Name: detection of live escherichia coli o157:h7 cells by pma-qpcr
Uploaded: 2014-02-01T14:00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR at JoVE.com

Biz finansmanın bir kısmını sağlamak için İç Güvenlik US Department teşekkür ederim.

1.. Bakteriyel Suşlar ve DNA şablonu hazırlama <ol><li> E: bakteri suşları büyümek coli O157: H7, non-O157 ve bir gece boyunca çalkalama ile örneğin 37 ° C&#39;de Salmonella ve Shigella gibi diğer patojenik türleri,. </li><li> Uygun bir kit (malzemelerin tabloya bakınız) kullanılarak ve üreticinin talimatları bakteriyel kültürlerden DNA ayıklayın. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, DNA konsantrasyonları belirlemek için optik yoğunluk (OD 260) ölçülür. </li></ol> 2. Primer ve QPCR Probe Assay için tasarım <ol><li> E. coli O157: H7 sekansları, GenBank erişim numarası AE00517411 vardır. Astar tasarımı ve (ayrıntılar için bakınız malzeme tablosu) gerçek-zamanlı PCR için primer ve prob tasarımı için uygun yazılım kullanarak prob. Primer ve prob sekansları, aşağıdaki gibidir: Z3276-İleri (F) 5&#39;-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 &#39; Z3276-Reverse (R) 5&#39;-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 &#39; Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ </li><li> Bir primer çalışma çözeltisi olarak 10 uM bir konsantrasyonda elde edilen, su ile toz primer sulandırın. </li><li> Prob iş çözümleri olarak 10 mcM probları sulandırmak. Etiketli prob gruplar ile potens değişir. Bu nedenle, optimal performans için qPCR kullanmadan önce etiketlenmiş sondaların her parti titre edilir. </li></ol> 3. QPCR test koşulları ayarlama <ol><li> 2x gerçek zamanlı PCR ana karışımı 25.0 ul, ileri primerden 200 nM, geri primerden 200 nM ve 100 nM prob oluşur, reaksiyon karışımı hazırlayın. </li><li> 50 ul bir son hacme ulaşmak için 5 numune DNA (100 pg) ul su ve uygun bir hacim. </li><li> Nontemplate kontrolü için, DNA örneği yerine su 5 ul kullanın. </li><li> , 10 saniye denatürasyon için ve 60 ° ve 95 ° C 40 döngü, ardından 95 ° C &#39;TaqMan aktivasyonu için 10 dakika için aşağıdaki gibidir: QPCR koşulları ayarlama176., C tavlama / uzatma 1 dakika karıştırıldı. </li></ol> 4. QPCR Duyarlılık Testi <ol><li> (; Kaplama ile yaklaşık 1.5 x 10 8 CFU / ml OD 600 = 0.5) orta üslü fazda bir kültürden bir seri 10-misli seyreltme olun. </li><li> , Üç kopya halinde 96 oyuklu bir plaka üzerine hücre seyreltmelerinden 100 ml ilave edilir. </li><li> 10 dakika boyunca 2500 x g&#39;de santrifüje plaka. </li><li> Her bir oyuğa DNA ekstraksiyon çözeltisi 50 ml ilave edilir. </li><li> Bir çok kanallı bir pipet ile yeniden süspanse edin hücre topakları. </li><li> 10 dakika için bir su banyosu içinde plaka kaynatın, bir film ile plaka Seal ve 2 dakika boyunca 2500 x g&#39;de santrifüj. </li></ol> 5. PMA Tedavi için Canlı ve Ölü Hücre Karışımları hazırlanması <ol><li> E. 10 ml büyütün coli O157: orta üslü faza kadar 37 ° C&#39;de H7 ve iki eşit bölüme kültür bölün. </li><li> Ölü hücreler için bir su banyosu içinde 10 dakika için bir hücre, bir kısım kaynatın ve canlı hücreleri için diğer bir kısım bırakın. </li><li> DoğrulayınYeniden LB agar plakaları üzerinde hücreleri kaplama ile ısı-ölümlü kısım hiçbir canlı hücrelerdir. </li><li> Canlı ve ısıyla öldürülmüş hücrelerin 2 ml alın ve 8 &#39;ye konsantrasyonu ayarlamak x 10 6 CFU / ml LB ortamı ile. 8 x 10 0 8 x 10 6 CFU / ml arasında değişen hücre seyreltileri dört set oluşturun. </li><li> PMA ile muamele edilmiş ya da muamele edilmemiş hücrelerin canlı hücre dilüsyonları ilk iki set kullanın. </li><li> Canlı ve ölü hücre karışımları için - hücreli dilüsyonları üçüncü ve dördüncü setleri için, her bir hücre seyreltme (8 x 10 6 8 x 10 0) 8 x 10 6 ölü hücreleri ekleyin. </li><li> PMA ile seyreltme, üçüncü bir dizi tedavi ve kontrol