotype+O157:H7+and+their+Shiga-like+toxin+type+by+mismatch+amplification+mutation+assay-multiplex+PCR.">Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).</li><li>Li, Y., Mustapha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+Escherichia+coli+O157:H7,+Salmonella,+and+Shigella+in+apple+cider+and+produce+by+a+multiplex+PCR.">Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR.</a> J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+in+virulence+patterns+of+Escherichia+coli+possessing+eae+genes.">Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes.</a> Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).</li><li>Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Escherichia+coli+O157:H7+by+multiple+PCR.">Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).</li><li>Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+specific+for+Escherichia+coli+O157+based+on+the+rfb+locus+encoding+O157+lipopolysaccharide.">A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).</li><li>Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+gene+encoding+H+antigen+in+Escherichia+coli+and+development+of+a+PCR-restriction+fragment+length+polymorphism+test+for+identification+of+E.+coli+O157:H7+and+O157:NM.">Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).</li><li>Fricker, M., Messelh&#228;u&#223;er, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+real-time+PCR+assays+for+detection+of+emetic+Bacillus+cereus+strains+in+foods+and+recent+food-borne+outbreaks.">Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).</li><li>Li, B., Chen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+methodology+for+selective+detection+of+viable+Escherichia+coli+O157:H7+cells+by+targeting+Z3276+as+a+genetic+marker.">Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker.</a> Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).</li><li>Perna, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7.">Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7.</a> Nature. 409, 529-533 (2001).</li><li>Wang, S., Levin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+Vibrio+vulnificus+cells+from+dead+cells+in+real-time+PCR.">Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR.</a> J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).</li><li>Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells.">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).</li><li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+for+live/dead+distinction+in+microbial+ecology.">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).</li><li>Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+PCR+detection+of+viable+Enterobacter+sakazakii+cells+utilizing+propidium+monoazide+or+ethidium+bromide+monoazide.">Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide.</a> J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).</li><li>Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+stx1,+stx2,+and+eae+genes+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+using+SYBR+Green+in+a+real-time+polymerase+chain+reaction.">Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).</li><li>Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157:H7+bacteria+in+drinking+water+and+river+water.">Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מטרה העיקרית של המחקר כרוך בשימוש בZ3276 ORF, ייחודי לE. coli O157: H7, כסמן יחיד עבור assay qPCR. נכון לעכשיו, רוב מבחני qPCR ממקדים גנים ארסי, כגון stx1, stx2, וeaeA 1,2,5,6 או גנים פנוטיפי משותפים, כגון 3,4 uidA, rfbE וגני Flic 8,9. מדי פעם, מין או מתח לא יכול להיות בהחלט שזוהה על ידי גן הארסיות (ים), כגון STX 1and STX 2 גנים, כפי שהגנים האלה נמצאים במינים או זני 16 כמו גם שונים. שימוש rfbE וFlic לגני המטרה, יש צורך בשניהם גנים לשמש לזיהוי מלא של 17. שימוש ORF Z3276 כסמן ביולוגי, assay qPCR זה הוכח להיות assay רגיש וספציפי (טבלת 1). assay זה כבר נתון לבדיקות מחמירות inclusivity ובלעדיות, כולל O157: H7 זנים (n = 367), מעל 100 זנים שאינם O157, ומינים פתוגניים אחרים, כגון סלמונלה וShigella. כל O157: H7 הזנים שנבדקו התגלו באופן חיובי, ולא תגובתיות צולבת נמצאה מהזנים הלא O157 (טבלת 1), המציין כי ORF Z3276 הוא סמן ביולוגי ייחודי וחזק לגילויו של ע &#39; O157 coli: H7. המטרה השנייה של המחקר היא לזהות באופן סלקטיבי תאי חיים מהתאים מתים על ידי טיפול PMA לפני מיצוי DNA. PMA יכול לחדור לתוך התאים המתים עם הממברנה נפגעת ונקשר ל-DNA, ובכך מעכב את ההגברה DNA של תאים מתים ב13 ה-PCR. אנחנו צריכים לשנות את הליך PMA-הטיפול, והתאימו אותו לפורמט צלחת 96 היטב להליך. האינטנסיביות הנכונה של חשיפה לאור היא חיונית כדי להשיג את אפקט cross-linking האופטימלי. בעבר, microtubes כבר בשימוש בצעד זה 13-15. עם זאת, microtubes נפרד קשה להתמודד באקס אורצעד posure, וצינורות אלה אינם שקופים לחלוטין כדי להשיג טעם הנגדי הטוב ביותר. באמצעות צלחת 96 היטב, שיפרנו את היעילות של PMA-לטיפול. שינויים אלה עשויים להשפיע על assay בכמה דרכים: הם עושים את זה קל יותר להשיג אפקט cross-linking יסודי ואחיד, במיוחד עם דגימות רבות; ניתן להעביר מצלחת אחת דוגמאות שטופלו למשנו כדי לעשות את זה אפשרי לזיהוי של מספר הגדול של דגימות, והם מספקים assay PMA-qPCR זה עם פוטנציאל אוטומציה לכל התהליך. ההגבלה של assay PMA-qPCR זה היא שטיפול PMA מגדיל את עלות assay PCR במקצת ומעט הקטין את הרגישות של assay PCR.

PCR היא טכניקה נפוצה לגילויו של ע &#39; coli O157: H7 מדגימות מזון ואיכות הסביבה. זיהוי סמנים ביולוגיים ספציפיים לE. coli O157: H7 הוא אחד מהגורמים המרכזיים לגילוי מוצלח במבחני ה-PCR. הסמנים הביולוגיים בשימוש נפוץ במבחני ה-PCR לזיהוי של E. coli O157: H7 כולל רעלים שיגה (STX 1 ו STX 2) 1,2, גנים 3,4 uidA, 5,6 eaeA, 7 rfbE, וFlic 8,9. סמנים אלה יכולים לספק יעילות משתנה לזיהוי, עם זאת, רוב הסמנים הביולוגיים לא יכול לשמש כסמן ביולוגי ייחודי לגילויו של ע &#39; O157 coli: H7. חוסר בכוח ההבחנה של גנים מטרה זו קורא לסמן ביולוגי יותר ספציפי וחזק יותר (ות) עבור זיהוי של א &#39; O157 coli: H7 10. בדיקות רבות לגנים או מסגרות היפותטית פתוחות קריאה (ORFs) בE. coliO157: H7 11 תוכננו עבור assay qPCR מבוסס על הרמזים מmicroarrays גנוטיפ DNA מהמעבדה שלנו ועל ידי חיפוש בתוך מסד הנתונים GenBank של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה. הרצף של Z3276 ORF, שהוא גן fimbrial 11, נבחר עבור assay qPCR. בהמשך לכך, assay qPCR פותח באמצעות ניסויים רבים על פרמטרים PCR כגון ריכוזים של פריימרים ובדיקות, כמו גם טמפרטורות חישול וסיומת (מידע לא מוצג). לאחר בדיקות inclusivity התמריץ ובלעדיות על זני התייחסות כגון E. coli O157: H7 זנים, שאינו O157 וShigella בqPCR, Z3276 ORF זוהה כסמן גנטי ספציפי וחזק לזיהוי של ע &#39; O157 coli: H7. ואז אנו מפתחים שיטה חדשה qPCR באמצעות סמן ביולוגי ייחודי זה לצורך זיהוי של ע &#39; O157 coli: H7. אתגר נוסף באיתורו של ע &#39; coli O157: H7 במזוהם עבורods והסביבה היא קביעה מדויקת של תאי חיים מדגימות. הנוכחות המורחבת של ה-DNA בתאים וחוסר יכולת להבדיל כדאיות בassay PCR מתים עלולה לגרום לקריאות חיוביות שגויות, וכתוצאה מהערכת יתר של מספרי תא חיים בזיהוי. כתוצאה מכך, זה מגביל את שימוש PCR בזיהוי מדויק של גורמי מחלה במזון 12. גישה חדשנית כדי לבדל את ה-DNA של התאים המתים כבר נלקחה על ידי שילוב של טיפול monoazide propidium (PMA) בהליך ה-PCR בשנים האחרונות 13-15. PMA הוא מסוגל להיכנס פנימה של תאים מתים, וintercalate לתוך הדנ&quot;א בעת חשיפה לאור, אבל זה לא יכול ללכת חלק פנימי של תאי חיים להגיב עם ה-DNA של תאי חיים. לפיכך, בתערובות שטופלו PMA של תאים חיים ומתים, הדנ&quot;א של תאים מתים לא יכול להיות מוגבר ב13 PCR. אנחנו בשילוב טיפול PMA עם assay qPCR החדש שפותח כדי לזהות באופן סלקטיבי E. החי coli O157: H7 תאים. בנוסף, יש לנו עשינו את PMA-qPCRssay אפשרי לגילוי תפוקה גבוהה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">AB 7900HT Fast Real-time PCR system</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">2 x Universal master mix</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PrepMan Ultra</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Primer Express</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="58" rowspan="2" style="height:58px;width:249px;">Probes</td>
			<td rowspan="2" style="width:164px;">ABI</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">4316033 Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PMA</td>
			<td style="width:164px;">Biodium</td>
			<td align="right" style="width:171px;">40013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="87" rowspan="3" style="height:87px;width:249px;">Puregen cell and tissue kit</td>
			<td rowspan="3" style="width:164px;">Qiagene</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td align="right" height="29" style="height:29px;">158622</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">DU530 spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Beckman</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">NanoDrop Technology</td>
			<td style="width:171px;">&#160;ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">650 w halogen light source</td>
			<td style="width:164px;">Britek</td>
			<td style="width:171px;">H8061S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Otptical Adhesive film</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of live escherichia coli o157:h7 cells by pma-qpcr

מסגרת קריאה פתוחה ייחודית (ORF) Z3276 זוהתה כסמן גנטי ספציפי לE. O157 coli: H7. Assay qPCR פותח לגילויו של ע &#39; coli O157: H7 על ידי מיקוד ORF Z3276. עם assay זה, אנו יכולים לזהות נמוכים כמו כמה עותקים של הגנום של ה-DNA של א &#39; O157 coli: H7. הרגישות והספציפיות של assay אושרו על ידי בדיקות אימות אינטנסיביות עם מספר רב של E. coli O157: H7 זנים (n = 369) וזנים שאינם O157 (n = 112). יתר על כן, יש לנו בשילוב הליך monoazide propidium (PMA) עם פרוטוקול qPCR החדש שפותח לצורך זיהוי סלקטיבי של תאי חיים מהתאים מתים. הגברה של ה-DNA מהתאים מתים שטופלו ב-PMA הייתה עצורה כמעט לחלוטין בניגוד להגברה כמעט לא הושפעה דנ&quot;א מתאי חיים שטופלו ב-PMA. בנוסף, הפרוטוקול שונו והותאם לפורמט צלחת 96 היטב לטיפול קל ועקבי של מספר גדול של דגימות. Tהשיטה שלו צפויה להיות השפעה על מיקרוביולוגית מדויקת וניטור אפידמיולוגי של בטיחות מזון ומקור סביבתי.

זיהוי של ה coli O157: H7 ידי qPCR באמצעות ORF Z3276 אחד מגורמי המפתח של assay זה הוא רגיש וסגוליות של הבדיקה Z3276 משמשת בqPCR. הוא יכול לזהות נמוך כמו כמה עותקים של הגנום של ה-DNA של א &#39; coli O157: H7 כפי שמוצג באיור 1 א. של 120 הזנים שאינם O157 בדקו, כולל שישה זנים העיקריים שאינו O157 STEC, O104: זני H4, סלמונלה, וזני Shigella, לא תגובתיות צולבת נמצאה, כפי שמוצגת בטבלה 1. שילוב של טיפול PMA עם qPCR דוגרים E. coli O157: תאי H7 עם PMA (50 מ&quot;מ) במשך 5 דקות בחושך וחשיפה לאור במשך 2 דקות, שנבחרו לתנאי טיפול PMA. בנוסף, אנו הותאמו הליך טיפול PMA. לעומת microtubes השקוף שונים המשמש בשלב cross-linking, צלחת 96 היטב נמצאה להיות יעיל יותרלהגיע לאפקט cross-linking האופטימלי ונוח יותר מטיפול במספר גדול של צינורות מדגם במהלך תהליך החשיפה לאור. הגברה של DNA מתאי חיים ומתים שטופלו ב-PMA בqPCR תופעות של עיכוב בתיווך PMA של הגברה של ה-DNA מהתאים מתים בassay qPCR זה מוצג באיור 1 באמצעות DNA נגזר משני דילולים תא סידוריים פי 10 חיים או מתים. התוצאות מראות כי העקומות שנוצרו מתאי החיים שטופלו בPMA (עקומה אדומה) וללא PMA (עקומה כחולה) נראות ליניארי וכמעט זהה אחד לשני. הבדלי ערך CT קלים הוצגו בין תאי החיים שטופלו בPMA וללא PMA (איור 1 א), טוענים כי היה טיפול PMA השפעה מועטת על הגברה של ה-DNA של תאי החיים בqPCR. אבל 15 - הבדל CT ​​ערך (32,000 קיפול) הוצג בין התאים המתים שטופלו עם PMA וללא PMA, הדגמהnstrating כי טיפול PMA יעילות מודחק הגברה DNA מהתאים המתים (איור 1). זיהוי של תאי חיים מתערובות תא חיות ומתות בqPCR שני סטים של דילולים תא חיים (8 x 10 8 - 0 x 10 6 CFU) טופלו עם PMA או בלי PMA כדי לזהות תאי חיים מתערובות תא חיים / מתות. תוצאות qPCR (איור 2 א) הראו מגמה מקבילה הפוכה הדרגתית של ערכי CT הקשורות למספרים של תאים שטופלו בשידור חי (ברים סגולים) לדגימות שלא טופלו (סורגים כחולים). תאי החיים שטופלו הניבו ערכי CT מעט גבוהים יותר מאלה של תאי חיים שלא טופלו. מגמה הפוכה מתקדמת דומה בערכי CT נצפתה עם המספר האמיתי של תאי חיים בתערובות חיות / מתות התא טופלו PMA (פסים ירוקים), כמו גם באיור 2 ב. בנוסף, מגמת ירידה זו של ערכי CT הייתהנצפה עם מספר תאי חיים בתערובות למרות נוכחותם של 106 תאים מתים. תוצאות אלה הראו שערכי CT של תערובות התא חיות / מתות ייצגו את ה-DNA מתאי החיים לבד, בעוד שהגברת DNA מהתאים המתים דוכאה ביעילות על ידי טיפול PMA. אבל, ערכי CT של תערובות חיות / מתות תאים שטופלו ב PMA היו נעו ולא באו לידי ביטוי במספרי התא החי בתערובות באיור 2 ב (פסים צהובים). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1.jpg" /> איור 1. לחיות ותאים מתים שטופלו עם PMA או בלי PMA בassay qPCR. () סידורי של פי 10 דילול E. החי coli O157: H7 דילולים תא (8 x 10 0 - 8 x 10 6 CFU) טופלו עם PMA או בלי PMA.ערכי CT מייצגים את ערכי CT הממוצע של triplicates בassay qPCR. (ב) השוואה של ההגברה DNA של תאי חיים ותאים מתים שטופלו עם PMA וללא PMA בassay qPCR השוואת q. ΔRn מתייחס פלואורסצנטי שינוי עוצמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2.jpg" /> איור 2. התמיינות של תאי חיים מתערובות חיות / מתות תא על ידי PMA-qPCR ארבעה סטים של דילולים פי 10 של תרביות תאים (8 x 10 8 - 0 x 10 6 CFU). נעשו כפי שצוינה. () סט הראשון של דילול תא טופל עם PMA תוך דילול התא השני היה או לא מטופל לפני מיצוי DNA.(ב) 8 x 10 6 תאים מתים היו מעורבים עם הקבוצות שלישי והרביעית של דילולים תא לבצע שני סטים של תערובות תא חיות / מתות כפי שצוין. קבוצה אחת של תערובות התאים טופלה עם PMA וטופל הסט האחר ללא PMA לפני מיצוי DNA. כל עמודה מייצגת את ערכי CT הממוצע של ניסוי בשלושה עותקים ± SD. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מנגנון </td><td> סרוטיפ </td><td> מספר הזנים שנבדקו </td></tr><tr><td rowspan="15"> החיידק </td><td> 2006 O157 תרד: מבודד H7 פרוץ </td><td> 186 </td></tr><tr><td> 2006 טאקו בל O157: H7 מבודד </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 2006 טאקו ג&#39;ון O157: H7 מבודד </td><td> 11 </td></tr><tr><td> אוספי מתח DMB מO157 אחר: התפרצויות H7 </td><td> 112 </td></tr><tr><td> O104: H4 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> O26 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> O103 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> O111 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> O121 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O45 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> O145 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> O113 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O91 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> O55 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> אחר </td><td> 19 </td></tr><tr><td rowspan="2"> סלמונלה </td><td> Typhi </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ניופורט </td><td> 2 </td></tr><tr><td> דיזנטרית Shigella </td><td> 6 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> sonnei Shigella </td><td> לא ידוע </td><td> 2 </td></tr><tr><td> flexneri Shigella </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> boydii Shigella </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> סך הכל </td><td> 481 </td></tr></tbody></table> Tתוכל 1. זנים המשמשים לאימות בassay PCR בזמן אמת לצורך זיהוי של ע &#39; O157 coli: H7.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR at JoVE.com

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Assay qPCR פותח לצורך זיהוי של O157 החיידקים Escherichia: H7 מיקוד סמן גנטי ייחודי, Z3276. QPCR היה בשילוב עם טיפול monoazide propidium (PMA) לגילוי תא חי. פרוטוקול זה כבר שונה ומותאם לפורמט צלחת 96 היטב לטיפול קל ועקבי של דגימות רבות

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

פרוטוקולים ליישום<em&gt; חיידקי Escherichia</emמערכת&gt; בהתבסס TX-TL סלולרי ללא ביטוי של ביולוגיה סינתטית

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

טיהור ללא chromatographic של פוליפפטידים דמויי אלסטין רקומביננטי וFusions עם פפטידים וחלבונים מן<em&gt; חיידקי Escherichia</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments