Name: agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana
Uploaded: 2014-01-03T19:45:00
Duration: 7 min 33 s
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이 작품은 와게닝겐 대학 기금(WUF), 대학원생을 위한 중국 장학위원회 프로그램, NWO-VIDI 교부금 12378에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1. 식물 재배 및 테스트 조건
<ol><li>18-22°C의 온도 범위 내에서 또는 자연 광 정권 하에서 또는 16 시간/ 8 시간 낮/밤 정권으로 제어 온실 또는 기후 챔버에서 식물을 성장하고 유지합니다. 식물을 보다 관리하기 위해 축실 가지를 제거하십시오.</li>
	<li>감자의 경우, 무라시게-스쿠그(MS) 매체(20g/L 자당, 비타민 5g/L/L MS 염, 8g/L agar, pH 5.8)를 함유한 멸균 플라스틱 항아리에 체외질을 유지하여 18°C의 기후챔버에서 16시간/8시간/1박/야간 으로 16시간/8시간 동안 온실로 이송하여 오염된 토양으로 이송한다.</li>
</ol>2. 농약침
<ol><li>식물 재료: 니코티아나 벤타미안의경우, 약 4-5주 된 종자 재배 식물을 사용하십시오. 감자의 경우 체외에서 4-5주 된 이식을 사용하십시오. 침투를 위해 젊고 건강하며 완전히 발달된 잎을 선택하십시오.</li>
	<li>
아그로바테리움 문화:<ol>
<li>YEB 배지를 미리준비합니다(표 1). 50ml 튜브를 1μl 아세토시링게오네(200mMM), 100 μl MES 버퍼(2-(N-morpholino)-에탄 설포닉산, 1M) 및 적절한 항생제로 보충한 10ml YEB 배지로 튜브를 채웁니다. 파이펫 20 μl 글리세롤 스톡은 원하는 균주의(표 2)(관심 유전자 함유)을 YEB로 한다. 동시에이 분석에서 모든 Agrobacterium 균주에 대한 문화를 시작합니다. 세포를 28°C에서 1-2일 동안 흔들어 서 200rpm에서 약 1.0의 OD600으로 배양한다.</li>
		<li>원심분리에 의해 10분 동안 3,000 x g에서 세포를 수확하십시오. 상체를 부어 신선하게 만든 MMA 배지(표 3)에서 펠릿을0.3의OD600으로 재연한다. 부드럽게 소용돌이 세포를 다시 중단합니다. 두 개의 세균성 균주의 동전 여과의 경우 배양을 1:1 비율로 혼합하십시오.</li>
		<li>침투하기 전에 1-6 시간 동안 실온에서 벤치에 문화를 둡니다. 그 동안, 식물에 침투 할 및 실험 날짜를 레이블.</li>
	</ol>
</li>
	<li>침투: 1ml 바늘없는 주사기를 사용하여 Agrobacterium 현탁액에 침투하십시오. 주사기의 현탁액이 있는 잎 패널을 주의 깊게 천천히 주입합니다(건강 및 안전상의 이유로 이 과정에서 눈 보호가 착용되어야 합니다). 각 변형에 대해 적어도 3 개의 식물에 침투합니다. 식물 당 3 개의 잎을 사용하여 삼중 으로 사용하십시오. 참고 : 일반적으로, Agrobacterium 서스펜션 의 1 ml는 N. 벤타미안의3 식물에 충분 할 수있다. 감자의 경우 Solanum 종의 잎이 침투하기가 더 어렵기 때문에 더 많은 현탁액이 필요합니다. 서스펜션의 필요한 볼륨은 솔라눔 종에 따라 달라집니다. 장갑을 교체하거나 침투 사이에 에탄올로 장갑을 살균하고 접종 다음날까지 식물에 물을 주지 않음으로써 교차 오염을 피하십시오.</li>
	<li>점수: 세포사멸 표현형이 명확할 때 침투 후 약 3일 동안 거시적 반응점수(도1). 세포사멸 표현형이 정량적인 경우 주어진기준(도 2)을사용한다. 간략하게, 세포 죽음의 거시적인 점수에 대한 비늘은 주로 침투 된 지역의 세포 사멸 비율에 달려 있습니다. 세포 사멸의 백분율은 0%(증상 없음)에서 100%(컨실런사)까지 의 척도로 묘사됩니다. 중간 반응은 클로로시스와 같은 약한 반응에서 세포 사멸의 증가 수준에 이르기까지 다양합니다. 원하는 경우 거시적 점수는 현대적인 사진 이미징 장비를 사용하여 정량적으로 평가될 수도 있습니다.</li>
</ol>3. PVX 농병 소독
<ol><li>식물 재료: N. 벤타미안의경우, 약 2-3 주 된 종자 재배 식물을 사용하십시오. 감자의 경우 체외에서약 2-3 주 된 이식을 사용하십시오. 대규모 테스트의 경우, 약간 오래 된 (4-5 주) 식물을 사용, 이 식물은 Agrobacterium 접종 반점의 높은 숫자를 수용 하기 위해 점점 더 큰 잎으로.</li>
	<li>
농균 배양:<ol>
<li>YEB 배지를 미리 준비하십시오. 10ml 튜브를 적절한 항생제로 보충한 3ml YEB로 채웁니다. 파이펫 20 μl 글리세롤 스톡은 원하는 균주의(표 2)(관심 유전자 함유)을 YEB로 한다. 동시에이 분석에서 모든 Agrobacterium 균주에 대한 문화를 시작합니다. 세포를 28°C에서 1-2일 동안 흔들어 서 200rpm에서 약 1.0의 OD600으로 배양한다.</li>
		<li>각 농균균균의 약 300 μl을 1-2일 동안 적절한 항생제로 보충하고 세포를 28°C로 배양하여 LB 고체 천기 중플레이트에 퍼뜨려 줍니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>감염: 주걱을 사용하여 접시에 있는 아그로박테리움 문화를 수집하십시오. 주걱에 Agrobacterium 문화에 나무 이쑤시개를 찍어 많은 양의 박테리아를 접종하기 위해 잎을 관통하십시오. 각 균주에 대해 적어도 3개의 식물을 접종합니다. 식물 당 3 개의 잎을 사용하여 삼중 으로 사용하십시오. 각 잎에서 각 변형에 대해 여러 예방 접종 부위를 만듭니다.</li>
	<li>점수: 접종 후 약 2주 동안 매크로 응답점수(그림 3). 처리량이 높은 화면의 경우 각 접종 지점에 대한 정성적 응답(예/아니요)을 기록합니다. 그런 다음 응답 사이트의 백분율을 계산하고 컨트롤과 비교합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9/Cf-9-induced+and+Avr4/Cf-4-induced+necrosis.">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li><li>Dangl, J. L., Jones, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE.">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance.">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li><li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

농약과 농병과 같은 일시적인 연구는 현대 분자 식물 병리학 연구에 필수적인 효율적인 방법입니다. 몇 가지 제한에도 불구하고 이러한 방법은 플랜트에서 효율적이고 견고한 고처리량 기능 분석에 대한 수요를 충족시다.
농구침 시스템은 식물 종의 범위에서 널리 사용되는 기능 분석이다. 농약은 상호 작용하는 단백질의 동시 발현을 가진 몇몇 전간 유전자의 전달을 동일 세포로 전달하는 것을 용이하게 합니다. 이것은 일치하는 R 유전자를 표현하는 긴장으로 Avr 유전자를 표현하는 Agrobacterium 균주를 동전으로 하여 R-AVR 관계를 재구성하는 데 유리합니다. 또한 알려진 R-AVR 쌍의 경우 이러한 코인 여과를 긍정적 인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 일부 식물 유전자형에서는 변환 효율이 응답을 감지하기 위해 임계값 이하로 있을 수 있기 때문에 이러한 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 부정적인 대조를 포함하되, 예를 들어 유전자 삽입 없이 벡터를 함유하는 Agrobacterium 균주는 특정 식물 유전자형이 Agrobacterium에대한 비특이적 방어 반응을 제기하는지 여부를 결정하는 데 필수적이다. 이 기능은 감자 세균의 특정 주파수에서 발생하며 모든 솔라넘 종이 이 Agrobacterium기반 발현 시스템에 적합하지는 않습니다. 일반적으로, 농약 침투 분석은 N. 벤타미안과 대부분의 감자 유전자형에서 아주 잘 작동합니다. 이펙타로믹스 외에도, 공초점 현미경에 의한 식물 세포에서 트랜스게놈및 단백질 국소화에서 단백질의 생산과 같은 농구침 기술에 대한 다양한 잠재적 응용 이있다.
PVX 농병은 고감도 스크리닝 시스템이며 일반적으로 고처리량 스크리닝에 더 적합합니다. Agrobacterium은 지금 단지 로컬 존재 이기 때문에, 이 박테리아에 비특이적인 반응은 지금 아주 방해하지 않습니다, PVX 바이러스는 질균의 추가 퍼짐을 인수하기 때문에. 그러나, 식물은 PVX에 내성이 있거나, 극단적인 저항(ER) 반응을 탑재할 수 있으며, 이 경우 농아소독 방법이 적합하지 않다. PVX 농사감염 방법의 또 다른 제한은 관심 있는 유전자의 삽입 크기이다. 관찰된 표현형의 반응은 상처를 둘러싼 강렬한 흑괴사에서 접종 지점 근처의 희미한 괴사에 이르기까지 다양할 수 있다. N. 벤타미나와 솔라눔 종 모두에서 PVX 농소독은 농구침보다 더 민감하다는 것을 인식합니다.
다양한 테스트 된 식물 유전자형의 유전 적 배경이 몇 가지 제한이있을 수 있다는 점을 고려하여 (위 참조), 우리는 일반적으로 PVX 농가 감염 및 농생물 침투에 의해 유사한 결론을 얻을. 이러한 결과는 또한 단백질침투(29) 및 ELISA3과같은 다른 애사에서 얻은 것과 비교할 수 있다. 두 시스템의 장점과 한계를 고려하여 두 방법을 모두 사용하여 서로를 보완하거나 독립적인 결과를 확인하는 것이 좋습니다.

이펙토로믹스, 고처리량 기능유전체학 접근법은 최근 작물 식물에서내성(R)유전자를 식별하고병원균의유전자(Avr)유전자를 식별하는 강력한 도구로 부상하고 있다. R 유전자를 가진 더 많은 시간 소모적인 안정한 변환과는 대조적으로, 이펙소학 전략은 병원체 유전자 서열의 일시적인 분석에 근거를 두고 있습니다.
유전체학 시대 부터 식물 병원균의 게놈이 널리 탐구되었습니다. 예를 들어 가장 파괴적인 식물 병원균을 포함하는 oomycetes를 위해, 식물5-10과의상호 작용 도중 역할을 하는 유전자를 위해 서열의 큰 집합이 생성되고 분석되었습니다. 병원체 단백질의 한 클래스는 감염 (독성 요인)을 용이하게하거나 방어 반응 (비보렌스 인자)11-13을트리거하기 위해 숙주 세포 구조와 기능을 조작하는 이펙터를 나타낸다. R 유전자를 포함하는 식물 세포에서 Avr 유전자의 발현은 일반적으로 과민성 세포 사멸 반응 (HR)14,15의결과를 낳는다. R 및 Avr 유전자의 질문 발현에서 아그로박테리움 투메파시엔과같은 일시적인 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다- 기반과도 변환(agroinfiltration)16. 이러한 일시적인 변환은 또한 바이러스 발현 시스템(agroinfection)17,18과함께 적용될 수 있다.
농구침의 경우, 가장 일반적으로 사용되는 제제는 디코 식물의 광범위한 숙주 범위 병원균인 A. tumefaciens입니다. A . tumefaciens는 종양 유도 (Ti) 플라스미드를 포함합니다. 티 플라스미드로부터 의 전DNA(T-DNA)는 박테리아의 독성 기계가 활성화된 후 식물 세포로 전이된다. 이는 상처입은 식물 세포에서 발동될 수 있으며, 약간 산성 환경에서 방출된 저분자-중량 페놀 화합물 및 단색차르에 의해19일. 독성 유전자는 주요 정맥에 의해 정의된 잎 패널로 Agrobacterium 현탁액의 침투 후에 활성화됩니다. 그런 다음 잎 패널내의 식물 세포가 T-DNA 영역에 포함된 트랜스진을 변형시키고 발현하게 됩니다.
농병은 세포를 심기 위하여 바이러스의 전좌를 중개하는 상처 접종한 Agrobacterium를기반으로 합니다. 바이러스는 그 때 Agrobacterium의부재에, 인접 한 식물 조직에 더 확산. 농가 감염의 경우 여러 식물 바이러스를 사용할 수 있습니다. RNA 바이러스는 감염된 식물에서 매우 높은 수준으로 증식할 수 있기 때문에 유전자 발현에 이상적인 벡터입니다. 식물 RNA 바이러스 중, 감자 바이러스 X (PVX)는 이펙소로믹스 스크린에 널리 사용된다. 삽입된 유전자에 대한 기능성 검사를 용이하게 하기 위해 콜리플라워 모자이크 바이러스(35S 프로모터)와 노팔린 신타제 터미네이터에 의해 측면에 있는 PVX 게놈을 포함하는 이진 벡터는 A.tumefaciens20의T-DNA로 복제되었다. T-DNA가 식물 세포로 옮겨진 후, T-DNA에 포함된 PVX 게놈은 35S 프로모터로부터 전사된다. 그런 다음 바이러스 입자가 감염된 식물에서 체계적으로 퍼지고 삽입된 유전자의 발현을 초래합니다. 이 방법은 아그로박테리움과 PVX를 기반으로 PVX 농사독이라고 합니다.
여기서 우리는 농아침투와 PVX 농소소 소독 소사 모두에 대한 예를 보여줍니다. 호스트 식물로서 우리는 감자 세균(솔라눔 섹션 Petota)을사용하며, 이펙토로믹스 접근법이 개척되어3,4의성공을 입증했습니다. 우리는 또한14,21,22의 솔라나체 식물의 모델 공장으로 유명한 니코티아나 벤타미안을사용합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

농약침및 PVX 농병소는 식물에 있는 후보 유전자의 기능적 분석을 위한 2개의 능률적인 일시적인 발현 분석이다. 농구침을 위해 가장 일반적으로 사용되는 에이전트는 많은 디코트 식물 종의 병원체인 아그로박테리움 tumefaciens입니다. 이것은 농약 침전이 많은 식물 종에 적용될 수 있다는 것을 의미합니다. 여기서, 우리는 감자(솔라눔 tuberosum),관련 야생 결핵 베어링 솔라눔 종(솔라눔 섹션 Petota)과모델 식물 니코티아나 벤타미안에이러한 방법을 적용 할 때 우리의 프로토콜과 예상 결과를 제시한다. 저항성(R)또는 avirulence(Avr) 유전자와 같은단일 유전자의 기능적 분석 외에도, 농약침 분석은 단순히 R 및 Avr 전진을 동일한 세포로 전달함으로써 특정 숙주 병원체 상호 작용과 관련된 R-AVR 상호 작용을 재구성하는 데 매우 적합합니다. 그러나, 몇몇 식물 유전형은 우리가 몇몇 감자 유전자형에 대해 예를 들었던 바와 같이, Agrobacterium에비특이적인 방어 반응을 올릴 수 있습니다. 농약침과 비교하여 PVX 농약으로 AVR 활동을 감지하는 것은 기능성 스크린에서 더 민감하고, 더 높은 처리량이며, Agrobacterium에대한 비특이적 방어 응답에 덜 민감하다. 그러나 PVX에 대한 비특이적 방어가 발생할 수 있으며 바이러스유발 극단적인 저항으로 인해 응답을 놓칠 위험이 있습니다. 이러한 한계에도 불구하고, 우리의 경험에서, 농침과 PVX 농병은 서로의 결과를 확인하기 위해 동시에 사용할 수있는 적합하고 보완적인 분석입니다.

도 1은 감자 및 N. 벤타미안에서 7가지 이펙터(E1-E7)를 가진 농약침투의 대표적인 실험을 나타낸다. 세포 사멸은 침투 후 약 3 일 후에 침투된 잎 패널에 나타납니다. 세포 사멸 표현형의 범위는 대조군과 비교될 필요가 있다. PBINplus-R3a 및 pK7WG2-AVR3a를 함유한 아그로박테리움 균주 AGL1(pVirG)23의 혼합물은 양성 대조군으로사용되었고, AGL1(pVirG)은 음의 대조군으로 사용되었다. 도 1A 및 1B는 감자 유전자형 MaR8(Mastenbroek R8)26 및 N. 벤타미안나에서농약침의 좋은 예를 보여주며, 이는 농가 침투에 매우 적합합니다. 양극 대조군으로 혼입된 잎 패널에 컨실루션 세포사멸이 있으며, 음의 대조군 또는 pBINplus-R3a로 세포 사멸 반응이 발생하지 않습니다. MaR8에서, 2개의 이펙터 AVR3a(E2) 및 AVR4(E3)는 세포 사멸을 유도하고, 다른 이펙터(E1 및 E4-E7)는 그렇지 않습니다. 도 1C 및 1D는 야생 감자 솔라눔 베르타울리 483-1및 솔라눔 rechei 210-5에서 농아침투의 예를 보여 주며, 이는 농아침투 기술에 적합하지 않다. S. berthaultii 483-1에서, 잎 조직은 모든 시험된 이펙터뿐만 아니라 부정적인 통제에 비특이적 괴사를 보여줍니다. S. rechei 210-5에서, 침투된 잎 패널은 긍정적인 통제에 매우 약한 세포 죽음 반응을 보여줍니다.
도 2는 농약침에 대한 반응을 정량화하는 데 사용할 수 있는 다양한 채점 스케일을 나타낸다. 세포 사멸의 백분율은 0-100%의 척도로 묘사됩니다. 관찰된 표현형은 거시적으로 눈에 보이지 않는 증상(0%)부터 클로로시스를 표시하고 세포 사멸 수준을 증가시키는 중간 반응의 범위를 통해 컨서블세포 사멸(100%)까지 다양합니다.
도 3은 감자에서 PVX 농소염 후 대표적인 실험을 나타낸다. 일반적으로, 확장 세포 죽음은 치아 선택 접종 후에 대략 2 주 사이트에서 찾아낼 수 있습니다. 두 그림 패널에 도시된 바와 같이, 세포 사멸확대는 PGR106-CRN2(이펙터 크링클러 Crn2를 이용한 양성 대조군)로 접종된 치아 선택 부위에 존재하며, 이는 P. infestans27로부터유전자를 유도하는 일반적인 세포 사이다. 상처에 대한 사소한 반응 외에도 pGR106-empty (부정적인 대조군)로 접종 된 치아 선택 부위에서 확장 세포 사망이 지적되지 않습니다. 도 3A에서감자 유전자형 MaR3(Mastenbroek R3)를 나타내는 2개의 pGR106-이펙터(E1 및 E2)는 세포 사멸을 유도하지 않았다. 도 3B에서,야생 솔라눔 huancabambense 354-1에서 이펙터 스크리닝의 긍정적인 결과가 제시된다; 세포사멸 반응은 2개의 pGR106-이펙터(E1-E3, 유도를나타내는)(28)로관찰되었다.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> 그림 1. 감자와 N. 벤타미안의 농약 침투의 예. 식물 포함(A)감자 유전자형 MaR8 (마스텐 브룩 R8),(B) N. 벤타미안,(C) 솔라눔 베르타울리 483-1 및(D) 솔라눔 rechei 210-5에 침투했다 PBINplus-R3a 및 pK7WG2-AVR3a(양성 제어), AGL1(pvirG) (음의 제어), pBINplus-R3a를 함유한 아그로박테리움 균주 AGL1(pVirG) 23의 혼합물, 및 7개의 이펙터(E1-E7). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> 그림 2. 농약 침전 반응의 정량화. 사진은 세포 사멸을 위한 대표적인 채점 척도를 보여줍니다, 0%에서 100% (confluent 세포 죽음). 중간 반응은 클로로시스와 같은 약한 반응에서 세포 사멸의 증가 수준에 이르기까지 다양합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> 그림 3. 감자에서 PVX 농가소의 예. 감자 유전자형 MaR3 (마스텐브룩 R3)(A)및 솔라눔 huancabambense 354-1(B)치아 선택 pGR106-CRN2 (양성 제어), pGR106-빈 (네거티브 컨트롤) 및 pGR106-E1-2 (효과) 또는 pGR106-E1-2 (효과) 또는 pGR106-E1-2 (효과) 또는 pGR106-E1-2(효과제), 또는 pGR106-E1-2(효과) 또는 pGR106-EGR1-EGR106-EGR1-EGR106-EGR1-EGR106 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1. YEB 매체
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>증류H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>자당</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>쇠고기 추출물</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>세균성 펩톤</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>효모 추출물</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2. 농약 과 PVX 농업 소독에 사용되는 벡터 및 균주. 여러 이진 벡터를 사용할 수 있습니다. 아래 목록에 있는 벡터는 후보 유전자의 높은 발현을 허용하고 우리의 손에 잘 일했습니다. 우리는 N. 벤타미안에서 Agrobacterium 균주 GV3101 (pMP90)29를 사용하는 것을 선호하고 조퍼 플라스미드 pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 감자31에더 적합한 헬머 플라스미드 pVirG를 포함하는 AGL130을 찾을 수 있습니다. 추가 균주는 N. 벤타미안을 포함하여 각종 모형 식물에 그밖 단에서 분석되었습니다 그러나 감자(32)에서는아닙니다.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: 게이트웨이 버전36
표 3. MMA 매체. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
pH를 5.6으로 조정합니다.

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Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

농약침과 PVX 농병은 식물에 있는 유전자의 일시적인 자궁 발현을 위한 일상적인 기능적인 분석입니다. 이 방법은 효과적인 전략 (급속한 저항 및 비열유전자 발견)에 있는 능률적인 연구및 분자 식물 병리학에 있는 현대 연구에 결정적입니다. 그들은 공장에서 강력한 고처리량 기능 분석에 대한 수요를 충족합니다.

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

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Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

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최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

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