için seyreltme dördüncü dizi kullanımı. </li></ol> 6. Hücreler PMA ile Tedavisi <ol><li> 10 mM stok solüsyonu ve karanlıkta -20 ° C&#39;de saklanır yapmak dimetil sülfoksit (veya su), PMA çözülür. </li><li> Canlı hücreler, ölü hücreleri ve canlı ve ölü hücreleri içinde karışımın alikosu 400 ulüç ayrı mikrotüpler. </li><li> 50 uM bir nihai konsantrasyona kadar her bir hücre için 10 kısım mM PMA 2.0 ml ilave edilir. </li><li> Yavaşça birkaç kez, 3 saniye, her zaman titreme, karanlık bir ortamda 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 96 oyuklu bir plaka üzerinde numunelerin 100 ul ekleyin. </li><li> Bir optik film ile plaka yalıtılır ve bu üzerinde plaka koydu. </li><li> 20 cm 650 W halojen ışık kaynağından plakasını ayarlayın ve ışık pozlama için 2 dakika süreyle maruz. </li><li> 10 dakika boyunca 2.500 x g&#39;de santrifüj plaka, yavaşça süpernatantı atmak ve dikkatle emici bir kağıt parçası üzerinde plaka boşaltın. </li><li> Pipetleme ve bir çok kanallı Pipetman yirmi kat aşağı DNA ekstraksiyon çözeltisi 50 ul yeniden süspanse hücre topakları. </li><li> 2 dakika boyunca 2500 x g&#39;de 10 dakika su banyosu içinde ve santrifüj kaynatın, bir film ile plaka kapatın. Plakadaki Süpernatan, PMA ve QPCR hazır işlemden hücrelerinden DNA&#39;dır. </li><li> Descri olarak qPCR gerçekleştirinYukarıda yatak, DNA 5 ul kullanılmıştır. </li></ol>

<ol>
	<li>Barletta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+five-colony+pool+analysis+using+multiplex+real-time+PCR+for+detection+of+diarrheagenic+Escherichia+coli.">Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).</li><li>Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+method+for+detection+of+Shiga-like+toxin-producing+Escherichia+coli+in+ground+beef+using+the+polymerase+chain+reaction.">Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).</li><li>Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+strains+of+Escherichia+coli+serotype+O157:H7+and+their+Shiga-like+toxin+type+by+mismatch+amplification+mutation+assay-multiplex+PCR.">Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).</li><li>Li, Y., Mustapha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+Escherichia+coli+O157:H7,+Salmonella,+and+Shigella+in+apple+cider+and+produce+by+a+multiplex+PCR.">Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR.</a> J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+in+virulence+patterns+of+Escherichia+coli+possessing+eae+genes.">Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes.</a> Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).</li><li>Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Escherichia+coli+O157:H7+by+multiple+PCR.">Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).</li><li>Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+specific+for+Escherichia+coli+O157+based+on+the+rfb+locus+encoding+O157+lipopolysaccharide.">A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).</li><li>Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+gene+encoding+H+antigen+in+Escherichia+coli+and+development+of+a+PCR-restriction+fragment+length+polymorphism+test+for+identification+of+E.+coli+O157:H7+and+O157:NM.">Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).</li><li>Fricker, M., Messelh&#228;u&#223;er, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+real-time+PCR+assays+for+detection+of+emetic+Bacillus+cereus+strains+in+foods+and+recent+food-borne+outbreaks.">Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).</li><li>Li, B., Chen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+methodology+for+selective+detection+of+viable+Escherichia+coli+O157:H7+cells+by+targeting+Z3276+as+a+genetic+marker.">Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker.</a> Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).</li><li>Perna, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7.">Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7.</a> Nature. 409, 529-533 (2001).</li><li>Wang, S., Levin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+Vibrio+vulnificus+cells+from+dead+cells+in+real-time+PCR.">Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR.</a> J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).</li><li>Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells.">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).</li><li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+for+live/dead+distinction+in+microbial+ecology.">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).</li><li>Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+PCR+detection+of+viable+Enterobacter+sakazakii+cells+utilizing+propidium+monoazide+or+ethidium+bromide+monoazide.">Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide.</a> J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).</li><li>Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+stx1,+stx2,+and+eae+genes+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+using+SYBR+Green+in+a+real-time+polymerase+chain+reaction.">Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).</li><li>Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157:H7+bacteria+in+drinking+water+and+river+water.">Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışmanın birincil amacı, E bir ORF Z3276, benzersiz bir kullanımını gerektirir E. coli O157: H7, qPCR tahlil için bir tek belirteç olarak. Şu anda, en qPCR deneyleri stx1, stx2 ve EAEA 1,2,5,6 veya uidA 3,4, rfbE ve FLIC genler 8,9 gibi paylaşılan fenotipik genler gibi virülans genleri hedefliyoruz. Bu genler farklı türler ya da yanı sıra suşları 16 mevcut olduğu gibi Bazen, bir tür ya da zorlanma kesinlikle bu tür STX 1ve stx 2 genleri gibi, virülans gen (ler) tarafından tespit edilemez. , Hedef gen için rfbE ve FLIC kullanarak, her iki gen tam tanımlanması 17 için kullanılmak üzere ihtiyaç vardır. Bir biyolojik olarak ORF Z3276 kullanan bu tahlil QPCR hassas ve spesifik deney, (Tablo 1) olarak gösterilmiştir. H7 suşları (n = 3: Bu deney O157 de dahil olmak üzere katı dışlamayan ve seçkin testleri, tabi tutulmuşturSalmonella ve Shigella gibi 67), 100 den fazla olmayan O157 suşları ve diğer patojenik türleri,. Tüm O157: H7 incelenmiştir suşları pozitif tespit edildi, ve çapraz-reaktivite olmayan O157 suşları (Tablo 1) için tespit edildi, ORF Z3276 E. tespiti için özel ve güçlü bir biyolojik olduğunu belirten E. coli O157: H7. Bu çalışmanın amacı, diğer seçici bir DNA ekstraksiyon önce PMA işlenerek ölü hücrelerden canlı hücreleri tespit etmektir. PMA tehlikeye membran ile ölü hücrelere nüfuz DNA&#39;ya bağlanan ve böylece PCR 13 ölü hücrelerin DNA amplifikasyonu inhibe edebilir. Biz, PMA-muamele prosedürü değiştirilmiş ve işlem için bir 96 oyuklu plaka formatı için adapte edilmiştir. Işığa maruz bırakılmanın doğru yoğunluğu en uygun çapraz bağlama etkiyi elde etmek için gereklidir. Daha önce, bu aşama mikrotüpler 13-15 kullanılmıştır. Ancak, ayrı mikrotüpler ışık eski işlemek zordurmaruziyet adım ve bu tüpler iyi çapraz sevme elde etmek için kesinlikle şeffaf değildir. 96 oyuklu bir plaka kullanarak, PMA muamelenin etkinliğini arttırıyor. Bu değişiklikler, çeşitli şekillerde etkileyebilir tahlili: özellikle çok sayıda örnekleri ile daha kolay bir tam ve düzgün bir çapraz-bağlama etkisini elde etmek için yapmak, muamele edilmiş numuneler için mümkün hale getirmek için başka bir plakadan hareket ettirilebilen çok sayıda algılama örneklerin ve onlar tüm süreç için otomasyon potansiyeli ile bu PMA-qPCR tahlil sağlamak. Bu PMA-qPCR deneyinin sınırlama PMA tedavi biraz PCR tahlili maliyetini artırır ve PCR tahlilin duyarlılığı azaltılmış olmasıdır.

PCR E tespiti için yaygın bir tekniktir coli O157: gıda ve çevre örnekleri H7. E. özgü biyolojik göstergeleri coli O157: H7 PCR analizlerinde başarılı algılama için önemli faktörlerden biridir. Genel olarak E: tespiti için PCR analizlerinde kullanılan biyolojik E. coli O157: H7 Shiga toksin (STX 1 ve STX 2) 1,2, uidA 3,4, EAEA 5,6, rfbE 7 ve FLIC genler 8,9 içerir. Bu biyolojik tanımlanması için değişken etkinlik sağlayabilir, ancak biyolojik çoğu E. tespiti için özel bir belirteç olarak kullanılamaz E. coli O157: H7. Hedef genlerin farklılaşma gelen bu yetersizlik E: tanımlanması için daha özel ve güçlü bir biyomarker (ler) için çağrı E. coli O157: H7 10. E gen veya varsayımsal açık okuma çerçevelerinin (ORF&#39;ler) için çok sayıda probları coliO157: H7 11 laboratuvarda DNA genotiplendirme microarrays gelen ve Biyoteknoloji Bilgi Ulusal Merkezi Gen bankasındaki içinde arama yaparak ipuçları dayalı QPCR tahlil için tasarlanmıştır. Bir saçaklı gen 11&#39;dir Z3276 ORF, sekansı QPCR tahlili için seçildi. Daha sonra, deney QPCR Bu gibi primerlerin ve problann konsantrasyonları, hem de tavlama ve uzatma sıcaklıklarda (veriler gösterilmemiştir) gibi PCR parametrelere çok sayıda araştırmalar yoluyla geliştirilmiştir. E.on gibi referans suşları üzerinde teşvik dışlamayan ve münhasırlık testlerden sonra coli O157: QPCR H7, non-O157 ve Shigella suşları, ORF Z3276 E tanımlanması için özel ve güçlü bir genetik işaretleyici olarak tanımlandı E. coli O157: H7. Sonra E. belirlenmesi için bu eşsiz biyogöstergesini kullanarak yeni QPCR yöntemi geliştirmeyi E. coli O157: H7. E. tespiti başka zorluk coli O157: H7 in fo kirlenmişods ve çevre örneklerinde canlı hücrelerin doğru belirlenmesidir. Ölü hücreler ve PCR deneyinde canlılığı ayırt etmek için yetersizlik DNA genişletilmiş varlığı tespiti canlı hücre sayıları fazla değerlendirilmesine sonuçlanan yanlış pozitif okumaları neden olabilir. Sonuç olarak, bu gıda kaynaklı patojenlerin 12 doğru tespiti PCR kullanımını sınırlar. Ölü hücrelerin DNA ayırt etmek için yeni bir yaklaşım son birkaç yıl içinde 13-15 PCR prosedürü ile propidyum monoazide (PMA) tedavisi birleştirerek alınmıştır. PMA ölü hücrelerin içeri ve ışığa maruz kaldığında DNA&#39;nın bölgeye girmesini mümkün olmakla birlikte, bu, canlı hücrelerin DNA ile tepkimeye canlı hücreler içinde gidemez. Bu yüzden, canlı ve ölü hücreler PMA ile muamele edilen karışımlarda, ölü hücrelerin DNA PCR 13 amplifiye olamaz. Bu seçici olarak canlı E. tespit etmek için yeni geliştirilmiş QPCR deneyi ile PMA tedavi kombine E. coli O157: H7 hücreleri. Ayrıca, PMA-qPCR a yaptıkyüksek verimli tespiti için mümkün ssay.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">AB 7900HT Fast Real-time PCR system</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">2 x Universal master mix</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PrepMan Ultra</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Primer Express</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="58" rowspan="2" style="height:58px;width:249px;">Probes</td>
			<td rowspan="2" style="width:164px;">ABI</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">4316033 Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PMA</td>
			<td style="width:164px;">Biodium</td>
			<td align="right" style="width:171px;">40013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="87" rowspan="3" style="height:87px;width:249px;">Puregen cell and tissue kit</td>
			<td rowspan="3" style="width:164px;">Qiagene</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td align="right" height="29" style="height:29px;">158622</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">DU530 spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Beckman</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">NanoDrop Technology</td>
			<td style="width:171px;">&#160;ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">650 w halogen light source</td>
			<td style="width:164px;">Britek</td>
			<td style="width:171px;">H8061S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Otptical Adhesive film</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of live escherichia coli o157:h7 cells by pma-qpcr

Benzersiz bir açık okuma çerçevesi (ORF) Z3276 E için belirli bir genetik işaretleyici olarak tanımlandı E. coli O157: H7. Bir deney, QPCR E: saptanması için geliştirilmiştir coli O157: ORF Z3276 hedefleyerek H7. Bu deneyde ile, E. DNA genomunun bir kaç kopya gibi düşük algılayabilir E. coli O157: H7. Tahlilin duyarlılığı ve spesifisitesi E: çok sayıda, yoğun doğrulama testleri ile doğrulanmıştır coli O157: H7 suşları (n = 369) ve non-O157 suşlar (n = 112). Ayrıca, ölü hücreleri canlı hücrelerin selektif deteksiyonu için yeni geliştirilmiş QPCR protokolüne propidyum monoazide (PMA) prosedürü birleştirdik. PMA ile muamele edilmiş ölü hücrelerden DNA amplifikasyonu neredeyse tamamen PMA ile muamele edilmiş, canlı hücrelerden DNA bir ilgisi amplifikasyon aksine inhibe edilmiştir. Ek olarak, iletişim kuralı örneklerin çok sayıda kolay ve tutarlı bir kullanım için bir 96 oyuklu plaka formatı değiştirilmiş ve adapte edilmiştir. Tonun yöntemi doğru mikrobiyolojik gıda güvenliği ve çevre kaynağının epidemiyolojik izleme üzerinde bir etkisi olması bekleniyor.

E. tespiti coli O157: ORF Z3276 kullanarak qPCR H7 Bu testin en önemli faktörlerden biri QPCR kullanılan Z3276 sonda duyarlılığı ve özgünlüğü olduğunu. Bu E. DNA genomunun bir kaç kopya gibi düşük algılayabilir coli O157: H7 Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi,. Altı büyük olmayan O157 STEC suşlar, O104 de dahil olmak üzere incelenen 120 olmayan O157 suşları, içinde: Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, H4 suşlar, Salmonella, Shigella ve suşlar, herhangi bir çapraz reaktiflik, bulunmuştur. QPCR ile PMA tedavi kombinasyonu Kuluçka E. coli O157: 5 karanlıkta dakika ve 2 dakika boyunca ışığa maruz bırakılması için PMA (50 mM) ile H7 hücreleri PMA işleme koşulları için seçildi. Ayrıca, PMA tedavi prosedürü değiştirilmiş. Çapraz bağlama aşamasında kullanılan çeşitli saydam mikrotüplerde ile karşılaştırıldığında, 96 oyuklu bir plaka için daha verimli olduğu bulunmuşturuygun çapraz bağlama etkisi ve ışığa maruz kalma sırasında numune tüpleri, çok sayıda işleme göre daha uygun ulaşır. QPCR PMA ile muamele edilmiş, canlı ve ölü hücrelerden DNA amplifikasyonu Bu tahlilde QPCR ölü hücrelerden DNA amplifikasyon PMA aracılı inhibisyonunun etkileri, iki seri 10-misli canlı veya ölü hücre dilüsyonları türetilen DNA kullanılarak, Şekil 1 &#39;de gösterildi. Sonuçlar, PMA (kırmızı eğri) ve PMA (mavi eğri) olmadan muamele edilmiş canlı hücrelerden üretilen eğriler doğrusal ve birbirine hemen hemen aynı gibi olduğunu göstermektedir. Hafif bir CT değeri farkları PMA tedavi QPCR içindeki canlı hücre DNA amplifikasyonu üzerinde çok az etkisi olduğunu düşündürmektedir PMA ve PMA (Şekil 1A) olmadan muamele edilmiş canlı hücreler arasında gösterildi. Ama 15 - CT değer farkı (32.000 kat) PMA ile muamele ölü hücreler arası ve PMA, demo olmadan gösterildiPMA tedavi etkili bir ölü hücreleri (Şekil 1 B) elde edilen DNA amplifikasyonu baskıladığını nstrating. QPCR canlı ve ölü hücre karışımlarından canlı hücre tespiti Canlı hücre seyreltilerde (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU) İki takım canlı / ölü hücre karışımları canlı hücreleri algılamak için PMA ile veya PMA olmadan tedavi edildi. QPCR Sonuçlar (Şekil 2A), muamele edilmemiş örneklerin (mavi bar) ile muamele edilmiş canlı hücreler (mor bar) arasında sayı ile ilişkili olarak CT değerleri arasında bir ters paralel ilerleyen bir eğilim göstermiştir. Muamele edilmiş hücreler, canlı işlem görmemiş canlı hücre daha biraz daha yüksek bir CT değeri elde edilmiştir. CT değerleri arasında benzer bir ters aşamalı bir eğilim Şekil 2B&#39;de de PMA (yeşil çubuklar) ile muamele ölü / canlı hücre karışımları içinde canlı hücre gerçek sayısı ile gözlenmiştir. Buna ek olarak, CT değerleri bu düşüş trendi oldu106 ölü hücrelerin varlığına rağmen karışımları içinde canlı hücre sayısı ile saptanmıştır. Bu sonuçlar, ölü hücrelerden DNA amplifikasyon verimli bir şekilde PMA işlenerek bastırıldı ise ölü / canlı hücre karışımlarının CT değerleri, tek başına canlı hücrelerinden DNA temsil ettiğini göstermiştir. Ancak, PMA ile muamele ölü / canlı hücre karışımlarının CT değerleri, dalgalı ve Şekil 2B&#39;de (sarı bar) &#39;de bunların karışımları olarak canlı hücre sayılarının söz konusu başarısız olduğu görülmüştür. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1.jpg" /> Şekil 1. Canlı ve ölü hücre ya da PMA ile QPCR deneyde PMA olmadan işlemden geçirildi. (A) içinde bir seri canlı E. 10-kat sulandırılmış coli O157: H7 hücre seyreltileri (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU), PMA ile veya PMA olmadan muamele edilmiştir.CT değerleri QPCR deneyde üç kopya CT ortalama değerleri temsil eder. (B) q QPCR karşılaştırma deneyinde PMA ve PMA olmadan muamele edilmiş, canlı hücreler ve ölü hücrelerin DNA amplifikasyonu karşılaştırılması. ΔRn yoğunluk değişimi floresan ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2.jpg" /> Şekil 2. . PMA-QPCR hücre kültürlerinin 10-kat seyreltileri (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU) dört grup ile ölü / canlı hücre karışımlarından canlı hücre farklılaşması belirtildiği gibi yapılmıştır. Ikinci hücre seyreltme DNA ekstre önce ya da muamele edilmemiş ise hücre seyreltme (A) ilk kümesi PMA ile muamele edilmiştir.(B) 8 x 10 6 ölü hücreler gösterildiği gibi ölü / canlı hücre karışımları iki takım için hücre dilüsyonları üçüncü ve dördüncü setleri ile karıştırılmıştır. Hücre karışımları kümesi PMA ile muamele edildi ve diğer set DNA ekstre önce PMA olmadan muamele edilmiştir. Her çubuk ± SD üçlü deney ortalama BT değerleri temsil eder. <table><tbody><tr><td> Organizma </td><td> Serotip </td><td> Test edilen suşların No </td></tr><tr><td rowspan="15"> E. coli </td><td> 2006 ıspanak O157: H7 salgını izolatlar </td><td> 186 </td></tr><tr><td> 2006 Taco Bell O157: H7 izolatların </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 2006 Taco John O157: H7 izolatların </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Diğer O157 DMB suşu koleksiyonlar: H7 vakaları </td><td> 112 </td></tr><tr><td> O104: H4 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> O26 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Ø103 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> O111 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> O121 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O45 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Ø145 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> O113 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O91 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø55 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Diğer </td><td> 19 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Zehirlenmeye neden olan mikrop </td><td> Typhi </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Newport </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella dysenteriae </td><td> 6 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella sonnei </td><td> Bilinmeyen </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella flexneri </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Shigella boydii </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Toplam </td><td> 481 </td></tr></tbody></table> Tmümkün 1. E. belirlenmesi için gerçek-zamanlı PCR tahlilinde doğrulama için kullanılan suşlar E. coli O157: H7.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR at JoVE.com

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

H7 benzersiz bir genetik işaretleyici, Z3276 hedefleme: A QPCR tahlil Escherichia coli O157 tespiti için geliştirilmiştir. QPCR canlı hücre algılaması için propidyum monoazide (PMA), tedavi ile kombine edilmiştir. Bu protokol, çok sayıda numune, kolay ve uygun kullanım için bir 96 oyuklu plaka formatı değiştirilmiş ve uyarlanmıştır

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Bir uygulama için Protokoller<em&gt; Escherichia coli</emSentetik Biyoloji&gt; Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Hassas immünohistokimyasal sitozin Modifiye Formlar Algılama

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments