Name: agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana
Uploaded: 2014-01-03T19:45:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Arbejdet er delvist støttet af Wageningen University Fund (WUF), Kina Scholarship Council Program for graduate studerende, og en NWO-VIDI tilskud 12378.

1. Betingelser for plantedyrkning og -test
<ol><li>Vokse og vedligeholde planter i kontrollerede drivhuse eller klimakamre inden for temperaturområdet 18-22 °C og under naturligt lysregime eller med et dag/nat-regime på 16 timer/8 timer. Fjern aksillære grene for at gøre planterne mere håndterbare.</li>
	<li>For kartofler skal in vitro-plantlets opbevares i sterile plastburer, der indeholder Murashige-Skoog (MS) medium (20 g/L saccharose, 5 g/L MS-salte med vitaminer, 8 g/l agar, pH 5,8) under kontrollerede forhold i klimakamre ved 18 °C med et 16 timer/8 timers dag/nat-system i to uger og derefter overføre dem til potter af steriliseret jord i drivhusregulerede rum.</li>
</ol>2. Agroinfiltrering
<ol><li>Plantemateriale: For Nicotiana benthamiana, brug omkring 4-5 uger gamle frø-dyrkede planter. Til kartoffel, brug omkring 4-5 uger gamle transplantationer fra in vitro. Vælg unge, sunde og fuldt udviklede blade til infiltrationer.</li>
	<li>
Agrobakteriekultur:<ol>
<li>Forbered YEB-mediet på forhånd(tabel 1). 50 ml rørene fyldes med 10 ml YEB-medium suppleret med 1 μl acetosyringon (200 mM), 100 μl MES-buffer (2-(N-morpholino)-ethansulfonsyre, 1 M) og de relevante antibiotika. Pipette 20 μl glycerolbestand af de ønskede stammer (tabel 2) (indeholder det pågældende gen) til YEB. Indlede kulturer for alle Agrobacterium stammer i denne analyse på samme tid. Celler inkuberes ved at ryste i 1-2 dage ved 28 °C og 200 omdrejninger i minuttet til en OD600 på ca. 1,0.</li>
		<li>Høst celler ved centrifugering ved 3.000 x g i 10 min. Supernatanten hældes af og genbruges pellet i frisklavet MMA-medium (Tabel 3) til en OD600 på 0,3. Forsigtigt vortex celler til at genbruge dem. Til coinfiltration af to bakteriestammer blandes kulturen i et 1:1-forhold.</li>
		<li>Lad kulturen stå på bænken ved stuetemperatur i 1-6 timer før infiltrationer. I mellemtiden skal du mærke de planter, der skal infiltreres, og datoen for eksperimentet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infiltrationer: Brug en 1 ml nåleløs sprøjte til at infiltrere Agrobacterium suspensioner. Injicerer forsigtigt og langsomt bladpaneler med suspensionerne fra sprøjten (af sundheds- og sikkerhedsmæssige årsager skal øjenbeskyttelse bæres under denne proces). Infiltrere mindst tre planter for hver stamme. Brug tre blade pr plante til at tjene som stativer. Bemærk: Normalt kan 1 ml Agrobacterium suspension s være nok til 3 planter af N. benthamiana. For kartoffel er der brug for mere suspension, fordi bladene af Solanum-arter er vanskeligere at infiltrere. De krævede mængder suspensioner afhænger af Solanum-arten. Undgå krydskontaminering ved at skifte handsker eller sterilisere handsker med ethanol mellem infiltrationer og ved ikke at vande planterne før dagen efter podningen.</li>
	<li>Scoring: Score makroskopiske svar ca. 3 dage efter infiltration, når celledødsfænotypen er klar (Figur 1). Hvis celledødsfænotypen er kvantitativ, skal du anvende de givne kriterier (figur 2). Kort, skalaerne for makroskopisk scoring af celledød afhænger hovedsageligt af cellens dødsprocenter i det infiltrerede område. Procentdele af celledød er afbildet på en skala fra 0% (ingen symptomer) til 100% (sammenflydende celledød). Mellemliggende reaktioner spænder fra svage reaktioner såsom chlorose til stigende niveauer af celledød. Hvis det ønskes, kan den makroskopiske scoring også vurderes kvantitativt ved hjælp af moderne fotobilledbehandlingsudstyr.</li>
</ol>3. PVX Agroinfection
<ol><li>Plantemateriale: For N. benthamiana, brug omkring 2-3 uger gamle frø-dyrkede planter. Til kartoffel, brug omkring 2-3 uger gamle transplantationer fra in vitro. Til store tests skal du bruge lidt ældre (4-5 uger) planter, da disse planter har flere og større blade for at imødekomme et højere antal Agrobacterium-podningspletter. </li>
	<li>
Agrobakterie dyrkning:<ol>
<li>Forbered YEB-mediet på forhånd. Fyld de 10 ml rør med 3 ml YEB suppleret med de relevante antibiotika. Pipette 20 μl glycerolbestand af de ønskede stammer (tabel 2) (indeholder det pågældende gen) til YEB. Indlede kulturer for alle Agrobacterium stammer i denne analyse på samme tid. Celler inkuberes ved at ryste i 1-2 dage ved 28 °C og 200 omdrejninger i minuttet til en OD600 på ca. 1,0.</li>
		<li>Der pipettes ca. 300 μl af hver Agrobacteriumstamme, og de spredes på LB's faste agarmediumplader suppleret med passende antibiotika og inkuber celler ved 28 °C i 1-2 dage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infektioner: Brug en spatel til at samle Agrobacterium kulturen i pladen. Dyp en træ tandstikker i Agrobacterium kultur på spatelen og gennembore bladene til at vaccinere store mængder af bakterier. Pod mindst tre planter for hver stamme. Brug tre blade pr plante til at tjene som stativer. I hvert blad skal du lave flere vaccinationssteder for hver stamme.</li>
	<li>Scoring: Score makroskopiske svar ca. to uger efter vaccination (Figur 3). For skærmbilleder med høj overførselshastighed skal du registrere de kvalitative svar (ja/nej) for hvert vaccinationssted. Beregn derefter procentdelen af websteder, der svarer, og sammenlign dem med kontrolelementer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9/Cf-9-induced+and+Avr4/Cf-4-induced+necrosis.">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li><li>Dangl, J. L., Jones, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE.">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance.">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li><li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Forbigående assays som agroinfiltration og agroinfection er effektive metoder, der er afgørende for moderne molekylær plantepatologiforskning. På trods af visse begrænsninger imødekommer disse metoder efterspørgslen efter effektiv og robust funktionel analyse med høj gennemløb i planter.
Agroinfiltrationssystemet er en meget anvendt funktionel analyse i en række plantearter. Agroinfiltration letter leveringen af flere transgener til den samme celle med samtidig ekspression af interagerende proteiner. Dette er fordelagtigt for at opsummere R-AVR relationer, ved coinfiltrating Agrobacterium stammer, der udtrykker Avr gener med stammer, der udtrykker matchende R gener. Også for kendte R-AVR par, kan sådanne coinfiltrations bruges som positive kontroller. Det er vigtigt at medtage sådanne kontroller, fordi transformationseffektiviteten i nogle plantegenotyper kan være under tærsklen for at opdage svar. Herunder negative kontroller, f.eks. en Agrobacteriumstamme, der indeholder en vektor uden genindsats, er også afgørende for at afgøre, om en bestemt plantegenotype rejser uspecifikke forsvarsresponser på Agrobacterium. Denne funktion forekommer med en vis hyppighed i kartoffelkimplasma, og ikke alle Solanum-arter er velegnede til dette Agrobacterium-baseredeudtrykssystem. Generelt agroinfiltration assay fungerer meget godt i N. benthamiana og de fleste kartoffel genotyper. Ud over effectoromics er der forskellige andre potentielle anvendelser for agroinfiltreringsteknikken, såsom produktion af proteiner fra transgener og proteinlokalisering i planteceller ved konfokal mikroskopi.
PVX agroinfection er et meget følsomt screeningssystem og typisk mere velegnet til screeninger med høj gennemløb. Da Agrobacterium nu kun er lokalt til stede, er uspecifikke reaktioner på denne bakterie nu ikke særlig foruroligende, da PVX-virussen overtager yderligere spredning af transgenet. Planter kan dog være resistente over for PVX eller montere ekstreme resistensresponser (ER), og i så fald er agroinfektmetoden ikke egnet. En anden begrænsning af PVX agroinfektmetoden er indsætningsstørrelsen af det interessante gen. Observerede fænotyper af reaktioner kan variere fra en intens sort nekrose omkring såret til svag nekrose nær podning stedet. I både N. benthamiana og Solanum arter, PVX agroinfection er anerkendt som mere følsomme end agroinfiltration.
Under hensyntagen til, at den genetiske baggrund for de forskellige testede plantegenotyper kan have nogle begrænsninger (se ovenfor), opnår vi generelt lignende konklusioner fra PVX-agroinfekt og agroinfiltrering. Disse resultater er også sammenlignelige som opnået i andre assays, såsom proteininfiltrationer29 og ELISA3. I betragtning af fordelene og begrænsningerne ved begge systemer anbefaler vi at bruge begge metoder til enten at supplere hinanden eller bekræfte uafhængige resultater.

Effektoromik, en høj-throughput funktionel genomik tilgang er for nylig dukket op som et effektivt redskab til at identificere resistens (R) gener i afgrøder og matchende avirulens (Avr) gener af patogener1-4. I modsætning til den mere tidskrævende stabile transformation med R-gener er effectoromics-strategien baseret på forbigående analyse af patogengensekvenser.
Siden genomforskningstiden er genomer af plantepatogener bredt blevet udforsket. For eksempel for oomycetes, som omfatter de mest ødelæggende plantepatogener, er store samlinger af sekvenser blevet genereret og analyseret for gener, der spiller en rolle under interaktionen med planten5-10. En klasse af patogenproteiner repræsenterer effektorer, som manipulerer værtscellestruktur og -funktion enten for at lette infektion (virulensfaktorer) eller for at udløse forsvarsresponser (avirulensfaktorer)11-13. Ekspression af Avr-gener i planteceller, der indeholder R-gener, resulterer normalt i den overfølsomme celledødsrespons (HR)14,15. I planta udtryk for R og Avr gener kan opnås ved hjælp af forbigående ekspression systemer såsom Agrobacterium tumefaciens -baseret forbigående transformation (agroinfiltration)16. Denne forbigående transformation kan også anvendes i kombination med virale ekspressionssystemer (agroinfekt)17,18.
Til agroinfiltrering er det mest anvendte middel A . tumefaciens, et bredt værtsområde patogen af dicotplanter. A. tumefaciens indeholder en tumor-inducerende (Ti) plasmid. Overførsel af DNA (T-DNA) fra en Ti plasmid vil translokere ind i plantecellerne, når bakteriens virulensmaskineri er aktiveret. Dette kan udløses i sårede planteceller, af de frigivne lavmolekylære phenolforbindelser og monosaccharaides i et lidt surt miljø19. Virulensgenet aktiveres efter infiltration af Agrobacterium suspensioner i bladpaneler defineret af større vener. Derefter omdannes planteceller i bladpanelerne og udtrykkes de transgener, der er indeholdt i T-DNA-regionen.
Agroinfekt er baseret på sår-podet Agrobacterium, som formidler translokation af en virus til planteceller. Virussen spredes derefter yderligere til tilstødende plantevæv, i mangel af Agrobacterium. Til agroinfekt kan flere plantevirus bruges. RNA-vira er ideelle vektorer til genekspression, fordi de kan formere sig til meget høje niveauer i inficerede planter. Blandt plante-RNA-vira anvendes Potato Virus X (PVX) i vid udstrækning til effectoromics-skærme. For at lette funktionelle test for et indsat gen blev binære vektorer, der indeholder PVX-genomet flankeret af Blomkålsmosaikvirus 35S-promotoren og nopaline synthase terminatoren, klonet i T-DNA af A. tumefaciens20. Når T-DNA'et er overført til planteceller, transskriberes PVX-genomet i T-DNA'et fra 35S-promotoren. Derefter spredes viruspartikler systemisk i de inficerede planter, hvilket resulterer i ekspressionen af det indsatte gen. Denne metode baseret på både Agrobacterium og PVX kaldes PVX agroinfection.
Her viser vi eksempler på både agroinfiltration og PVX agroinfekt assays. Som vært planter vi bruger kartoffel kimma (Solanum sektion Petota), for hvilken effectoromics tilgange er blevet banebrydende og bevist vellykket3,4. Vi bruger også Nicotiana benthamiana, som er kendt som en model fabrik i Solanaceous planter14,21,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

Agroinfiltration og PVX agroinfction er to effektive forbigående udtryksanalyser til funktionel analyse af kandidatgener i planter. Det mest anvendte middel til agroinfiltrering er Agrobacterium tumefaciens, et patogen af mange dicot plantearter. Dette indebærer, at agroinfiltrering kan anvendes på mange plantearter. Her præsenterer vi vores protokoller og forventede resultater, når vi anvender disse metoder på kartoflen (Solanum tuberosum), dens relaterede vilde knoldbærende Solanum-arter (Solanum-sektionen Petota) og modelplanten Nicotiana benthamiana. Ud over funktionel analyse af enkelte gener, såsom resistens (R) eller avirulens (Avr) gener, er agroinfiltrationsanalysen meget velegnet til at opsummere R-AVR-interaktionerne forbundet med specifikke værtspatogeninteraktioner ved blot at levere R- og Avr-transgener til samme celle. Nogle plantegenotyper kan dog hæve uspecifikke forsvarsresponser på Agrobacterium, som vi observerede for eksempel for flere kartoffelgenotyper. Sammenlignet med agroinfiltration er påvisning af AVR-aktivitet med PVX-agroinfekt mere følsom, mere høj gennemstrømning i funktionelle skærme og mindre følsom over for ikke-specifikke forsvarsresponser på Agrobacterium. Men, uspecifikke forsvar til PVX kan forekomme, og der er en risiko for at gå glip af reaktioner på grund af virus-induceret ekstrem modstand. På trods af sådanne begrænsninger er agroinfiltration og PVX-agroinfekt efter vores erfaring både egnede og komplementære assays, der kan bruges samtidigt til at bekræfte hinandens resultater.

Figur 1 viser et repræsentativt eksperiment med agroinfiltrering med 7 forskellige effektorer (E1-E7) i kartoffel og N. benthamiana. Celledød vises i de infiltrerede bladpaneler ca. 3 dage efter infiltration. Omfanget af celledødsfænotypen skal sammenlignes med kontrollerne. En blanding af Agrobacteriumstammen AGL1(pVirG)23 indeholdende pBINplus-R3a og pK7WG2-AVR3a blev anvendt som positiv kontrol24,25, mens AGL1(pVirG) blev anvendt som negativ kontrol. Figur 1A og 1B viser gode eksempler på agroinfiltration i kartoffelgenotypen MaR8 (Mastenbroek R8)26 og N. benthamiana, som er meget modtagelige for agroinfiltrering. Der er sammenfaldende celledød i bladpanelet coinfiltrated med positiv kontrol, mens ingen celledød svar opstår med negativ kontrol eller pBINplus-R3a. I MaR8 fremkalder to effektorer AVR3a (E2) og AVR4 (E3) en celledød, mens de andre effektorer (E1 og E4-E7) ikke gør det. I N. benthamiana fremkalder ingen af de testede effektorer en celledødsrespons. Figur 1C og 1D viser eksempler på agroinfiltration i den vilde kartoffel Solanum berthaultii 483-1 og Solanum rechei 210-5, som ikke er godt modtagelige for agroinfiltrationsteknikken. I S. berthaultii 483-1 viser bladvævet en uspecifik nekrose til negative kontroller såvel som til alle testede effektorer. I S. rechei 210-5 viser infiltrerede bladpaneler meget svag celledødsrespons på positiv kontrol.
Figur 2 viser en række scoringsskalaer , der kan bruges til at kvantificere reaktionen på agroinfiltreret Agrobacterium. Procentdele af celledød afbildes på en skala fra 0-100%. Observerede fænotyper spænder fra makrovidenskabeligt ikke synlige symptomer (0%), gennem en række mellemliggende reaktioner, der viser chlorose og stigende niveauer af celledød, op til sammenflydende celledød (100%).
Figur 3 viser et repræsentativt eksperiment efter PVX-agroinfekt i kartoffel. Normalt kan ekspanderende celledød findes på de steder, omkring to uger efter tand-pick podning. Som vist i begge figurpaneler er ekspanderende celledød til stede på de steder, der blev tandplukket podet med pGR106-CRN2 (positiv kontrol ved hjælp af effector crinkler Crn2), som er et generelt celledødsfremkaldende gen fra P. angreb27. Bortset fra mindre reaktion på sår, ingen ekspanderende celledød er noteret på de steder, der var tand-pick podet med pGR106-tomme (negativ kontrol). I figur 3A, der repræsenterer kartoffelgentypen MaR3 (Mastenbroek R3), fremkaldte to pGR106-effektorer (E1 og E2) ikke celledød. I figur 3Bpræsenteres et positivt resultat af effektorscreening i det vilde Solanum huancabambense 354-1; celledødsrespons blev observeret på to pGR106-effektorer (E1-E3, der repræsenterer elicitins)28.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> Figur 1. Eksempler på agroinfiltration i kartoffel og N. benthamiana. Planter, herunder (A) en kartoffel genotype MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana, (C) Solanum berthaultii 483-1 og (D) Solanum rechei 210-5 blev infiltreret med en blanding af Agrobacteriumstammen AGL1(pVirG) 23 indeholdende pBINplus-R3a og pK7WG2-AVR3a (positiv kontrol), AGL1(pvirG) (negativ kontrol), pBINplus-R3a og syv effektorer (E1-E7). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> Figur 2. Kvantificering af agroinfiltreringsresponser. Fotografiet viser repræsentative scoring skalaer for celledød, der spænder fra 0% (ingen symptomer) til 100% (sammenflydende celledød). Mellemliggende reaktioner spænder fra svage reaktioner såsom chlorose til stigende niveauer af celledød. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> Figur 3. Eksempler på PVX agroinfection i kartoffel. Kartoffelgenotype MaR3 (Mastenbroek R3) (A) og Solanum huancabambense 354-1 (B) tandplukket podet med pGR106-CRN2 (positiv kontrol), pGR106-tom (negativ kontrol) og pGR106-E1-2 (effektorer) eller pGR106-E1-E3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a>.
Tabel 1. YEB-medie
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>destilleret H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>saccharose</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>oksekød ekstrakt</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>bakteriologisk pepton</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>gærekstrakt</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Vektorer og stammer, der anvendes til agroinfiltration og PVX agroinfekt. Flere binære vektorer kan bruges. Vektorer på listen nedenfor giver høj ekspression af kandidatgener og har fungeret godt i vores hænder. Vi foretrækker at bruge Agrobacterium stamme GV3101(pMP90)29 i N. benthamiana og finde AGL130 indeholder hjælperen plasmid pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 mere egnet i kartoffel31. Yderligere stammer er blevet analyseret i andre grupper på forskellige modelplanter, herunder N. benthamiana, men ikke i kartoffel32.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: gateway version36
Tabel 3 . MMA-medie. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
Juster pH-vinduet til 5,6.

Watch this Scientific Journal Video about Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration og PVX agroinfction er rutinemæssige funktionelle assays for forbigående ektopisk udtryk for gener i planter. Disse metoder er effektive assays i effectoromics strategier (hurtig resistens og avirulens gen opdagelse) og afgørende for moderne forskning i molekylær plantepatologi. De imødekommer efterspørgslen efter robust funktionsanalyse med høj gennemløb i planter.

Agroinfiltration og PVX Agroinfection i kartoffel og Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Research

JoVE Journal

Biology

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration af planter til højt niveau transient ekspression af rekombinante proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimering og udnyttelse af<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medieret Forbigående Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Forsamlingen og anvendelse af &#39;Shear Rings &quot;: A Novel Endothelial Model for Orbital, ensrettet og periodisk Fluid Flow og Shear stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase komplementering Imaging Assay i Nicotiana benthamiana blade for forbigående bestemmelse af Protein-protein interaktion Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Plante-mikrobe interaktion: Transcriptional svar af Bacillus Mycoides kartoffel Root ekssudater

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Produktion af IgG Fusion Proteiner Transiently Udtrykt i Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Quantifying Cell Death Initiation Through Continuous Imaging

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

A Streamlined Approach to Studying Cell Death Initiation in Hypersensitive Response (Video) | JoVE

Undersøgelse af celledødsinitiering ved hjælp af et digitalt mikroskop

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

En eksperimentel undersøgelse af Colorado kartoffelbille dvaletilstand under naturlige forhold

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

In Planta Transient Transformation of Cacao Plants Using Agrobacterium tumefaciens

Vacuum-Forced Agroinfiltration for In planta Transformation of Recalcitrant Plants: Cacao as a Case Study

Author Spotlight: Tissue Culture-Free Agrobacterium-Mediated Transformation in Large Woody Plants

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation ...